細胞培養用ヒドロゲルの蛋白質ベースのアーキテクチャの簡単な操作

Summary

蛋白質ベースのヒドロゲルの三次元のアーキテクチャを操作するさまざまな方法は、材料特性に関してここで評価されます。マクロポーラス ネットワーク修飾が細胞接着ペプチドと細胞培養での実現性は、2 つの異なるモデルのセルラインを使用して評価されます。

Abstract

ヒドロゲルは能力高い水和セル環境を提供するため細胞培養用有望な材料として認識されます。3 D テンプレートのフィールドは自然の細胞外マトリックスにそれらの材料の潜在的な類似性のため上昇しています。蛋白質ベースのゲルは、彼らは簡単に機能集積化することができます、調整可能な物理化学的性質と定義済みの構造を達成することが特に有望です。ただし、天然素材を使用して細胞培養用マクロポーラス 3 D テンプレートの生産はしばしば合成材料のそれらと比較して自分より弱い機械的性質によって制限されます。ここで、マクロポーラス ウシ血清アルブミン (BSA) を生成するさまざまな方法を行った-半径 10 を 70 μ m の範囲で調整可能な細孔径を持つハイドロゲル システムします。さらに、数百ミクロンの長いこのタンパク質ベース素材のチャンネルを生成する法を確立しました。膨潤率、pH、温度安定性、酵素分解挙動などの材料特性に及ぼす細孔径と同様に、毛穴を生成するさまざまな方法が分析されました。共焦点レーザ走査型顕微鏡を使用してゲルのネイティブ、腫れた状態で細孔径を調べた。タンパク質系の 2 つのモデル細胞系細胞接着 RGD ペプチド修飾を使用して細胞培養用可能性を評価した: ひと乳癌細胞 (A549) と adenocarcinomic ひと歯槽基底上皮細胞 (MCF7)。

Introduction

ゲルは、大量の水をバインドできる不溶性の 3 D ネットワークを形成する材料です。そのような材料は、生きている細胞の優れた環境を提供できます。現在、三次元ハイドロゲル構造の生成とその化学的・物理的特性を調整するプロセスの開発、関心が、高まっています。これが達成されれば、細胞の増殖および細胞挙動の操作用のテンプレートは生成された^1,2,3,4をすることができます。これらの 3 D 構造だけでなく環境を作成するより自然でリアルな二次元従来が、彼らよりも明らかに幹細胞の成長のための新たな可能性や腫瘍モデル⁵。異なる材料は、主に⁶ゲルの気孔のサイズに依存する特性の範囲を所有しています。毛穴は、電池文化、組織工学、幹細胞指向性の成長に重要な役割を再生します。たとえば、マトリックスを通して拡散酸素と栄養と十分な量は、セル⁷に到達できる必要があります。その一方で、有害な代謝産物は、できるだけ早く削除する必要がある、細胞の成長のための十分な領域が利用可能な⁷をする必要があります。その結果、材料、およびこうして細孔径のプロパティ深刻な行列の潜在的な利益と可能なアプリケーションに影響します。材料の特性に応じて、異なるセル成長過程は、神経構造の形成を含む、3 D の細胞の文化において発生することが成長と皮膚や骨の細胞の分化のような肝細胞や線維芽細胞^{2,3,8,9,10,11}の特別な細胞ラインの監督の成長。物質の可能性のあるアプリケーションに影響を与えるもう一つの重要なポイントは、外部刺激¹²に向かってその安定性です。たとえば、ヒドロゲルへの細胞培養媒体または人間の体の機械的完全性を維持しなければなりません。

近年、激化、3 D 細胞培養ハイドロゲルに関する研究し、システム¹³の 3 D アーキテクチャを解決する多くの研究を行った。高い安定性を発揮し、簡単に合成および化学的に変更できるため化学的に合成された成分から成るハイドロゲルを調べた最も一般的⁵(朱ら2011 のレビューを参照してください)。しかし、タンパク質は多くの有益な特性をある: としていわゆる「精密高分子」彼らは生体適合性;ある定義された長さ;彼らも比較的容易に修正。ターゲット サイト^14,15の大規模な数であります。この点では、特異性の高い、革新的な構造は、多くの分野でのアプリケーションの生成できます。本研究では蛋白質ベースのゲル¹⁶は、材料の 3 D アーキテクチャに影響を与える確立した方法の能力を発揮する使用されました。さらに、性と細孔生成への適用も検討しました。

簡単な方法と材料科学のさまざまな分野から、専門性の高い高度な技術の両方を含む、3 D 構造を変更するさまざまな方法があります。広範な技術は、明確に定義された構造¹⁷を生成するエレクトロスピニングの使用です。請求繊維電界印加によるソリューションから取得され、酸素への露出に固めます。このように、数ミクロンまで数ナノメートルの範囲の繊維を作り出すことができます。サイズ、構造、およびマトリックス内の気孔の分布を調整するための追加のテクニックは、ソフト ・ リソグラフィー、フォトリソグラフィ、流体を中心、エレクトロ スプレー、およびバイオ印刷^18,19,20。これらの技術の重大な欠点は、特定の高価な装置や特別な化学薬品材料への依存関係です。さらに、これらの技術と経験が頻繁に蛋白質ベースの材料に直接譲渡と化学物質とメソッドの多くは、互換性のある細胞ではないです。

その一方で、多くの技術は特別な装置は、簡単かつ安価な適用し、再現するそれらを作るには頼らないでください。構造操作のため普及している方法は、溶液キャスト法^21,22,23です。粒子は重合反応前に加えてゆくソリューションを飽和に配布されます。毛穴が材料内に残る、重合後、希釈や pH 変化などの条件の変化は粒子の溶媒和に します。塩、砂糖、パラフィン、ゼラチン、チョークなど、これらの技術で使用される化学物質は、安価で容易に入手できます。凍結、膨潤ゲルに固定されます。真空下で液相の後続の昇華は、^23,24,25を実行します。ネットワークから水昇華は材料の特定の立体構造を維持するために十分な穏やかです。発泡ガス、重合が行われる、ゲル²¹孔を残している間に、ガスとソリューションはストリーミングされます。サイズと孔の分布は、ガスの流れによって調整できます。

タンパク質ゲルを形成、BSA はテトラキス (ヒドロキシメチル) ホスホニウム塩塩化 (THPC) 第一級アミンとリンカーの 4 武装分子²⁶の水酸基との間に共有結合の形成を許可する Mannich 型反応と反応しました。可能な有害な中間体は、反応が発生した後、材料の余分な洗浄によって削除されます。

本研究では、BSA ベースの素材を操作し、細孔のサイズを調整するさまざまなテクニックを治療の可能性を紹介します。各技法使用できますあらゆる研究室で、世界中、特別な機器は必要ありません。さらに、パラメーターの異なるような膨潤率、酵素分解性、pH 安定性、温度感受性を検討され、それぞれに他と比較して特に尊重さまざまなテクニックの影響 3 D アーキテクチャの世代に。最後に、材料が修飾と細胞接着ペプチドの細胞培養の材料の適用の可能性を調査します。2 つの異なるモデル細胞ラインを使用した: A549 と MCF7。

Protocol

1. ゲルの調製

1. BSA の 200 mg をミックス 1 ml の脱イオン H₂O 20% (w/v) BSA ストック (ストック溶液) を作成します。
2. ミックス 165 μ THPC ソリューション (134 mg/mL) 4.835 ml THPC を作成する純水の貯蔵液 (原液 B)。
3. KCSSGKSRGDS (1,111.1 g/mol) ペプチド (または同等の細胞接着ペプチド) の 1 mg の重量を量るし、滅菌 H₂O 10 mg/mL 解 (原液 C) を得るための 100 μ L で希釈しています。
   注: この手順はオプションであり、のみ細胞培養用ヒドロゲルを意味する場合が含まれる必要があります。
4. 96 ウェル プレートの下部を取り外して取り外し可能なプラスチック製のラップ。
   注: ここで使用される板、下部簡単に削除できます; 各ウェルの底に圧力を適用することによって薄いプラスチック製の底が単に抜け落ちます。
5. BSA 原液のミックス 100 μ L (A) と THPC の 100 μ L 在庫ソリューション (B) (オプション: 機能、細胞接着のヒドロゲルの原液 C の 4 μ L) ハイドロゲルの 200 μ L を取得する 96 ウェル プレートで。重合後制服ハイドロゲルを保証するため、少なくとも 5 回を上下にピペッティングによるコンポーネントをミックスします。
6. すべてのゲルは、正しく重合させるまで約 10 分の室温 (RT) で 96 ウェル プレートを配置します。
7. 慎重に、ゆっくりと、プレートの底からプラスチック製のラップを削除します。
8. 小さなスタンプを使って 96 ウェル プレートからゲルを押し、滅菌 PBS、pH 7.4 で 1.5 mL チューブにそれらを転送します。
   注: ヒドロゲル直径約 4 mm と 8 mm の高さの円筒形があります。
9. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 数ヶ月まで 4 ° c に、ゲルを格納します。

2. 凍結、ゲル

1. 無菌脱イオン H₂O の 500 μ L で 1.5 mL チューブを記入し、キャップを取り外します。ヘラを使って 1.5 mL の反応管に、ゲルを転送します。
2. 各バイアル用パラフィン フィルムで少なくとも 3 層でしっかりと 1.5 mL チューブをラップします。針を使用すると、チューブからのガス放出を可能にするのにフィルムに小さな穴を開けます。
3. 次の手順のいずれかを行います。
   1. 水とゲルが完全に凍結を保証する 5 分間液体窒素ソリューションにバイアルを転送します。液体窒素から除去した後すぐに材料が融解するを防ぐために乾燥機の凍結バイアルを転送します。
      注: この手順の結果毛穴について半径 10-15 μ m。
   2. ゆっくりと、ゲルを凍結するために一晩-20 ° C でバイアルをしてください。-20 ° C から除去した後すぐに材料が融解するを防ぐために乾燥機の凍結バイアルを転送します。
      注: この手順の結果毛穴について半径 50-60 μ m。
4. 24 h (およびヒドロゲルへの水の完全な蒸発) 後凍結乾燥機からそれを削除することによって、材料を解凍します。
   注: 細孔径は、共焦点レーザ走査型顕微鏡 (手順 5、「ハイドロゲル可視化」) を分析できます。

3. 粒子の溶出

1. 1.1 1.5 の手順で説明するように、ハイドロゲルを準備します。
2. 直接コンポーネントを混合した後飽和 (36 mg/mL) が発生するまで塩化ナトリウムを追加します。白色沈殿物としてソリューションに塩の結晶を見ることができるまでは、塩を追加します。
3. 96 ウェル プレートをシェーカーに転送、重合が行われる (約 10 分) までを振る。1.7 1.8 の手順で説明するよう、プレートから、ハイドロゲルを削除します。
4. ハイドロゲル テンプレートからすべての塩を溶出するシェーカー (20 rpm) で滅菌水で RT で、少なくとも 24 時間のヒドロゲルを孵化させなさい。数ヶ月まで PBS のための 4 ° C でゲルを格納します。

4 チャネル形成

1. 手順 1 で説明したゲルを準備します。挟み撃ちを使用したソリューションからハイドロゲルを削除、高吸水紙で余分な水分を除去、ドライアイスのブロックの上に置きます。
2. 30 のゲルを凍結 s、ブロックから注意深く取り外します。ハイドロゲル; に損傷を与えない慎重にブロックを掻きにヘラを使用します。ヒドロゲルを 1.5 mL チューブに転送し、37 ° C で一晩乾かしてください

5. ハイドロゲルの可視化

1. ローダミン B 原液を準備するには、10 mL の PBS のローダミン B の 1 mg を希釈します。0.001 mg/mL の濃度に達するまで PBS のローダミン原液を希釈してシリアル希釈を準備 (希釈倍率: 100)
2. ストレージ ソリューション (例えば、ステップ 2.4 から。) からヒドロゲルを削除し、0.01 mg/mL ローダミン B 溶液 1 mL と 1.5 mL チューブにそれを転送します。染色したローダミン B 溶液で一晩ハイドロゲル
3. 次の日は、10 mL の PBS (pH 7.4) の少なくとも 3 時間洗浄を可視化することは、ハイドロゲルを転送します。
4. よく μ スライド 8 にハイドロゲルを転送し、PBS でそれをカバーします。
5. 刃を使用して (約 0.5 mm の高さ) ハイドロゲルの小さなスライスをカットします。
6. 514 の波長でハイドロゲルを可視化する顕微鏡、共焦点レーザーを使用して nm (目的: EC 計画 Neofluar 40 x/1.30 油 DIC M27、平面スキャン モード: 514 nm、およびズーム: 1 X)。

6. 細胞文化の可能性

1. 無菌フィルター ソリューション (A、B、および C) を 0.45 μ m のフィルターで在庫すべて。
2. 1.1-1.4 ゲル重合前に細胞接着ペプチドを含む手順の説明に従って、ハイドロゲルを準備します。
3. コンポーネントを混合した後すぐにピペットの混合物 μ スライド 8 に下部は完全に覆われているまで。
   注: この手順する必要があります実行する迅速かつ直接コンポーネントを混合した後数分のスライドで重合が行われるよう。
4. 細胞接着と標準的な細胞培養の技術を用いた単一細胞懸濁液を入手への道。あらかじめ加温、滅菌 DMEM 培ウシ胎児血清 (FBS、10% (w/v))、ペニシリン ・ ストレプトマイシン (1% (w/v))、非必須アミノ酸ソリューション (MEM、1% (w/v)) と補完にセルを転送します。
5. ノイバウアーの商工会議所および慎重にピペット 200 μ L のハイドロゲル表面にセル (2 x 10⁵セル/cm²) の目的の数を数えるとセルをカウントします。
6. 蓋付きも μ スライド 8 をカバーし、インキュベーター (37 ° C、5% CO₂) に譲渡すること。37 ° C で少なくとも 4 時間インキュベートします。
7. 携帯電話の添付ファイルの少なくとも 4 時間後 200 μ L 滅菌培養 PBS で 2 回細胞を洗います。
8. RT で 10 分の 3.7% (v/v) ホルムアルデヒドの 200 μ L でセルを修正し、PBS で 2 回洗う (〜 200 μ L)。
   注: は、ホルムアルデヒドを処理するときに適切な個人用保護具を着用します。
9. 0.1% トリトン X を PBS で 2 回 5 分洗浄のための 200 μ L でセルを permeabilize します。
10. 195 μ L の PBS とメタノール株式の 5 μ L を混合してした汚れで暗闇の中 20 分のセルをそれを追加セルにファロイジン ローダミンで細胞を染色します。PBS で 2 回洗浄します。
11. 514 で共焦点顕微鏡を用いた細胞接着特性を調べる nm (目的: EC 計画 Neofluar 40 x/1.30 油 DIC M27、平面スキャン モード: 514 nm、およびズーム: 1 X)。適切なソフトウェアを使用して画像を分析 (材料の表を参照してください)。

7. ヒドロゲルの物性

1. 膨張率です。
   1. 完全に少なくとも 1 日の 37 ° C でゲルを乾燥します。
   2. 各ハイドロゲルの重さし、正確な重量に注意してください。
   3. 1.5 mL の PBS で 2 mL の反応管を埋めます。
   4. この 2 mL の反応管に、ハイドロゲルを転送し、完全に PBS で浸します。
   5. PBS PBS と平衡に到達する RT で、少なくとも 2 日間、ハイドロゲルを残します。
   6. 3 日後、ハイドロゲルをソリューションから削除し、ハイドロゲル表面から余分な水分を削除する紙ティッシュで拭くこと。
   7. ヒドロゲルの重量を量る。
   8. 次の数式を使用して膨張比を計算します。
      
      W_dは乾燥ゲル (ステップ 7.1.2。) の重量と W_sは湿潤ゲル (ステップ 7.1.7) の重量です。膨潤率パーセントを得るため 100 を乗算します。
2. pH と温度安定性。
   1. 15 mL の反応管に 5 mL の PBS を転送します。
   2. 水酸化ナトリウムと塩酸持参適切な温度 (例えばRT、37 ° C、または 80 ° C) への解決策 (例えばpH 2、7、または 10) 適切な pH の解決策を調整します。
   3. 適切なソリューションにその安定性を調査するのには、ハイドロゲルを転送します。必要な場合は、pH を調整してください。
      注: すべてヒドロゲル必要がありますが完全に腫れてこの時点 (膨張比を参照) 材料の膨潤による重量の誤った解釈を防ぐために。
   4. 特定の時間間隔の後、ハイドロゲルを (例えば、 2 日前までの各 1 時間) ソリューションから削除、余分な水分を除去し、それの重量を量る非常に吸収性紙ティッシュで乾燥します。
3. 酵素分解。
   1. 300 U トリプシンとペプシン、製造元の指示に従って在庫酵素溶液を準備します。
   2. (例えば1.8 のステップから) ハイドロゲルを適切なソリューションに転送します。
      注: すべてのゲル必要があります完全に腫大しているこの時点で重量の誤った解釈を防ぐために。
   3. 特定の時間間隔の後、ハイドロゲルを (例えば、時間ごと) のソリューションから削除、余分な水分を除去し、それの重量を量る非常に吸収性紙ティッシュで拭くこと。

Results

ハイドロゲルの開発は、材料研究関連の生物学的研究において最も顕著な分野の1つとなり、科学研究アーカイブには数千のエントリが索引付けされています。多くのシステムの振る舞いは十分に研究されていますが、3Dネットワーク、特に敏感なタンパク質ベースの材料の操作は、材料科学においてしばしば主要な問題です。また、過小評価されがちなもう一つの課題は、クライオ電子顕微鏡を用いて材料の天然構造を正しく測定することです。これは、サンプル調製(乾燥)プロセスによってハイドロゲルの特性が変化することが多いためです。この問題を解決するために、ここでの材料サンプルは、本来の水で膨潤した状態での材料の特性評価を可能にする方法である共焦点顕微鏡を使用して分析されました。ローダミンBは、静電相互作用を介してハイドロゲル骨格に結合し、材料の可視化を容易にします。このタンパク質ベースのシステムを変更するための凍結乾燥アプローチの実現可能性を調査するために、その後、ヒドロゲルを重合し、液体窒素中で196°C、-20°Cで凍結しました。結果は、凝固温度が結果として生じる細孔サイズに明らかな影響を...

Discussion

マクロ多孔質マトリックスの製造は、さまざまな分野に有益です。ハイドロゲルの定義された構造と、特定の材料特性を制御および調整する能力により、高い技術的および経済的可能性を秘めています。ただし、細孔やチャネルなどの超分子構造要素を 3D テンプレートに導入すると、膨潤率や剛性などの材料の全体的な特性に影響を与える可能性があります。これにより、ネットワークの望ましくない分解、劣化、または破壊が生じ、したがって、材料が役に立たなくなったり、単に目的のアプリケーションに適用できなくなったりする可能性があります¹²。タンパク質は、その定義された構造、固有の生体適合性(天然源に由来するため)、および利用可能な多くの修飾部位(反応 性アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基など)により、ヒドロゲルへの応用の可能性が知られています。しかし、多くのタンパク質ベースのヒドロゲルは、合成の対応物と比較して十分な機械的安定性を欠いています¹⁶。大規模な3Dアーキテクチャの導入は、ヒドロゲルの完全な構造崩壊につながる可能性があるため、望ましい材料特性を...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10010023
Dulbecco'修正されたイーグル」s medium (high glucose)	Life Technologies / サーモフィッシャー	11140-050
ウシ胎児血清(FBS)	ライフテクノロジーズ/サーモフィッシャー	10270-106
ペニシリン・ストレプトマイシン	ライフテクノロジーズ / サーモフィッシャー
MEM 非必須アミノ酸溶液	Sigma Aldrich	M7145-100ML
トリプシン EDTA 0.05% フェノール レッド	サーモフィッシャー サイエンティフィ	25300062
エタノール 99.8%, vergällt	ölfabrik Schmidt	2133
NaCl	カール・ロス	9265.1
アルブミンフラクション V	カール・ロス	3854.2
THPC	シグマ アルドリッチ	404861-100ML	毒性
0.1% トリトン X-100	シグマ アルドリッチ	X100-100ML	わずかに毒性
ファロイジン-ローダミン	ライフテクノロジーズ / サーモフィッシャー	R415
3.7%ホルムアルデヒド	ライフテクノロジーズ / サーモフィッシャー	F8775-25ML	有毒
ローダミンB	シグマアルドリッチ	81-88-9
フィルトロプールS 0.2	サーステッド農業ウント株式会社	2 83.1826.001
µ slide 8 well	Ibidi GmbH	80826
KCSSGKSRGDS peptide	UPEP Ulm	Custom sysnthesis
Ethanol 99.8%, vergällt	カールロス	K928.5
ファルコン 5 ml ポリステレン丸底チューブ	サーステッド農業ウント株式会社	62.547.254
チューブ50ml	サーステッド農業ウント株式会社	62.547.254
チューブ1.5ml	サーステッド農業ウント株式会社	72,690,001
チューブ2ml	サーステッド農業ウント株式会社	72,691
細胞培養マイクロプレート、96 WELL、PS、F-BOTTOM	Greiner	655073
FreezeDryer Epsilon 1-6D、	Christ, Osterode am Harz, ドイツ
共焦点レーザー走査型顕微鏡	Carl Zeiss AG、Oberkochen、ドイツ
Zenソフトウェアバージョン2012 Sp1、ブラックエディション、407バージョン8,1,0,484	Carl Zeiss AG、オーバーコッヘン、ドイツ
GSA Imaga Analyzerソフトウェア、GSAイメージアナライザー、GSA、バージョン419 3.8.7	GSA GmbH