ここでは、インビボで同じ試料上の浅い深度での高分解能画像化と低分解能深部組織画像化の両方が可能な切り替え可能な音響分解能(AR)および光学分解能(OR)光音響顕微鏡法(AR-OR-PAM)
方法論記事
ここでは、インビボで同じ試料上の浅い深度での高分解能画像化と低分解能深部組織画像化の両方が可能な切り替え可能な音響分解能(AR)および光学分解能(OR)光音響顕微鏡法(AR-OR-PAM)
光音響顕微鏡法(PAM)は、オプティクスと超音波の両方を組み合わせた高速成長型のインビボイメージングモダリティであり、光学的平均自由行程(肌で1mm以下)を超えて高分解能で侵入します。単一のモダリティで超音波の高空間分解能と光吸収コントラストを組み合わせることにより、この技術は深部組織に浸透することができます。光音響顕微鏡検査システムは、音響分解能が低く、プローブが深く、または光学分解能が高く、プローブが浅くてもよい。単一のシステムで高い空間分解能と深度の浸透を達成することは困難です。この研究は、浅い深度での高解像度イメージングとインビボでの同じサンプルの低解像度深部組織イメージングの両方が可能なAR-OR-PAMシステムを提示する。光学集束を用いた1.4mmの撮像深度を有する4μmの横分解能と、音響集束を用いた7.8mmの撮像深度を有する45μmの横分解能が成功した組み合わせたシステムを使って実証されました。ここで、生体内での小動物の血管系画像化を行って、その生物学的イメージング能力を実証する。
光干渉断層撮影法、共焦点顕微鏡法、および多光子顕微鏡法などの高分解能光画像化様式は、多数の利点を有する。しかしながら、空間分解能は、撮像深度が増加するにつれて著しく減少する。これは、軟組織1,2における光輸送の拡散性のためである。光励起と超音波検出の統合は、深部組織における高解像度光学イメージングの課題を克服する解決策を提供する。光音響顕微鏡(PAM)は、他の光学イメージング様式よりも深いイメージングを提供することができるそのような様相の1つである。これは、インビボの構造的、機能的、分子的および細胞イメージングに首尾よく適用されている3,4,5,6,7,8 、 > 9,10,11,12,13の研究を行った。
PAMでは、短いレーザーパルスが組織/試料を照射する。発色団( 例えば、メラニン、ヘモグロビン、水など )による光の吸収は、温度上昇をもたらし、その結果、音響波(光音響波)の形態の圧力波が生成される。生成された光音響波は、組織境界外の広帯域超音波変換器によって検出することができる。弱い光学的およびタイトな音響集束を利用して、深部組織撮像は音響解像度光音響顕微鏡(AR-PAM)14,15,16において達成することができる。 ARでは-PAM、45μmの横方向分解能、3mmまでの撮像深度が実証されている15 。単一毛細管(約5μm)を音響的に解決するためには、> 400MHzの中心周波数で動作する超音波トランスデューサが必要である。このような高い周波数では、侵入深さは100μm未満である。タイトな光学的集束を使用して、密着した音響集束によって生じる問題を解決することができる。光学的解像度光音響顕微鏡法(OR-PAM)は、単一の毛細血管または単一の細胞17を分解することができ、0.5μmの横方向分解能は18,19,20,21,22,23,24に達している。フォトニックナノジェットの使用は、回折限界解像度以上の解像度を達成するのに役立ちますn 25,26 。 OR-PAMでは、光の集束のために侵入深さが制限され、生物組織23の内部で約1.2mmまで撮像することができる。従って、AR-PAMはより深く、より低い解像度で画像を形成することができ、OR-PAMは、非常に高い解像度で画像化することができるが、画像深度は限られる。 AR及びOR-PAMシステムの画像化速度は、主として、レーザ光源27のパルス繰り返し速度に依存する。
AR-PAMとOR-PAMを組み合わせることは、高解像度と深い画像の両方を必要とするアプリケーションに大きな利点となります。これらのシステムを組み合わせるための努力はほとんどなされていない。通常、2つの異なるイメージングスキャナがイメージングに使用され、これはサンプルが両方のシステム間を移動することを必要とし、したがってインビボイメージングを実行することを困難にする。しかしながら、AR及びOR PAMの両方を用いたハイブリッド撮像は、スケーラブルな解像度深さ。 1つのアプローチでは、ARおよびOR PAMの両方の光を送達するために光ファイババンドルが使用される。このアプローチでは、2つの別々のレーザー(ARの場合は570 nmの高エネルギーレーザーとORの場合は532 nmの低エネルギー、高繰り返しレーザー)が使用され、システムが不便で高価になります。 OR-PAMレーザーの波長は固定されており、酸素飽和度などの多くの研究は、この複合システムを使用しては不可能です。 ARとOR PAMとの比較研究は、ARとORとの間のレーザ波長の違いのためにも不可能である。さらに、AR-PAMは明視野照明を使用する。したがって、皮膚表面からの強い光音響信号が画質を制限する。このため、このシステムは多くのバイオイメージングアプリケーションには使用できません。 ARおよびOR PAMを実行する別の手法では、光学的および超音波的な焦点がシフトされ、光の焦点および超音波の焦点の位置合わせが不整合になる。したがって、画質は最適ではない 29。この技術を使用すると、AR-PAMおよびOR-PAMは、それぞれ139μmおよび21μmの分解能しか達成できず、分解能の低いシステムになります。光ファイバーとコリメート光学系を変更することを含むもう1つのアプローチは、ARとOR PAMの間で切り替えることが報告されています。これらのすべての場合において、AR-PAMは暗視野照明を使用しなかった。暗視野照明の使用は、皮膚表面からの強い光音響信号の生成を低減することができる。したがって、深い光音響信号の検出感度が明視野照明の検出感度に比べて高いので、リング状照明を用いて深部組織撮像を行うことができる。
この研究は、両方の嚢に対して同じレーザーとスキャナーを使用して、同じサンプルの高分解能イメージングと低分解能深部組織イメージングの両方が可能な切り替え可能なARおよびOR PAM(AR-OR-PAM)イメージングシステムを報告していますems。 AR-OR-PAMシステムの性能は、ファントム実験を用いて空間分解能および画像深度を決定することによって特徴付けられた。 インビボでの血液血管造影画像をマウスの耳に対して実施して、その生物学的イメージング能力を実証した。
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すべての動物実験は、シンガポール南陽技術大学の動物実験および使用委員会(Animal Protocol Number ARF-SBS / NIE-A0263)の認可された規制およびガイドラインに従って行われた。
AR-OR-PAMシステム( 図1 )
2.システムの切り替えとアライメント
3.実験ステップ
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AR-OR-PAMシステムの概略図を図1に示します 。このセットアップでは、すべてのコンポーネントが光学ケージの設定で統合され、組み立てられました。ケージシステムを使用することにより、AR-OR-PAM走査ヘッドがコンパクトになり、単一の走査ステージ上に容易に組み立てられ、位置合わせされ、一体化される。
撮像ヘッドの2次元連続ラスタ走査を画像取得中に使用した。時間分解PA信号に音速(1,540m / s)を掛けてAラインを得た。 Yステージの連続動作中に捕捉された複数のAラインは、2次元Bスキャンを生成した。画像化領域の複数のBスキャンを捕捉してコンピュータに保存し、MAP光音響画像を処理および生成するために使用した。
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結論として、より低いイメージング深度で高解像度イメージングとより高いイメージング深度で低解像度イメージングの両方を達成できる切り替え可能なARおよびOR PAMシステムが開発された。切り換え可能なシステムの横方向分解能および画像深度が決定された。この切り替え可能なPAMシステムの利点は、(1)きつい光学的集束を使用する高解像度イメージング、 (2)音響集束を用いた深部組織撮像、 3)強力なPA信号が皮膚表面に出現するのを防止するAR-PAMの暗視野照明。 4)異なるシステム間でサンプルを移動することなく、サンプルを1か所に保持する能力。 5)複数のレーザーおよび走査ステージの使用を避ける可能性。 6)自家製成分の最小限の使用。これは、サンプル/ obを動かすことなく、同じサンプルの高解像度、浅い深さの画像および低解像度、深部組織画像を提供するOR-PAMと暗視野AR-PAMの最初に報告された組み合わせであるject。同じスキャニングステージとレーザーを使用することで、システムは効率的でコスト効率に優れています。組み合わされたシステムは、1.4mmの撮像深度を有する4μmの横方向分解能、および7.8mmの撮像深度を有する45μmの横方向分...
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すべての動物実験は、シンガポール南陽技術大学の動物実験および使用委員会(Animal Protocol Number ARF-SBS / NIE-A0263)の承認されたガイドラインおよび規制に従って行われた。著者は、原稿に関連する金銭的関心はなく、開示する可能性のある他の利益相反はない。
著者は、シンガポールの教育省(ARC2 / 15:M4020238)が資金を提供するTier 2助成金からの財政的支援を認めたいと考えています。著者は機械ショップの助けを借りてChow Wai Hoong Bobbyに感謝したいと思います。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| QスイッチNd:YAG | レーザーEdgewave | BX80-2-L | ポンプレーザー |
| Credo-高繰り返し率 色素レーザー | スペクトル物理学 | CREDO-DYE-N | 色素レーザー |
| 精密リニアステージ | Physik Instrumente | PLS 85 | XYラスタースキャンステージ |
| トランスレーションステージ | Physik Instrumente | VT 80 | 共焦点決定 |
| 搭載型シリコンフォトダイオード | Thorlabs | SM05PD1A | Triggering/Pulse variation |
| 電動連続回転ステージ | Thorlabs | CR1/M-Z7 | 迂回レーザービーム |
| 搭載 無段変速NDフィルター | Thorlabs | NDC-50C-4M | 強度可変 |
| ファイバーパッチケーブル | Thorlabs | M29L01 | マルチモードファイバー |
| 顕微鏡対物レンズ | Newport | M-10X | 対物レンズ |
| XY平行移動マウント | Thorlabs | CXY1 | 平行移動マウント |
| 平面凸レンズ | Thorlabs | LA1951 | コリメーティングレンズ |
| 円錐レンズ | Altechna | APX-2-B254 | リング状ビーム |
| 平行移動ステージ | Thorlabs | CT1 | 平行移動ステージ |
| 光学コンデンサー | 自家製 | ||
| 超音波トランスデューサ | Olympus-NDT | V214-BB-RM | 50MHz トランスデューサ |
| プラノ凹面レンズ | Thorlabs | LC4573 | 音響レンズ |
| パルサー/レシーバー | Olympus-NDT | 5073PR | パルスエコー増幅器 |
| 標準アイリス | Thorlabs | ID12/M | ビーム整形 |
| 平面凸レンズ | Thorlabs | LA4327 | コンデンサーレンズ |
| 精密ピンホール搭載 | Thorlabs | P50S | 空間フィルタリング |
| シングルモードファイバーパッチケーブル | Thorlabs | P1-460B-FC-1 | シングルモードファイバー |
| カプラー | ニューポート | F-91-C1 | シングルモードカップリング |
| アクロマティックダブレットレンズ | エドモンド・オプティクス | 32-317 | アクロマティックダブレット |
| 保護された銀製楕円ミラー | Thorlabs | PFE10-P01 | ミラー |
| 直角運動学ミラーマウント | Thorlabs | KCB1 | ミラーマウント |
| Z軸平行移動マウント | Thorlabs | SM1Z | z トランスレータ |
| レンズチューブ | Thorlabs | ||
| UV 溶融シリカ 直角プリズム | Thorlabs | PS615 | 直角プリズム |
| 菱形プリズム | エドモンド・オプティクス | 47-214 | 横波 |
| ジメチルポリシロキサン | シグマ アルドリッチ | DMPS1M | シリコンオイル |
| アンプ | ミニ回路 | ZFL-500LN | アンプ |
| 16ビット 高速デジタイザー | スペクトル | M4i.4420 | データ収集カード |
| オシロスコープ | Agilent Technologies | DS06014A | |
| マウス | InVivos Pte.Ltd | ICR | 動物モデル |
| 超音波ゲル | プログレス/パーカーアクアソニックゲル | PA-GEL-CLEA-5000 | 音響カップリング |
| 水タンク | 自家製 | ||
| 翻訳ステージ | 自家製 | スイッチング AR-OR | |
| 金ナノ粒子 | シグマアルドリッチ | 742031 | 横方向の解像度 |
| 滅菌眼軟膏 | アルコン | デュラティアーズ | 動物イメージング |
| 1951 USAF解像度テストターゲット | エドモンド・オプティクス | 38257 | 共焦点アライメント |
| データ収集ソフトウェア | ナショナルインスツルメンツ | Labview Labview | を使用した自家製ソフトウェア |
| 画像処理ソフトウェア | Mathworks | Matlab | Matlabを使用した自家製プログラム |
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