方法論記事

細胞培養用ヒドロゲルの蛋白質ベースのアーキテクチャの簡単な操作

DOI：

10.3791/55813

⸱

2017年8月4日

 ,  , 
1Center for Peptide Pharmaceuticals, Faculty of Natural Science, Ulm University

この記事について

サマリー

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蛋白質ベースのヒドロゲルの三次元のアーキテクチャを操作するさまざまな方法は、材料特性に関してここで評価されます。マクロポーラス ネットワーク修飾が細胞接着ペプチドと細胞培養での実現性は、2 つの異なるモデルのセルラインを使用して評価されます。

要約

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ヒドロゲルは能力高い水和セル環境を提供するため細胞培養用有望な材料として認識されます。3 D テンプレートのフィールドは自然の細胞外マトリックスにそれらの材料の潜在的な類似性のため上昇しています。蛋白質ベースのゲルは、彼らは簡単に機能集積化することができます、調整可能な物理化学的性質と定義済みの構造を達成することが特に有望です。ただし、天然素材を使用して細胞培養用マクロポーラス 3 D テンプレートの生産はしばしば合成材料のそれらと比較して自分より弱い機械的性質によって制限されます。ここで、マクロポーラス ウシ血清アルブミン (BSA) を生成するさまざまな方法を行った-半径 10 を 70 μ m の範囲で調整可能な細孔径を持つハイドロゲル システムします。さらに、数百ミクロンの長いこのタンパク質ベース素材のチャンネルを生成する法を確立しました。膨潤率、pH、温度安定性、酵素分解挙動などの材料特性に及ぼす細孔径と同様に、毛穴を生成するさまざまな方法が分析されました。共焦点レーザ走査型顕微鏡を使用してゲルのネイティブ、腫れた状態で細孔径を調べた。タンパク質系の 2 つのモデル細胞系細胞接着 RGD ペプチド修飾を使用して細胞培養用可能性を評価した: ひと乳癌細胞 (A549) と adenocarcinomic ひと歯槽基底上皮細胞 (MCF7)。

概要

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ゲルは、大量の水をバインドできる不溶性の 3 D ネットワークを形成する材料です。そのような材料は、生きている細胞の優れた環境を提供できます。現在、三次元ハイドロゲル構造の生成とその化学的・物理的特性を調整するプロセスの開発、関心が、高まっています。これが達成されれば、細胞の増殖および細胞挙動の操作用のテンプレートは生成された1,2,3,4をすることができます。これらの 3 D 構造だけでなく環境を作成するより自然でリアルな二次元従来が、彼らよりも明らかに幹細胞の成長のための新たな可能性や腫瘍モデル5。異なる材料は、主に6ゲルの気孔のサイズに依存する特性の範囲を所有しています。毛穴は、電池文化、組織工学、幹細胞指向性の成長に重要な役割を再生します。たとえば、マトリックスを通して拡散酸素と栄養と十分な量は、セル7に到達できる必要があります。その一方で、有害な代謝産物は、できるだけ早く削除する必要がある、細胞の成長のための十分な領域が利用可能な7をする必要があります。その結果、材料、およびこう....

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プロトコル

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1. ゲルの調製

  1. BSA の 200 mg をミックス 1 ml の脱イオン H2O 20% (w/v) BSA ストック (ストック溶液) を作成します。
  2. ミックス 165 μ THPC ソリューション (134 mg/mL) 4.835 ml THPC を作成する純水の貯蔵液 (原液 B)。
  3. KCSSGKSRGDS (1,111.1 g/mol) ペプチド (または同等の細胞接着ペプチド) の 1 mg の重量を量るし、滅菌 H2O 10 mg/mL 解 (原液 C) を得るための 100 μ L で希釈しています。
    注: この手順はオプションであり、のみ細胞培養用ヒドロゲルを意味する場合が含まれる必要があります。
  4. 96 ウェル プレートの下部を取り外して取り外し可能なプラスチック製のラップ。
    注: ここで使用される板、下部簡単に削除できます; 各ウェルの底に圧力を適用することによって薄いプラスチック製の底が単に抜け落ちます。
  5. BSA 原液のミックス 100 μ L (A) と THPC の 100 μ L 在庫ソリューション (B) (オプション: 機能、細胞接着のヒドロゲルの原液 C の 4 μ L) ハイドロゲルの 200 μ L を取得する 96 ウェル プレートで。重合後制服ハイドロゲルを保証するため、少なくとも 5 回を上下にピペッティングによるコンポーネン....

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結果

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ハイドロゲルの開発は、材料研究関連の生物学的研究において最も顕著な分野の1つとなり、科学研究アーカイブには数千のエントリが索引付けされています。多くのシステムの振る舞いは十分に研究されていますが、3Dネットワーク、特に敏感なタンパク質ベースの材料の操作は、材料科学においてしばしば主要な問題です。また、過小評価されがちなもう一つの課題は、クライオ電子顕微鏡を用いて材料の天然構造を正しく測定することです。これは、サンプル調製(乾燥)プロセスによってハイドロゲルの特性が変化することが多いためです。この問題を解決するために、ここでの材料サンプルは、本来の水で膨潤した状態での材料の特性評価を可能にする方法である共焦点顕微鏡を使用して分析されました。ローダミンBは、静電相互作用を介してハイドロゲル骨格に結合し、材料の可視化を容易にします。このタンパク質ベースのシステムを変更するための凍結乾燥アプローチの実現可能性を調査するために、その後、ヒドロゲルを重合し、液体窒素中で196°C、-20°Cで凍結しました。結果は、凝固温度が結果として生じる細孔サイズに明らかな影響を.......

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ディスカッション

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マクロ多孔質マトリックスの製造は、さまざまな分野に有益です。ハイドロゲルの定義された構造と、特定の材料特性を制御および調整する能力により、高い技術的および経済的可能性を秘めています。ただし、細孔やチャネルなどの超分子構造要素を 3D テンプレートに導入すると、膨潤率や剛性などの材料の全体的な特性に影響を与える可能性があります。これにより、ネットワークの望ましくない分解、劣化、または破壊が生じ、したがって、材料が役に立たなくなったり、単に目的のアプリケーションに適用できなくなったりする可能性があります12。タンパク質は、その定義された構造、固有の生体適合性(天然源に由来するため)、および利用可能な多くの修飾部位(反応 性アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基など)により、ヒドロゲルへの応用の可能性が知られています。しかし、多くのタンパク質ベースのヒドロゲルは、合成の対応物と比較して十分な機械的安定性を欠いています16。大規模な3Dアーキテクチャの導入は、ヒドロゲルの完全な構造崩壊につながる可能性があるため、望ましい材料特性を.......

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開示事項

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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

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著者は、「バイオインスパイアード材料合成」フレームワーク (バイオマット-14) の金融支援財団はバーデン = ヴュルテンベルク州を感謝したいです。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)サーモフィッシャーサイエンティフィック10010023
Dulbecco'修正されたイーグル」s medium (high glucose)Life Technologies / サーモフィッシャー 11140-050
ウシ胎児血清(FBS)ライフテクノロジーズ/サーモフィッシャー 10270-106
ペニシリン・ストレプトマイシンライフテクノロジーズ / サーモフィッシャー 
MEM 非必須アミノ酸溶液Sigma AldrichM7145-100ML
トリプシン EDTA 0.05% フェノール レッドサーモフィッシャー サイエンティフィ25300062
エタノール 99.8%, vergälltölfabrik Schmidt2133
NaCl カール・ロス 9265.1
アルブミンフラクション Vカール・ロス 3854.2
THPCシグマ アルドリッチ404861-100ML毒性
0.1% トリトン X-100シグマ アルドリッチX100-100MLわずかに毒性
ファロイジン-ローダミン ライフテクノロジーズ / サーモフィッシャー R415
3.7%ホルムアルデヒド ライフテクノロジーズ / サーモフィッシャー F8775-25ML有毒
ローダミンBシグマアルドリッチ81-88-9
フィルトロプールS 0.2 サーステッド農業ウント株式会社2 83.1826.001   
µ slide 8 wellIbidi GmbH80826
KCSSGKSRGDS peptideUPEP UlmCustom sysnthesis
Ethanol 99.8%, vergälltカールロス K928.5
ファルコン 5 ml ポリステレン丸底チューブ サーステッド農業ウント株式会社62.547.254    
チューブ50ml サーステッド農業ウント株式会社62.547.254    
チューブ1.5ml  サーステッド農業ウント株式会社72,690,001
チューブ2ml  サーステッド農業ウント株式会社72,691
細胞培養マイクロプレート、96 WELL、PS、F-BOTTOMGreiner655073
FreezeDryer Epsilon 1-6D、 Christ, Osterode am Harz, ドイツ
共焦点レーザー走査型顕微鏡 Carl Zeiss AG、Oberkochen、ドイツ
Zenソフトウェアバージョン2012 Sp1、ブラックエディション、407バージョン8,1,0,484Carl Zeiss AG、オーバーコッヘン、ドイツ
GSA Imaga Analyzerソフトウェア、GSAイメージアナライザー、GSA、バージョン419 3.8.7GSA GmbH
15140122ック のある

参考文献

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  1. Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirki, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2011).
  2. Liu, Y., Chan-Park, M. B. A biomimetic hydrogel based on methacrylated dextran-graft-lysine and gelatin for 3D....

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