中規模のショウジョウバエプロテオーム実験のための胚抽出物

サマリー

このプロトコールの目標は、中程度の規模（0.5〜1g）でショウジョウバエ胚を採取し、アフィニティー精製 - 質量分析法（AP-MS）のような下流のプロテオーム用途に使用できるタンパク質抽出物を調製するための、 ）。

要約

タンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）の分析は、細胞シグナル伝達、生物発達、および疾患などの生物学的プロセスおよびメカニズムを研究するために欠かせないアプローチとなっている。相互作用ネットワークの最も自然で不偏なビューを得るために、生体内材料を用いて PPI情報を得ることがしばしば望ましい。ショウジョウバエDrosophila melanogasterは、 インビボで PPIを研究する優れたプラットフォームであり、生化学実験用の材料を単離するための直接的なアプローチに役立ちます。特に、ミバエの胚は、この発達段階で動物を集めるのが容易であり、タンパク質の大部分が胚発生において発現され、したがってほとんどのPPIを明らかにする関連する環境を提供するため、PPIを研究するのに便利なタイプの組織である。ここでは、 ショウジョウバエの胚を中規模（0.5〜1g）で採取するためのプロトコールを提示します。これは、アフィニティー精製 - 質量分析法（AP-MS）によるPPIの分析を含む、プロテオーム用途に適している。どの実験室でも簡単かつ安価に設置できる胚収集用の1Lおよび5Lケージの設計について説明します。我々は、AP-MSのような下流のアプリケーションで直接使用することができる溶解物を生成するための胚収集およびタンパク質抽出のための一般的なプロトコルも提供する。我々の目標は、すべての研究者がインビボで PPIの分析を実施するためのアクセス可能な手段を提供することである。

概要

遺伝学的スクリーニング、そして最近では、ゲノムアプローチが生物学的機能の研究に革命をもたらしている。しかしながら、重要な細胞情報は、タンパク質および相互作用するパートナーの集合体にコードされている。伝統的な遺伝子改変スクリーニングは、律速経路成分を同定し、間接的な相互作用を回復することができるが、プロテオームアプローチの強さは、目的のタンパク質の完全な即時相互作用ネットワークを同定する能力にある。したがって、プロテオミクスは生物学的システムを研究する貴重な直交方法であり、ゲノミクス、トランスクリプトミクス、伝統的な遺伝子スクリーニングを補完するものです。 Affinity purification-mass spectrometry（AP-MS）は、細胞および組織^1,2の固有環境におけるタンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）を研究する強力なアプローチであることが証明されています。この方法は、特定の開発における直接的または間接的な相互作用の同定を可能にする様々な発生経路における複数の新規PPIを同定するために首尾よく使用されている（参考文献^1で概説されている）。 PPI研究の明白な成功にもかかわらず、それらの大部分は、目的の「餌」タンパク質が過剰発現された培養細胞で実施されている。細胞培養においてPPIを研究することには2つの問題がある：第1に、特定の細胞株は、特定のタンパク質の発現の欠如のために完全な相補性を提供しない可能性がある。第二に、このような分析に通常用いられる高い過剰発現は、タンパク質の誤った折り畳みまたは誤った陽性の相互作用の同定のような人工物につながる可能性がある。

インビボで PPI を分析することによって、これらの制限の両方を克服することができる。そのような実験における限定的な工程は、タンパク質複合体を精製するための出発物質の利用可能性である。 ショウジョウバエmelanogasterは、機能解析のモデルとして長く使用されてきた最近、インビボで PPIを研究するための優れたシステムであることも示されています。 ショウジョウバエの胚発生は、胚を大量に容易に採取することができ、また胚発生の過程で大部分の遺伝子（> 88％）が発現され、関連性の高いin vivo環境を提供するためPPIを研究するのに特に魅力的な組織型であるPPIs ³ 。

伝統的に、ハエの生化学的研究は、機能的転写ライセートを精製するために必要なものなど、非常に大規模な胚コレクション（100〜150g）を利用している4,5。これまでのショウジョウバエの AP-MS研究では、タンデムアフィニティ精製（TAP）などの2ステップ精製手法に依存し、各ステップ⁶で材料が喪失したため、大量の胚が必要でした（5~10g）。大物高価な（商業的に購入された場合）および維持管理に時間がかかることがあり、7,8,9を清潔にすることができる、大きな集団ケージに胚コレクションを設置する必要があった。

シングルステップ親和性精製アプローチの開発における最近の進歩、ならびに質量分析計の高感度化は、出発物質の必要量を一桁減少させた。ストレプトアビジン結合ペプチド（SBP）または緑色蛍光タンパク質（GFP）などのタグを使用し、1g未満の胚から開始することにより、餌タンパク質および相互作用する成分の量を、質量分析^10,11 。

ここに提示された議定書の目標は、研究者が過度に私はインビボでのPPIの生化学分析に対する認識された障壁となった。そのためには、 ショウジョウバエの胚を中程度（0.5〜1g）で採取するための簡単で安価な手順を提供し、続いてAP-MSまたは他のアプローチによる後の分析に適した全細胞タンパク質抽出物の一段階調製を行う。私たちの方法は、どの実験室でも簡単に作成できるカスタムメイドの1Lまたは5L集団ケージの使用に依存しています。さらに、ここに提示された抽出条件は、培養細胞およびインビボの両方において、10,12,13,14,15,16,17のいくつかの研究で検証されている。

プロトコル

1. 5Lフライケージの調製（15cmプレートに適合する）

1. 必要な材料を入手してください：ふた付きの5クォート（4.7リットル）の容器、 図1Aのナイロンメッシュ、およびカミソリの刃。
2. 直径12cmの円に印を付け、カミソリの刃を使って容器の底に穴をあけます（ 図1B ）。蓋に直径15 cmの穴を切ってください（ 図1C ）。
3. 25×25cmの正方形にナイロンメッシュをカットします。
4. 容器の上端にメッシュを置き、ふたで押し下げます（ 図1C ）。メッシュがきつく、ふたが傾いていないことを確認してください。ケージにはハエが植えられます（ステップ5.3を参照）。

2. 1Lフライケージの調製（10cmプレートに適合する）

1. 必要な材料を入手する：電気ドリル、76mm（3インチ）の切削工具（ 図1EおよびFナイフメッシュ、カミソリ、サンドペーパー、ゴーグル、作業手袋を備えた直方体の1Lプラスティックジャー（igure 1F）。
2. 蓋をしっかりとねじ込みながら蓋をしっかりと締め、プラスチック製の瓶の底部とふたの3インチ（76 mm）の穴を切ってください（ 図1G ）。穴を開け始めるときに切削工具を円の中心に置く。
   注意：この手順では目の保護具を着用し、手袋を着用してください。
3. 剃刀の刃とサンドペーパーで穴の端を滑らかにします。
4. 18×18cmの正方形にナイロンメッシュを切ってください。
5. 瓶の上端にメッシュを置き、蓋をねじ込むことで締め付けます（ 図1G ）。メッシュがきつく、ふたが傾いていないことを確認してください。ケージにはハエが植えられます（ステップ5.3を参照）。

3.リンゴジュース（AJ）プレートの調製

1. 2Lフラスコに19gの寒天と1Lの18.2MΩ・cmの水を加えます。攪拌棒を加え、短時間混ぜる。
2. 30分間オートクレーブ。一方、100％リンゴジュース濃縮物を凍結ストックから解凍し、10％（重量/体積）の4-ヒドロキシ安息香酸メチル溶液をエタノール中で10mL調製する。
3. オートクレーブ後、攪拌プレート上で寒天を混合し、80％の100％リンゴジュース濃縮物および10％（重量/体積）の4-ヒドロキシ安息香酸メチル溶液10mLをフラスコに加える。一定の混合で室温で冷却する。
4. 各皿の寒天レベルが約5 mmになるように、15 cmペトリ皿（5 Lケージ用）または10 cmペトリ皿（1 Lケージ用）を注ぎます。室温で凝固させ、ビニール袋で包みます。 AJプレートは4℃で2週間保存できます。
   注：ペトリ皿は洗って再利用することができます。
5. 湿った酵母ペーストを調製する：簡単な混合を可能にする蓋を備えた100mLの容器に活性乾燥酵母を注ぎ、少量の水を加えながら撹拌しながら、濃くて完全に混合するペースト。 4℃で最大2週間保管してください。

4.溶解試薬の調製

1. 250mMトリスpH7.5,25％グリセロール、1％オクチルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール（IGEPAL CA-630）、7.5mM MgCl 2,625mM NaCl、125mM NaF、5mM Na ₃ VO _4を調製する。
   1. 200mLを作るために：絶えず撹拌しながら、71mLの水中に1gのNaF粉末と184mgのNa ₃ VO粉末を完全に溶解する。 1MトリスpH 7.5の50mL、100％IGEPALの2mL、1M MgClの1.5mL、および5M NaClの25mLを加える。次に50 mLのグリセロールを添加し（最後に加える）、1時間撹拌を続ける。
   2. 250mLフィルターユニットを使用してフィルター滅菌する。この工程は遅くなる可能性があるが、不溶性微粒子を除去するためには溶液を濾過することが重要である。 50 mLチューブで10 mLずつ分注し、-80°Cで保存します。
2. 水中で1Mジチオスレイトール（DTT）溶液を調製する。 1 mLのアリコートで-20℃で保存する。
3. プロテオームを得るエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を用いたアゼイン阻害剤カクテル錠剤。 4℃で保存する。
4. 10mLのシリンジおよびシリンジフィルター（直径26mm、界面活性剤を含まない酢酸セルロース（SFCA）膜、孔径0.45μm）を入手する。

5.フライ胚の収集

1. 関心のあるタグ付きタンパク質を運ぶトランスジェニックフライラインをボトル（約100フライ/ボトル）で増幅し、フライラインごとに25〜30本のボトルが蓄積されるまで2日ごとにボトルを移す。同様の方法で制御在庫（ 例えば 、 ywライン）を増幅します。
2. AJプレートを室温まで暖めます（約1〜2時間、一晩中行うことができます）。手袋をした指を使って、AJプレートの中央に若干の濡れた酵母ペーストを広げ、 15cmのプレートの場合は6cmの円、10cmのプレートの場合は4cmの円である。
3. 標準的なショウジョウバエの段階設定を使用して、二酸化炭素の流れでハエを麻酔し、ケージ（5リットルのケージにつき約15のよく成長したハエのボトル、1リットルのケージあたり5ボトル）。
   1. ステップ5.2の準備済みのAJプレートでケージの底を覆い、テープの2つのストリップを使用してAJプレートをケージにテープします（ 図1Dおよび1H ）。プレートを交換するときに簡単に剥がれるように、プレートの上にあるテープの先端を折り畳むと便利です。
   2. ハエが麻酔から回復した後、プレートを下にしてケージを保持し、上部に噛み合わせます。
      注意：ハエが完全に回復するまで待つことが重要です。さもなければAJプレートと酵母ペーストに固執します。
   3. 実験の終わりに、ケージを洗浄のために準備するために、ケージを数時間冷凍庫に入れる。メッシュを水に数時間浸すと、クリーニングが容易になります。
4. ケージをハエと室温で2〜3日間インキュベートし、AJプレートを1日2回交換する。プレートを交換するには、ケージを上下逆さまにして、テープをプレートからはがすが、プレートをケージに保持し、ベンチ上のケージ全体を静かにタップして、新しいプレートの交換を迅速に行い、ハエが逃げないようにする。
   注：ハエはケージに適応する必要があり、3日目から始めるのが最善です。彼らはピークレベルで約4-5日間寝続けるでしょう。上の敷設能力で2つの5Lケージは、一晩の収集で1gまでの胚を産生することができる。小規模実験には1リットルのケージを使用します。
5. ハエが新鮮なAJプレートに胚を一晩（約16時間）置くことを可能にするか、または任意の他の所望の時間長さに置く。
6. 翌朝、使用したフライラインごとに1つずつ、胚収集用のメッシュ容器をマーキングし、計量します。
7. セクション4の試薬を使用して、1x溶解バッファーを調製します（注意：すぐに使用できる1x溶解バッファーは、抽出直前に調製しなければなりません）：10mLの5x濃縮溶解バッファー（-80℃で保存） 50mLのチューブに入れた。
   1. 1 MDの50μLを加えるTTで1mMの最終濃度にし、十分に混合し、2つの50mL試験管に分け、各25mLを分取する。チューブの1つに、1つのプロテアーゼ阻害剤錠剤を加え、4℃で30分間回転させる。錠剤が溶解している間、胚を収集し、脱皮する（ステップ5.8〜6.6）。錠剤が完全に溶解していることを確認し、バッファーを氷上に置いてください。
      注：DTTを含む1×バッファーの2番目のチューブは-80°Cで保存することができ、次の実験の前にタブレットの添加が必要になります。タンパク質精製工程中のその後の洗浄を考慮に入れて、2mLまでの溶解緩衝液25mLで十分である。
8. 使用されたフライラインの遺伝子型を用いてケージ上のAJプレートに印を付け、新鮮なもののためにプレートを交換する。
   注：この段階で過剰の酵母ペーストをプレートから掻き取ることができます。胚は、発育時間の所望のウィンドウを得るために、25℃または室温でプレート上で老化させることができる。
9. 十分な水を加えるo各AJプレートをカバーする。柔らかいペイントブラシ（平らな頭部、約10mm幅）は、平らなプレートから胚を静かに取り除きます。先に計量してマークしたメッシュ容器に胚を注ぎ、余分な水を排水する。
   1. 必要に応じて、すべての胚を取り除くためにプレートの2回目のすすぎとブラッシングを行います。同じフライラインの追加プレートの胚を同じメッシュコンテナに結合する。
10. 簡単にペーパータオルでメッシュを拭き取り、余分な水分を取り除きます。

6.胚の脱皮

1. 50％漂白剤を含む6cmのペトリ皿（水中のvol / vol溶液）を半分充填する。
   注：Table of MaterialsおよびReagentsの漂白剤ブランドに関する重要なコメントを参照してください。
   注意：手袋を着用し、衣類に漂白剤をつけないでください。
2. 2つの大きなペトリ皿を水で準備する。
3. 胚を50％漂白剤で90秒間メッシュ容器に浸します。 incuの間にメッシュを静かにタップ漂白剤溶液中の胚を懸濁させるために2〜3回繰り返す。
4. 90秒のインキュベーションの終わりに、2つの皿の各々のメッシュ容器を約10秒間水で洗浄する。
5. 噴霧ボトルを使用してメッシュ容器を18.2MΩ・cmの水で完全にすすぎます。また、メッシュコンテナの側面と外側を洗います。
   注：徹底的な洗浄の後、漂白剤の臭いは検出されません。
6. メッシュ容器をペーパータオルで汚す。胚でメッシュコンテナを計量し、ステップ5.6で得られた空のコンテナの重量を引く。胚の結果重量を記録する。目指すべき胚の量は0.5〜1gが良い。

7.胚芽抽出物の調製

1. プロテアーゼ阻害剤（ステップ5.7より）を含む溶解バッファー1 mLをdounceガラスホモジナイザーに加え、氷上に保ちます。胚をメッシュ容器からホモジナイザーに移す。
   注：胚は、平らな末端で採取することができますファーメタルスパチュラまたはブラシに入れ、緩衝液に直接移した。このセクションのすべての手順を氷上で実行します。
2. メッシュ上の残りの胚をさらに1mLの溶解緩衝液で洗い流し、ホモジナイザー中の材料に加える。胚をホモジナイザーの底まで沈降させ、上清を注意深く吸引する。
3. プロテアーゼ阻害剤（ステップ5.7から）を含む溶解緩衝液をホモジナイザーに添加し、胚1グラムあたり5-6mLの溶解緩衝液を目標とする。
4. 緩やかなフィットの乳棒で4-6ストロークで胚を均質化する。
   注：最初のストロークの間に、より多くの抵抗があります。溶液がはねられるのを避けるために、乳棒を連続的に動かすようにしてください。
5. タイトフィットの乳棒で8-10ストロークだけ胚を均質化する。
6. ホモジネートを氷上で20分間インキュベートする。
7. ホモジネートをマイクロ遠心チューブに移し、最高速度（約13,000 xg）で15分間4℃で遠心分離します。
8. 避けるペレットと非常に上の脂質層を取り除き、上清を新鮮な微量遠心管に移し、4℃で15分間、最高速度（約13,000×g）で遠心分離する。
9. 慎重に1mLの先端で上清を吸引し、0.45μmのフィルターが取り付けられた冷却された10mLシリンジにロードする（同じサンプルのアリコートを1つのシリンジに合わせる）。氷上で標識した15 mLチューブにすべての溶液を押します。この抽出物は、その後のタンパク質精製実験にすぐに使用することができ、液体窒素中で急速冷凍し、将来の使用のために-80℃に保つことができる。
   注：その後の胚の解凍中にプロテアーゼが活性化され、タンパク質分解を引き起こす可能性があるため、胚よりも抽出物を凍結する方がよい。

結果

タンパク質複合体精製実験におけるこのプロトコールの使用を説明するために、本発明者らは、ホモ接合性生存フライライン、EGFPタグ化ショウジョウバエ細胞外シグナル調節キナーゼ（ ロール遺伝子によってコードされるERK）を対照下で発現するarm-EGFP-ユビキタスで表現されたアルマジロ （ arm ）プロモーターの^18,19 。 アームプロモーターは、 ショウジョウバエの胚発生の大部分の段階で活性である¹⁹ 。溶解産物を上記プロトコールを用いて調製し、 アーム-EGFP-ERK導入遺伝子由来のタンパク質の発現を全ERKタンパク質のウエスタンブロッティングにより確認し、42kDaおよび69kDaで遊走する内因性およびトランスジェニックEGFP-ERKのレベルを同時に検出した（ 図2A ）。タグなしの内...

ディスカッション

ここに提示されたプロトコールは、 ショウジョウバエの集団ケージを中規模に設定し、胚から全細胞タンパク質抽出物を作製するための単純で一般的な手順である。得られた抽出物は、アフィニティー樹脂上のタンパク質複合体の精製など、様々な下流の用途に使用することができる。タンパク質分解を最小限に抑えるために、抽出工程を氷上で行い、強力なプロテアーゼ阻害を用いることが重要である。記載されているように、プロトコルは、ほとんどの細胞質およびいくつかの膜および可溶性核タンパク質6,10,12,15の単離に適している。これは、高塩抽出⁵を用いた難溶性核タンパク質の単離など、他のコンパートメントからのタンパク質のより集中的な精製に容易に適合させることができる。ステップ5.8で述べたように、収集時間および胚の老化期間は、異なる発達段階を得るために正確な間隔でセットアップする。

抗Total ERK抗体（ 図2A ）を用いて示されているように、目的のタグタンパク質が内因性発現レベルに密接...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3)	Home Depot	209330	5-Lケージを作るため。
Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (3個入り)	Home Depot	209320	Diameter 8.37 in.5-Lケージ用の蓋。
透明な蓋付きフィッシャーブランドのペトリ皿、100 x 15 mm	フィッシャーサイエンティフィック	FB0875712	材質:ポリスチレン。1-Lケージと一緒に使用します。
透明な蓋、150 x 15 mm	フィッシャーサイエンティフィック	FB0875714	材質:ポリスチレン。5-Lケージで使用します。
透明な蓋付きフィッシャーブランドのペトリ皿、60 x 15 mm	フィッシャーサイエンティフィック	FB0875713A	材質:ポリスチレン。胚の解体中に使用されます。
Sefar NITEXナイロンメッシュ	Sefar	03-180/44	180ミクロン、44%のオープンエリア、フライケージに使用されます。
ミルウォーキー 3インチアーバー	ホームデポ	49-56-9670	1-Lケージを作るための3インチ切削工具
Nalgene 広口ストレートサイド PMP ジャー、ホワイト ポリプロピレン スクリュー クロージャー	フィッシャー サイエンティフィック	11-823-33	1-L ケージの作成用。Thermo Scientificの猫#21171000。代替の1-Lコンテナを使用することができます。
レッドスターアクティブドライイースト、2ポンドポーチ	レッドスター		Amazon.com または他のサプライヤーから購入できます。
冷凍100%アップルジュース濃縮物			食料品店から購入できます。缶に「100%リンゴジュース」と書かれている必要があります。
メチル4-ヒドロキシ安息香酸	アクロスオーガニクス	AC126965000	、メチルパラベンまたはテゴセプトとしても知られています。AJプレートの防腐剤として使用されます。
分子生物学用のIGEPAL CA-630、	溶解バッファーの調製に使用される	グマ	I8896
Nalgene Rapid-Flow 滅菌ディスポーザブルフィルターユニット CN メンブレン付き	フィッシャーサイエンティフィック	09-740-2A	0.2 μmの細孔サイズ。5x溶解バッファーのフィルタリングに使用されます。Thermo Scientificの猫#1260020。
CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	11697498001	バイアル 20錠入り。溶解バッファー中のプロテアーゼ阻害に使用されます。
Corning SFCAシリンジフィルター	フィッシャーサイエンティフィック	09-754-21	SFCA膜、直径26 mm、細孔サイズ0.45 μm. 最終抽出サンプルのろ過に使用されます。
BD 針のないLuer-Lok使い捨てシリンジ	フィッシャーサイエンティフィック	14-823-2A	抽出物サンプルをろ過するためのもの。BDネコ#309604。
漂白剤	クロロックスは		、どのスーパーマーケットでも購入できます。他のブランドは不完全なデコレーションを引き起こしたり、胚に対して有毒である可能性があるため、Cloroxブランドを使用することが重要です。
Corning Costar Netwell Plates	Fisher Scientific	07-200-213	胚コレクション用メッシュコンテナ 74 μMメッシュサイズ、6ウェル。
ウィートン ダウンス ティッシュ グラインダー、容量 15 ml	フィッシャー サイエンティ	06-435B	ホモジナイザー 胚用、ゆるくてきつい乳棒付き。ウィートン猫#357544。