方法論記事

細胞分化中のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路の光媒介可逆的調節アフリカツメガエル胚発生

DOI：

10.3791/55823

⸱

2017年6月15日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Comparative Biosciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Center for Biophysics and Quantitative Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign

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この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、細胞分化およびアフリカツメガエル胚発生の間にマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）活性を調節するための光発生戦略を記載する。この方法は、哺乳動物細胞培養物およびアフリカツメガエル胚のような多細胞生きている生物において、高い空間的および時間的分解能を有するMAPKシグナル伝達経路の可逆的活性化を可能にする。

要約

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キナーゼ活性は、細胞増殖、分化、移動、およびアポトーシスを含む多数の細胞機能にとって重要である。初期胚発生の間、キナーゼ活性は非常に動的であり、胚全体に広がっている。薬理学的アプローチおよび遺伝的アプローチは、キナーゼ活性をプローブするために一般的に使用される。残念なことに、これらの戦略を使用して優れた空間的および時間的解像度を達成することは困難です。さらに、生細胞および多細胞生物において可逆的様式でキナーゼ活性を制御することは実現可能ではない。そのような制限は、発達および分化の間のキナーゼ活性の定量的理解を達成するためのボトルネックのままである。この研究は、光活性化可能タンパク質シロイヌナズナクリプトクローム2（CRY2）およびクリプトクローム相互作用塩基性ヘリックスループヘリックス（CIBN）のN末端ドメインを含むバイシストロン系を利用する光発生戦略を提示する。リバーシマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）シグナル伝達経路の活性化は、生細胞における光媒介タンパク質転位を介して達成される。このアプローチは、哺乳類の細胞培養物および生きている脊椎動物の胚に適用することができる。このバイシストロン系は、類似の活性化機構を有する他のキナーゼの活性を制御するために一般化され、他のモデル系にも適用することができる。

概要

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増殖因子は、増殖、分化、遊走、およびアポトーシスを含む広範囲の細胞機能に関与し、胚発生、老化および精神状態の調節1,2,3,4,5などの多くの生物学的事象において中心的な役割を果たす。 5 。多くの増殖因子は、複雑な細胞内シグナル伝達カスケードを介してシグナル伝達する。これらのシグナル伝達事象は、しばしば可逆的なタンパク質リン酸化によって正確に制御された様式で操作される6,7。従って、タンパク質リン酸化を担うプロテインキナーゼのシグナル伝達結果の理解は基本的に重要である。

異なる成長因子は、それらがdistを刺激するにもかかわらず、むしろ一般的な細胞内シグナル伝達ネットワークを介して作用するinct細胞応答8,9 。レセプターチロシンキナーゼの一般的な細胞内メディエーターには、Ras、Raf、細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）/ ERKキナーゼ（MEK）、ホスホイノシチド3-キナーゼ（PI3K）、AktおよびホスホリパーゼCガンマ（PLCγ） 10,11 。シグナリングの多様性および特異性は、シグナル伝達活性の空間的および時間的調節に依存することが示唆されている12 。例えば、ラット褐色細胞腫細胞（PC12）において、細胞増殖をもたらす表皮成長因子（EGF）刺激は、ERK経路を一時的に活性化する9 。一方、細胞分化につながる神経成長因子（NGF）による刺激は、ERK経路を持続的に活性化させる9,13。培養rにおいて海馬ニューロンでは、脳由来神経栄養因子（BDNF）による一過性シグナル伝達が原発性神経突起伸長を促進するが、持続シグナル伝達は神経突起分岐の増加14につながる。初期胚発生の間、リン酸化されたERK活性は時間的に動的であり、胚6に広がっている。初期のアフリカツメガエル胚発生中の最近の遺伝子スクリーニングでは、下流の原発性増殖因子経路の2つのERKおよびAktシグナル伝達カスケードがステージ特異的活性化プロファイルを示すことが示された7 。したがって、キナーゼシグナル伝達結果の理解は、十分な分解能でキナーゼ活性の空間的および時間的特徴を調べることができるツールを必要とする。

開発中のシグナル伝達の動的性質を調べるための従来の実験的アプローチは、望ましい空間的および時間的解像度を欠く。例えば、薬理学的アプローチは、細胞または組織中のシグナル伝達を刺激または抑制するための生体分子または生体分子である。これらの小分子の拡散性は、その作用を特定の関心領域15に制限することを困難にする。遺伝的アプローチ（ 例えば、遺伝子導入、Cre-Loxシステム、または突然変異誘発）は、しばしば標的遺伝子発現またはタンパク質活性の不可逆的な活性化または抑制を導く16,17,18。 Tet-On / Tet-Offシステム19は、遺伝子転写の改善された時間的制御を提供するが、テトラサイクリンの拡散に依存するため、厳密な空間制御を欠いている。化学的に誘導されたタンパク質二量体化20または光未結合化21,22,23,24の最近の進展は、シグナリングネットワークの時間的制御を可能にする。しかしながら、空間制御は、ケージド化学物質の拡散性のために依然として困難である。

タンパク質 - タンパク質相互作用を制御するために光のパワーを利用する最近の出現するオプトジェネティックアプローチは、高い時空間精度および可逆性を有するシグナル伝達経路の調節を可能にする。ニューロンの発火を制御する初期の成功の直後に、遺伝子の転写、翻訳、細胞遊走、分化、およびアポトーシスなどの他の細胞プロセスを制御するためにオプトジェネティクスが拡張されている28,29,30,31,32,33 、 34 。 pを使った戦略（CRY2）タンパク質とクリプトクローム相互作用塩基性ヘリックスループヘリックス（CIBN）のN末端ドメインは、最近、哺乳動物細胞およびアフリカツメガエル胚のRaf1キナーゼ活性を制御するために開発された35 。 CRY2は、青色光刺激によりCIBNに結合し、CRY2 / CIBNタンパク質複合体は暗所で自発的に解離する。青色光は、CRY2補因子、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）を励起し、これはCRY2の構造変化およびその後のCIBNへの結合をもたらす。 CRY2 W374A突然変異体は光とは無関係にCIBNに結合するが、CRY2 D387A突然変異体は青色下でCIBNに結合しないが、CRY2の構成的に活性な（W374A）突然変異体およびフラビン欠損（D387A）突然変異体は、軽い刺激36,37 。私が記述した光発生系このプロトコールは、野生型CRY2およびCIBNを用いて、生存細胞におけるタンパク質転位置媒介性Raf1活性化を誘導する。 Raf1の膜動員がその活性を増強することが知られている38 。このシステムでは、タンデムCIBNモジュールが原形質膜に固定され、CRY2-mCherryがRaf1 35の N末端に融合される。青色光が存在しない場合、CRY2-mCherry-Raf1は細胞質にとどまり、Raf1は不活性である。青色光刺激は、CRY2-CIBN結合を誘導し、Raf1が活性化される原形質膜にRaf1を動員する。 Raf活性化は、Raf / MEK / ERKシグナル伝達カスケードを刺激する。 CRY2-およびCIBN-融合タンパク質の両方は、バイシストロン性の遺伝子系においてコードされる。この戦略は、Aktのような他のキナーゼを制御するために一般化することができ、その活性化状態は細胞39内のタンパク質転座によってもターンオンすることができる。この研究は、哺乳動物細胞培養におけるこの光発生戦略を実施するための詳細なプロトコールを提示するresおよび多細胞生物である。

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プロトコル

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動物研究は、イリノイ州研究所動物衛生管理委員会（IACUC）およびイリノイ大学動物資源学部（DAR）が定めたガイドラインに従って行われた。

1. BHK21哺乳動物細胞培養におけるタンパク質局在の光発生誘発

注：ステップ1.1-1.3は、典型的には短い作動距離を有する高倍率対物レンズ（ 例えば、 63Xまたは100X）で画像化するために細胞培養チャンバーを組み立てる方法を提供する。これらの目的は、イメージング基板として薄いガラスカバースリップ（ 例えば、 ＃1.5,170μmの厚さ）を必要とする。あるいは、ガラス底細胞培養皿/スライドを使用することができる。そのような場合、ステップ1.1-1.3はスキップすることができます。

  1. ガラスカバースリップのクリーニング
    1. カバースリップホルダーに30枚のガラスカバースリップを置きます。
    2. 600mLのプラスチックビーカーに、20gの洗剤と400mLの暖かい水道水を加えます。プラックマグネチックスターラーでビーカーに加え、すべての洗剤が溶解するまで攪拌する。ティッシュペーパーを使用してフォームを取り外します。
    3. 100mm×15mmペトリ皿の底を攪拌棒からのスペーサーおよびカバースリップホルダーの表面として使用する。洗浄プロセス中に適切な流れを維持するために、ペトリ皿に3-4の排水孔を作ってください。
    4. 排水穴を作るには、はんだこてを加熱し、換気フード内でプラスチックに焼き付けます。
      注意：加熱されたはんだこてを素手で触れないでください。
    5. ビーカー内のペトリ皿上にカバースリップホルダーを置きます。室温で2時間〜一晩撹拌する。
    6. 500mLの脱イオン水で1000mLのビーカーで3回洗浄する。洗剤溶液は再使用することができます。
    7. 鉗子を使用して個々のカバースリップを拾います。カバースリップを190プルーフ（95％）エタノールに1分間浸します。
    8. カバースリップを滅菌フード内で乾燥させる。使用するまでカバースリップを滅菌プラスチック容器に入れて保管します。
  2. ポリ-L-リジン（PLL）コーティングされたカバースリップの作製
    1. ホウ酸1.24gと四ホウ酸二ナトリウム1.9gを400mLの水に溶解して0.1Mのホウ酸塩緩衝液を調製する。 10M NaOHでpHを8.5に調整する。
    2. PLLをボレート緩衝液に溶解して最終濃度を1mg / mLにする。 50 mLの滅菌遠心チューブに分注します。
    3. 10cmの組織培養皿に50mLのPLLコーティング溶液を加える。 PLL溶液を温めるために37℃のインキュベーターに皿を置きます。
    4. 滅菌フードでカバーガラス容器（ステップ1.1.8）を開きます。
    5. 洗浄したカバースリップを、組織培養皿内の予め加温したPLL溶液に1つずつ浸します。すべての表面を浸してください。
    6. 一晩37℃のCO 2インキュベーターにカバースリップを入れて皿を置きます。各coverslipを取り出し、滅菌カバースリップホルダーに置きます。オートクレーブした超純水（18.2MΩおよび＃183; cmの抵抗率）を滅菌フード内の1000mLビーカーに入れた。
    7. 滅菌フード内のカバースリップホルダー内でカバースリップを乾燥させる。使用するまでカバースリップを滅菌プラスチック容器に入れて保管します。
  3. ポリジメチルシロキサン（PDMS）細胞培養チャンバーの組み立て
    1. プラスチック容器内で、40gのPDMSベースを秤量し、4gの硬化剤を添加して、PDMSおよび硬化剤の10：1w / w比を達成する。ピペットチップで2分間攪拌してPDMS /硬化剤を混合する。あるいは、遠心ミキサーを使用してください。
    2. 鋳型として直径4インチのビーカーを使用して、アルミホイルのホルダーを作成します。アルミニウムホイルホルダーを15cmのペトリ皿に置きます。このアルミホイルホルダー内に4インチのシリコンウェーハを置きます。
    3. 混合したPDMS溶液をホルダーに注ぎます。薄いガラス棒を使用して、ウェーハのエッジに静かに触れてください。ウェーハの下に閉じ込められた気泡を取り除きます。
    4. 15cmのペトリ皿を真空チャンバーに挿入するPDMS溶液を脱気する。気泡が発生しなくなるまで、約20分間脱気を続ける。その間に、対流オーブンを65℃に予熱してください。
    5. 慎重に15cmペトリ皿をオーブンの中に置きます。 2時間インキュベートする。
    6. プレートをオーブンから取り出します。ガラスロッドを使用して、PDMSの端に穏やかに触れ、完全に架橋するようにします。そうでない場合は、PDMSがしっかりと固着しなくなるまで、長くインキュベートしてください。
    7. プレートからアルミニウム箔を取り出し、シリコンウェーハから剥がします。エッジから出発して、硬化したPDMSをシリコンウェーハから注意深く剥離する。
      注意：ウェハを破損する可能性があるため、あまりにも大きな力をかけないでください。
    8. PDMSを20mm×30mmの長方形の片に切り、24mm×40mmのカバースリップにカミソリの刃をはめてください。
    9. チゼル状のブレードを使用して、各PDMSピースの中央から10 mm x 20 mmの長方形の開口部を切断します。
    10. 手順1.1で説明した洗剤プロトコルを使用してPDMSチャンバーを洗浄します。
    11. 清浄なフード内でPDMSチャンバを乾燥させる。アルミ箔で覆われたオートクレーブ可能な容器に乾燥チャンバーを置きます。
    12. 容器を重力（121℃、15psi）で30分間オートクレーブし、容器を室温で保存する。
  4. BHK21細胞の培養およびトランスフェクション
    1. BHK21細胞培養用の培地500 mLを、FBS50 mLと100×Penn-Strep-Glutamine（10,000 U / mLペニシリン、10 mg / mLストレプトマイシン、および29.2 mg / mL L -グルタミン）。 FBSの最終濃度が10％であることを確認する。
    2. 生存細胞イメージング用の非HEPES CO 2非依存性培地10mLを分注する。
      注記：CO 2非依存性培地は、CO 2インキュベータなしで細胞増殖を支援し、大気条件下で細胞を撮像するのに理想的である。詳細については、材料リストを参照してください。 BHK21細胞系に加えて、他のタイプの哺乳動物細胞もまた、同様の結果。
    3. 1つのオートクレーブされた滅菌PDMSチャンバー（ステップ1.3）を滅菌フード内の滅菌PLL被覆カバースリップ（ステップ1.2）に置くことによって、細胞培養装置を組み立てる。
    4. 各デバイスを滅菌60 mmのペトリ皿に置きます。
    5. 0.25％トリプシン0.5 mLを使用して、12ウェル組織培養プレートの1つのウェルから細胞を剥がす。血球計算盤で細胞密度を数える。 200μLの細胞培養培地を用いて、チャンバー内に20,000のBHK21細胞（約10,000細胞/ cm 2 ）をプレートする。
    6. プラスミド調製キットでDNAプラスミドを調製します（材料リストを参照）。
      注：CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaXの設計と機能は図1A - 1Bに示されています。
    7. 細胞プレーティングから24時間後、CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaXプラスミド50-100ngを製造者のプロトコールに従ってトランスフェクションする。
    8. トランスフェクションの3時間後、mエチジウムを新鮮な培養培地200μLに添加し（ステップ1.4.1）、培養物を37℃、5％CO 2インキュベーター中でインキュベートすることによって、細胞を一晩回復させる。
  5. 蛍光生細胞イメージング
    1. コンピュータ、光源、顕微鏡、カメラの電源を入れます。プロトコルの残りの部分については、共焦点蛍光顕微鏡（100倍の油浸対物レンズを備えています）を使用してください。
      注：倒立落射蛍光顕微鏡を使用することもできます。
    2. 200μLのCO 2非依存性培地で細胞培養培地を交換する。
    3. 顕微鏡に細胞を置く前に、データ取得プロトコルを設定してください。光発生刺激には488 nm励起FITCチャンネルを使用します。トランスフェクトした細胞の位置を特定し、mCherry標識タンパク質の細胞局在を追跡するために、561 nm励起TRITCチャネルを使用します。
    4. FITCおよびTRITCチャンネルのゲインをそれぞれ120および200に設定します。 2.2のピクセル滞在時間を使用する1; sおよび512 x 512ピクセルのサイズ。
    5. 対物窓にパワーメータを近づけて、488 nm光のパワーを測定します。 CIBN-CRY2PHR会合を誘発するには、2μW（焦点で約10,000W / cm 2 ）の総出力で十分である。
    6. 5秒の間隔と2分間の合計取得時間でタイムスタンプの取得を設定します。
    7. 目的の窓に適切な屈折率整合材（浸漬油）を塗布する。位相コントラストモードを使用して、カバーガラス表面のセルに焦点を合わせます。
    8. 顕微鏡ステージを動かすことにより、561nmの光の下でトランスフェクションされた細胞を見つける。
      注意：光活性化可能なタンパク質間の会合を活性化するので、このステップでは青色光を使用しないでください。
    9. トランスフェクションされた細胞が見つかると、データ取得を開始します。
      注：正常にトランスフェクトされた細胞は、FITC（2CIBN-GFP-CaaX由来）およびTRITC（CRY2-mCherry-Raf1）チャネルの両方で蛍光を示すはずである（ 図1C-D
    10. FITCおよびTRITCチャンネルの両方に一連のタイムスタンプ付き画像を記録する（ 図1D ）。
    11. CRY2-CIBNタンパク質複合体の自発的解離をプローブするために、Txredチャネル単独で20秒間、30秒間隔で別のタイムスタンプを記録する。
    12. データ解析のためにタイムスタンプ付きの画像を保存します。
  6. 画像解析
    1. 画像40から強度を抽出することができる画像分析ソフトウェアを用いて画像を開く。
    2. 2つの代表的なスナップショットを選択してください：1つは青色光の露光前、もう1つは青色光の後の露光です。
    3. バックグラウンド、原形質膜、および細胞質にまたがる細胞を横切る線を描く。この線に沿って強度を投影します。値を保存し、それらをプロットして露光前後の差を比較します（ 図1D ）。
    4. タンパク質結合の動力学を分析するために、セレク細胞膜における1つの代表的な関心領域（ROI）、細胞質における1つのROI、およびバックグラウンドにおける1つのROIを含む。
    5. 画像スタックの原形質膜（I PM ）、細胞質（I CYT ）、およびバックグラウンド（I BKD ）の平均強度を取得する。
    6. 以下の式を使用して各画像の膜/細胞質ゾル強度の比を計算する：
      figure-protocol-1
    7. 比対時間をプロットし、CRY2-CIBN（ 図1E -F ）の結合動態または解離動態を決定する。

2. CO 2インキュベータにおける長期光刺激用LEDアレイの構築

注：実験設定の全体図は図2Aに示されています。

  1. 2つのパン生地に12個の青色LEDを挿入してLEDアレイを作ってください電流制限抵抗を接続します。
    注：30 Vの電源では、4個のLEDを直列に接続することができ、電流制限抵抗によって輝度を制御することができます。
  2. ブレッドボードをアルミボックスに入れます。
    注：アルミニウムボックスの高さは2インチにする必要があります。この高さは、発散光スポットのサイズが1つのウェルのサイズと同じであるため、12ウェル組織培養プレートの照明に最適です。
  3. 2本の金属線を使用して電源に接続してください。ライトボックスがCO 2インキュベーターの中に置かれているときは、電線の長さが十分であることを確認してください。
  4. ライトボックスのカバーには透明な光拡散板を使用してください（ 図2C ）。
  5. 電圧入力の範囲で各LEDの出力を較正します。 24時間のPC12細胞分化アッセイには、0.2mW / cm 2の出力を使用する。生きているアフリカツメガエルの胚または外植片に5mW / cm 2のパワーを使用するアッセイ。

PC12細胞分化の光発生誘導

  1. 細胞培養およびトランスフェクション
    1. F12K 407.5mLとウマ血清75mLとFBS12.5mL + 100×Penn-Strep-Glutamine（ウマ血清およびFBSの最終濃度）5mLを混合することにより、ラット褐色細胞腫（PC12）細胞培養用培地500mLを調製する。 ：それぞれ15％および2.5％）。 99容量のF12K培地に1倍量の完全培地を混合することにより低血清培地を作成する。
    2. 300,000細胞/ウェルまたは75,000細胞/ cm 2の密度で12ウェルプレート中のプレートPC12細胞。
    3. 細胞プレーティングの24時間後にCRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaXで細胞をトランスフェクションする（ステップ1.4.7と同様）。各ウェルに1.2μgのDNAを使用する。 5％CO 2を補充した37℃インキュベーター内で細胞を培養培地中で一晩回復させる。トランスフェクションの16時間後にトランスフェクション効率を確認してください。
      注：30〜50％トランスフェクション・エフェクト十分な細胞数を確保するためには十分な成果が得られるはずです。
    4. トランスフェクションの24時間後に培地を低血清培地に交換する。 12ウェルプレートの1ウェルあたり1 mLの培地を使用する。
  2. 光誘発PC12細胞分化
    1. CO 2インキュベーターにLEDアレイを置きます。 1対のワイヤを使用して電源に接続します。 LEDの電力を0.2 mW / cm 2に設定します。トランスフェクトされたPC12細胞を含む12ウェルプレート（ステップ3.1.3）をLEDアレイのウィンドウ上に置く。 5％CO 2を補充した37℃インキュベーターで24時間連続照明を照射する。
  3. 蛍光生細胞イメージング
    1. 顕微鏡とサンプルの準備については、1.5.1-1.5.4の手順に従ってください。
    2. シングルスナップショットのデータ収集を設定します。 GFPチャネルとTxredチャネルの両方に200ミリ秒を使用します。
    3. トランスフェクションされた細胞の画像をGFPおよびTxredの両方のチャンネルでキャプチャします。約200細胞を記録する各条件についてls。データ分析のためにファイルを保存します。
  4. 画像解析
    1. トランスフェクトされた細胞の総数に対する分化細胞のパーセンテージを数えます。
    2. 細胞を数えるには、画像分析ソフトウェアの任意の細胞計数モジュールを使用します。
    3. 分化した細胞を手動で数える。
      注：分化した細胞は、少なくとも1つの神経突起が細胞体よりも認識可能に長いものと定義される（ 図 3A〜3B ）。
    4. 未分化細胞を用いてステップ3.4.3を繰り返す。
    5. 次の式を使用して微分比を計算します。
      figure-protocol-2

4. アフリカツメガエル胚におけるキナーゼ活性の光発生制御

  1. 緩衝液の調製
    1. 1X Marc's Modified Ringer（MMR）の1Lを調製する：100mMNaCl、2mMのKCl、1mMのMgCl 2、2mMのCaCl 2 、および5mMのHEPES; pH 7.5。
  2. mRNAの調製
    1. CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaXプラスミドDNA（2μg）を1μLのApaI（50 unit）で37℃で2時間消化します。
    2. 線状化したDNAを60μLの100％エタノールで沈殿させます。室温で5分間12,000×gで回転させてDNAをペレット化する。慎重に上清を除去し、70％エタノール60μLで再度ペレットを洗浄する。 12,000×gで室温でさらに5分間スピンします。慎重に上清を除去し、6μLのRNaseフリーH 2 OでDNAペレットを再懸濁する。
    3. 1μgの線状化DNAを2μLのSP6 RNAポリメラーゼ、リボヌクレオチド混合物（10mM ATP、CTP、およびUTP; 2mM GTP;および8mMキャップ類似体）2μLと20μLのヌクレアーゼ -室温で1時間自由水を加える。
    4. Dを削除するNAテンプレートを37℃で少なくとも15分間DNase Iで消化し、シリカ膜スピンカラムを使用して合成RNAを精製します。
    5. 30μLのヌクレアーゼフリー水と30μLのLiCl沈殿溶液を添加して反応を停止し、RNAを沈殿させます。徹底的に混合し、-20℃で30分間冷却する。
    6. 12,000×gで15分間4℃で遠心分離し、RNAをペレット化する。
    7. 慎重に上清を除去する。 RNAを1 mLの70％エタノールで1回洗浄し、40μLのヌクレアーゼフリー水に再懸濁する。
    8. スピンカラムに40μLのRNAをロードする。取り込まれていないヌクレオチドとキャップを除去するために、12,000×gで1分間4℃で遠心分離する。
  3. アフリカツメガエルの胚
    1. Sive らによって記載されたプロトコールに従う。 アフリカツメガエルの胚を得る。
  4. mRNAマイクロインジェクション
    1. 製作するキャピラリープラーでガラスキャピラリーを引っ張ることによるマイクロインジェクション用の針。プーリングプログラムをheat = 355、pull strength = 80、velocity = 50、time = 100に設定します。
    2. ゼリーコートを3％システイン（0.2x MMRで希釈）で処理することにより胚から除去する。
    3. 胚をマイクロインジェクションのために3％ポリスクロースおよび0.5x MMR溶液に移す。 CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX RNAを各胚に500ng〜1ng注入する。
      注：1 ng以上の用量の注射は、青色光非依存性のMAPKシグナル伝達の活性化をもたらす。
  5. キナーゼ活性の光発生刺激
    1. 培養は、3％ポリスクロース、室温で0.5×MMR溶液中の胚をミッド胃吻合段階（段階12）に達するまでマイクロインジェクションした。次に、0.2x MMR溶液で胚を培養する。
    2. 胚または外植片を12ウェルプレートに移す。 12ウェルプレートを自宅で作成したLEDアレイ（ステップ2.5）に置き、青色 - 白色t（475nm）処理。
    3. 胚または外植片の完全な青色照明を確実にするために、12ウェルプレートの上部に鏡を置く。
    4. 青色光の出力を5 mW / cm 2に調整します。
      注：ブルーライト処理は、3％ポリスクロース、0.5x MMR溶液、または0.2x MMR溶液のいずれかの所望の時点で行うことができる。
    5. 任意の時間に胚を収穫する。組織学的、ウエスタンブロット、または遺伝子発現解析に使用してください。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

光活性化可能なタンパク質対のレシオメトリックな発現： 図1Aは、ブタ・テスコビルム（teschovirum）由来の二重特異性光学原性構築物であるCRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX（CRY2-2A-2CIBNと呼ばれる） 1 2A（P2A）ペプチドであり、哺乳動物細胞株42の中で最も高いリボソームスキッピング効率を示す。以前の研究では、CIBN-GFP-CaaX：CRY2-mCherry-Raf1の最適比は2：1であることが判明した35 。この構成は、CRY2-mCherry-Raf1（ 図1B ）の十分な膜補充および活性化を可能にする。 CRY2-2A-2CIBNを単独でトランスフェクトした細胞は、落射照明下（ 図1C ）または共焦点顕微鏡下（

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ディスカッション

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ライトボックスを構築するときは、個々のLEDのパワーを測定する必要があります。以前の経験に基づいて、出力のばらつきは、製造ばらつきのために個々のLEDによって異なることがあります。お互いの電力出力が10％以内のLEDセットを選択します。 LEDの数、電流制限抵抗、および電源入力は、異なるタイプの細胞培養容器（ 例えば、 6ウェルまたは24ウェルプレート）に対して変更することができる。 0.2mW / cm 2の出力での24時間の光照射は、検出可能な光毒性44を誘発しない。より高い電力が使用される場合は、間欠的な光を使用して発熱と光毒性を低減することを検討してください。このプロトコールで導入された光発生系は、2つの隣接する光パルスの間の暗い間隔が45分未満である場合、連続的な光刺激に匹敵する断続的光刺激下でのPC12細胞における神経突起伸長を誘導する44 。支払期日タンパク質の会合および解離の動力学における本質的な相違に対して、光パルス間の持続時間は、各固有のタンパク質対について調整されなければならない。...

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開示事項

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著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

謝辞

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この研究は、イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校（UIUC）および国立衛生研究所（NIGMS R01GM111816）の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ガラスカバースリップ VWR48393 230ライブセルイメージング用基板
カバースリップホルダー ニューカマーサプライ6817Bカバースリップ用ホルダー
洗剤 ThermoFisher16 000 104カバースリップのクリーニング用
ホウ酸 Sigma-AldrichB6768-500GPLLバッファー製造用
ホウ酸二ナトリウムSigma-Aldrich71996-250G製造用 PLLバッファー
プラスチックビーカーNalgene1201-1000カバースリップのクリーニング用
水酸化ナトリウム Sigma-Aldrich221465-2.5KGpH調整用
ポリ-L-リジン臭化水素酸塩Sigma-AldrichP1274-500MGコーティング用 カバースリップ
ジエチルピロカーボネート(DEPC)処理水サーモフィッシャー サイエンティフィック750024DNA調製用
カバーガラス鉗子テッド・ペラ5645カバーガラスの取り扱い
ティッシュカットルアーディッシュサーモフィッシャー12565321細胞培養皿
滅菌遠心チューブサーモフィッシャー12-565-271バッファー保存
トランスフェクション試薬サーモフィッシャーR0534トランスフェクション
CO2非依存培地サーモフィッシャー18045088ライブセルイメージング用
ポリジメチルシロキサン(PDMS)エルスワース 接着剤184 SILエラストキット 0.5KGフォームメイクセルチャンバー
プラスミド MaxiprepキットQiagen12965プラスミド調製
DMEM培地サーモフィッシャー11965-084細胞培養培地成分
F12K培地サーモフィッシャー21127022細胞培養培地成分
馬血清サーモフィッシャー16050122細胞培養培地成分
ウシ胎児血清Signa-Aldrich12303C-500 mL細胞培養培地成分
ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミンサーモフィッシャー10378016細胞培養培地成分
トリプシン (0.25%)、フェノールレッドサーモフィッシャーサイエンティフィック15050065 哺乳類細胞の解離に
アガローフィッシャー サイエンティフィックBP1356-100DNA調製用
Ficoll PM400GE Heathcare Life Sciences17-5442-02胚緩衝液用
L-システイン塩酸塩一水和物Sigma-Aldrich1.02839.0025卵母細胞調製
ApaIThermoFisherFD1414プラスミドの直鎖化用
Dnase IThermoFisherAM2222in vitro転写アッセイにおけるDNAテンプレートの除去用
インデックスマッチ材料(液浸油)ThorlabsMOIL-20LNサンプル基板と対物レンズとの間のインデックスマッチング用
青色LEDAdafruit301光遺伝学的刺激用光源
抵抗器キットAmazonEPC-103電流制限抵抗器
アルミボックスバドインダストリーAC-401ライトボックス 
ブレッドボードJekewin837654333686LEDアレイ作成用
フックアップワイヤーElectronix Express27WK22SLD25LEDアレイ作成用
リレーモジュールJbtekSRD-05VDC-SL-C間欠光制御用
DC電源 TMSDCPowerSupply-LW-(PS-305D)LEDシリコン用電源
 電源 ヘッドThorlabsS121C光量測定用
パワーメーターThorlabsPM100D 光強度測定用
顕微鏡ライカバイオシステムズDMI8ライブセルイメージング用
バイオセーフティキャビネットサーモフィッシャー1300 シリーズ A2哺乳類細胞の取り扱い用
CO2インキュベーター サーモフィッシャーアイソテンプ哺乳類細胞培養用
ステレオ顕微鏡ライカM60胚のマイクロマニピュレーション用
マイクロインジェクターナリシゲIM300胚マイクロインジェクション用
マイクロピペットプーラーSutter InstrumentsP87ニードルプラー
in vitro転写キットサーモフィッシャーAM1340in vitro転写用。このキットには、ヌクレアーゼフリーの水、SP6 RNA ポリメラーゼ、リボヌクレオチド混合物、キャップアナログ、チョライドリチウム沈殿液、スピンカラム  
RNA精製キットQiagen74104合成RNAの精製用シリカ膜スピンカラム 
コンベクションオーブンMTI株式会社 EQ-DHG-9015PDMS硬化
遠心ミキサー・テフロン容器THINKYAR310PDMS混合用
シリコンウェーハUniversityWafer452PDMS製造用ベース  デバイス
ブレードテクニエッジ01-801PDMS
キャピラリーガラス用 サッター機器BF100-58-10注入針の製作用 
四ス ズ 型切断

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schlessinger, J., Ullrich, A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 9 (3), 383-391 (1992).
  2. Thisse, B., Thisse, C. Functions and regulations of fibroblast growth factor signaling during embryonic development. Dev Biol. 287 (2), 390-402 (2005).
  3. Perrimon, N., Pitsouli, C., Shilo, B. Z. Signaling mechanisms controlling cell fate and embryonic patterning. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a005975(2012).
  4. Salles, F. H., et al. Mental disorders, functional impairment, and nerve growth factor. Psychol Res Behav Manag. 10, 9-15 (2017).
  5. Basson, M. A. Signaling in cell differentiation and morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (6), (2012).
  6. Schohl, A., Fagotto, F. beta-catenin, MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
  7. Zhang, S. W., Li, J. J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8 (11), e79469(2013).
  8. Sweeney, C., et al. Growth factor-specific signaling pathway stimulation and gene expression mediated by ErbB receptors. J Biol Chem. 276 (25), 22685-22698 (2001).
  9. Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80 (2), 179-185 (1995).
  10. Vandergeer, P., Hunter, T., Lindberg, R. A. Receptor Protein-Tyrosine Kinases and Their Signal-Transduction Pathways. Annu Rev Cell Biol. 10, 251-337 (1994).
  11. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  12. Hunter, T. Signaling--2000 and beyond. Cell. 100 (1), 113-127 (2000).
  13. Qiu, M. S., Green, S. H. PC12 cell neuronal differentiation is associated with prolonged p21ras activity and consequent prolonged ERK activity. Neuron. 9 (4), 705-717 (1992).
  14. Ji, Y., et al. Acute and gradual increases in BDNF concentration elicit distinct signaling and functions in neurons. Nat Neurosci. 13 (3), 302-309 (2010).
  15. Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area. Int Rev Cytol. 192, 189-221 (2000).
  16. Sauer, B. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 14 (4), 381-392 (1998).
  17. Ling, M. M., Robinson, B. H. Approaches to DNA mutagenesis: an overview. Anal Biochem. 254 (2), 157-178 (1997).
  18. Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214 (2-3), 91-109 (2010).
  19. Wanka, F., et al. Tet-on, or Tet-off, that is the question: Advanced conditional gene expression in Aspergillus. Fungal Genet Biol. 89, 72-83 (2016).
  20. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
  21. Liu, Q. Y., Deiters, A. Optochemical Control of Deoxyoligonucleotide Function via a Nucleobase-Caging Approach. Accounts of Chemical Research. 47 (1), 45-55 (2014).
  22. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  23. Gautier, A., Deiters, A., Chin, J. W. Light-activated kinases enable temporal dissection of signaling networks in living cells. J Am Chem Soc. 133 (7), 2124-2127 (2011).
  24. Nguyen, D. P., et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. J Am Chem Soc. 136 (6), 2240-2243 (2014).
  25. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  26. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  27. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  28. Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends in Biotechnology. 33 (2), 92-100 (2015).
  29. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (8), 551-558 (2014).
  30. Kim, B., Lin, M. Z. Optobiology: optical control of biological processes via protein engineering. Biochemical Society Transactions. 41 (5), 1183-1188 (2013).
  31. Tucker, C. L. Manipulating cellular processes using optical control of protein-protein interactions. Prog Brain Res. 196, 95-117 (2012).
  32. Toettcher, J. E., Gong, D. Q., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light Control of Plasma Membrane Recruitment Using the Phy-Pif System. Method Enzymol. 497, 409-423 (2011).
  33. Zoltowski, B. D., Gardner, K. H. Tripping the light fantastic: blue-light photoreceptors as examples of environmentally modulated protein-protein interactions. Biochemistry. 50 (1), 4-16 (2011).
  34. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  35. Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
  36. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 Interacts with CIB1 to Regulate Transcription and Floral Initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  37. Li, X., et al. Arabidopsis cryptochrome 2 (CRY2) functions by the photoactivation mechanism distinct from the tryptophan (trp) triad-dependent photoreduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20844-20849 (2011).
  38. Leevers, S. J., Paterson, H. F., Marshall, C. J. Requirement for Ras in Raf Activation Is Overcome by Targeting Raf to the Plasma-Membrane. Nature. 369 (6479), 411-414 (1994).
  39. Kohn, A. D., Takeuchi, F., Roth, R. A. Akt, a pleckstrin homology domain containing kinase, is activated primarily by phosphorylation. J Biol Chem. 271 (36), 21920-21926 (1996).
  40. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  41. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  42. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556(2011).
  43. Ishimura, A., et al. Oncogenic Met receptor induces ectopic structures in Xenopus embryos. Oncogene. 25 (31), 4286-4299 (2006).
  44. Zhang, K., et al. Light-Mediated Kinetic Control Reveals the Temporal Effect of the Raf/MEK/ERK Pathway in PC12 Cell Neurite Outgrowth. PloS one. 9 (3), e92917(2014).
  45. Mohanty, S. K., Lakshminarayananan, V. Optical Techniques in Optogenetics. J Mod Opt. 62 (12), 949-970 (2015).
  46. Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature chemical biology. 12 (6), 425-430 (2016).
  47. Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6, 6256(2015).
  48. Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
  49. Chang, K. Y., et al. Light-inducible receptor tyrosine kinases that regulate neurotrophin signalling. Nat Commun. 5, 4057(2014).
  50. Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140 (7), 1605-1613 (2013).
  51. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PLoS One. 7 (11), e50738(2012).
  52. Buckley, C. E., et al. Reversible Optogenetic Control of Subcellular Protein Localization in a Live Vertebrate Embryo. Dev Cell. 36 (1), 117-126 (2016).
  53. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  54. Beyer, H. M., et al. Red Light-Regulated Reversible Nuclear Localization of Proteins in Mammalian Cells and Zebrafish. ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).

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CRY2 CIBNLED

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