方法論記事

生細胞測定の嗅覚受容体活性化アッセイを用いた、リアルタイム キャンプ

DOI：

10.3791/55831

⸱

2017年10月2日

 ,  ,  , 
1Department of Pathophysiology, Key Laboratory of Cell Differentiation and Apoptosis of National Ministry of Education, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 3Department of Neurobiology, Duke Institute for Brain Sciences, Duke University Medical Center, 4Institute of Health Science, Chinese Academy of Science/Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

嗅覚受容体の機能を特徴づける deorphanization プロセスの不可欠な部分を提供しています。キャンプの試金を使用してリアルタイムの嗅覚受容体の活性化を測定する手法を提案します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

哺乳類の嗅覚受容体 (OR) 家族の巨大なサイズは、多数の揮発性化学物質の中で、同種の配位子を見つけることの難しさを提示します。効率的かつ正確には、ORs を deorphanize、我々 はリアルタイムでまたは活性化の下流 cAMP の産生を測定する哺乳類 ORs とバイオ センサー遺伝子組み換えプラスミドを表現する異種細胞ラインの使用を組み合わせます。この試金は画面ニオイ Or その逆に対して使用できます。画面から肯定的な嗅覚受容体の相互作用は、様々 な臭気濃度、濃度反応曲線を生成するテストによってその後確認できます。ここも積極的に応じる受容体が関心の化合物の同種の受容体である Hana3A 細胞で発現を行い人間またはライブラリに対して臭気化合物高速スクリーニングを実行するのにこのメソッドを使用します。効率的なまたはアクティブ化を評価する上で信頼性の高いこのハイスループット検出方法がわかったし、我々 のデータまたは機能研究の潜在的な使用の例を提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

嗅覚は、食べ物を得るため、捕食者や危険を避けるため、種を区別、仲間1,2を選択する彼らの嗅覚の能力に依存している動物の生存に重要な役割を果たしています。これらの機能の実現 (OE) の嗅上皮にある嗅覚ニューロン (OSNs) 毛様体表面の表現は個別に嗅覚受容体 (ORs) によって異なります。ORs は、最大約 400 と 1200 多様な OR 遺伝子とヒト G タンパク共役型受容体 (GPCR) スーパーファミリーの家族やマウス、それぞれ3,4,5を構成します。匂いによって活性化される ORs は嗅覚 G タンパク質 (Golf) のシーケンシャルの活性化を介して細胞内 camp を増加につながるし、III アデニル酸シクラーゼ (ACIII) を入力します。メッセンジャーの 1 つ、細胞表面のヌクレオチド依存性チャネルを開き、Ca2 +や活動電位、最終的に開始するなどの陽イオンの流入をトリガーとして機能することが, 細胞内 cAMP の結果増加レベル神経電位伝送と嗅覚。検出および多数 ORs による匂いの識別のプロセスは、嗅知覚6、7の最初のステップと見なされます。

以来、木びき台およびアクセル8は最初正常に嗅覚受容体を複製し、ORs による嗅覚のメカニズムを解明、または家族の deorphanization この分野でのホット スポットの一つとなった。または活性化を測定する各種の体内、体外と体外の方法は、報告された9,10、11,12をされています。Ca2 +イメージングに続いて単一細胞 RT-PCR OSNs でを使用した従来の方法には、脂肪族の匂い13,14,15異なる嗅覚受容体の同定が有効になります。最近では、大規模なトランスクリプトーム解析の出現より体内の高スループット方法の開発を推進しました。ケンタッキーの試金は S100a5 tauGFP レポーター マウスひずみとマイクロ アレイ解析の9使用でオイゲノールとムスコン応答マウス ORs を識別しました。夢テクノロジー匂い暴露後または mRNA のレベルの減少に基づき、脊椎動物や非脊椎動物の種16両でまたはライセンス認証プロファイルを決定するトランスクリプトーム アプローチを採用しました。同様に、神経細胞の活性化で S6 のリン酸化を考えると、松波は応答の ORs12を識別するためにリン酸化リボソーム immunoprecipitations からシーケンスされた Mrna をグループ化します。最後に、ファインスタイン上院議員グループは、においは生体内で、MouSensor 技術17として知られているコーディングを研究するためのプラットフォームとして役立つことができるスーパー スニファー マウスを報告しました。

体外の王国で OSNs を養殖への挑戦はまたは機能発現体内を模した異種発現システムを ORs の臭気化学薬品の大規模スクリーニングを実施する理想的なソリューションになります。それにもかかわらず、ネイティブ OSNs と異なる非嗅覚起源の培養細胞やタンパク質は、小胞体、細胞膜へのトラフィックにできませんが保持されます、ので OR 劣化と受容体機能18の損失で、その結果,19します。 この問題を解決するために広範な作品複製または異種細胞における細胞膜の機能発現に加えられました。Krautwurstらはまずロドプシン (Rho-タグ) の最初 20 のアミノ酸をまたはタンパク質の N 末端に接続し、人間の萌芽期の腎臓 (HEK) セル20いくつかの ORs の細胞表面発現を促進しました。単一 OSNs から遺伝子発現 (セージ) ライブラリ解析のシリアル解析を実施して斎藤ら。最初のクローンされた受容体輸送蛋白質 (RTP) 家族のメンバー、RTP1 と RTP2、または細胞膜に人身売買を促進および拡張 HEK293T 細胞における嗅覚受容体の匂いを介した応答受容体式エンハンサー蛋白質 1 (REEP1)21. これらの調査結果に基づいて、松波グループ正常に Hana3A 細胞株を確立、HEK293T で Gα、REEP1、RTP2 RTP1olf安定発現および一過性発現する効率的なまたは機能のための Rho タグ ORs式です。その後の研究は、1) RTP1、RTP1S より確実を促進またはオリジナルの RTP1 のタンパク質と 2) 3 型ムスカリン性アセチルコリン受容体 (M3R) β アレスチン 2 の抑制を介してまたはアクティビティを高めることができるよりも機能の短いフォームを明らかにどちらの実験を最適化する異種発現システムに導入された募集は22,23を出力します。

いくつかの検出方法は、異種システムの受容体活性化を定量化するために使用されています。分泌される抗胎盤性アルカリホスファターゼ (SEAP) アッセイは、レポーター酵素がキャンプの応答の要素 (クレス) 調節または活性化を評価するための魅力的なオプションを作るそれで動作します。蛍光容易に SEAP 検出試薬24培養後の培地のサンプルで検出されます。このメソッドを使用して、ORs としてアミン関連受容体 (TAARs) がされている OE のトレースで表される化学感覚受容体の二次クラスの機能は、25,26,27を特徴付けられます。別の一般的な方法、ルシフェラーゼ アッセイは、キャンプの応答の要素 (CRE) の制御の下でホタルのルシフェラーゼ レポーターの遺伝子を使用します。ルシフェラーゼ生産によって生成される発光を測定または活性化10、11,28を定量化の効率的かつ堅牢な手段を提供します。

また、リアルタイムのキャンプ アッセイは、異種または内因性の Gpcr の機能を動的に監視で広く使用されています。このような高度な試金の一例では、ルシフェラーゼの変異形に融合 cAMP 結合ドメインを所有している遺伝的コード化バイオ センサーの変形を活用します。キャンプを結合すると、構造変化は化学発光リーダー29,30で測定することができますから発光ルシフェラーゼの活性化に します。リアルタイムのキャンプの技術は、HEK293 NxG 108CC15 細胞におけるひと嗅覚受容体の脱孤立化に適した報告されていますお尻 ="xref"> 31,32,33、HEK293T 由来 Hana3A 同様に細胞34,35。Krautwurst グループでは双方向の大規模なまたはスクリーニングのアプローチ32,33に合うようにリアルタイム キャンプ技術も詳細で説明します。

ここで Hana3A 細胞におけるリアルタイム キャンプの試金を使用してまたは活性化を測定するためのプロトコルについて述べる。30 分治療特定の揮発性化合物と、しにくいまたは活性化のより効率的かつ正確な分析を表すこのプロトコルで事前釣合いの生きているセルの発光を速度論的測定します。長時間と臭気による細胞毒性細胞環境で発生するアーティファクト。このリアルタイム測定興味の特定のまたはリガンド ペアの特性と同様、ORs とリガンドの大規模スクリーニングが可能です。このメソッドを使用して、ことに成功した OR5AN1 ムスク化合物ムスコンの受容体として 379 人間 ORs に対してスクリーニングを実行しその後肯定的なスクリーニング結果を確認します。

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プロトコル

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1 です Hana3A 細胞のメンテナンスと養殖

  1. 10% 牛胎児血清 (FBS)、100 で最低限必要な媒体 (MEM) 10 mL に維持セル μ G/ml ペニシリン-ストレプトマイシン、および 1.25 μ g/mL アムホテリシン B 100 mm。5% CO 2 と 37 ° C 細胞文化のインキュベーターで細胞培養ディッシュ。すべての他の通路に追加プラスミド (を参照してください 導入) の安定したトランスフェクションを維持するために 1 μ g/mL ピューロマイシン
    。 メモ: クラス II 生物学的安全キャビネット滅菌環境を確保するために細胞培養に関連するすべての手順を実行します
    2. 。
  2. 100 mm 料理 2-3 日毎に 10 〜 20% の割合でサブカルチャー
    3. 。

2。Transfection のため細胞をめっき

  1. Hana3A 細胞細胞生存率を確保し、合流を推定する位相差顕微鏡下で観察します
    2. 。
  2. 細胞培養ディッシュからすべての媒体を吸い出しなさい
    3. 。
  3. プレートの上にリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 mL を追加し、料理を旋回、PBS を吸引洗浄セル
    4. 。
  4. は、0.05% トリプシン - エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、プレートの 3 mL を加えます。1 分またはすべてのセルが海上までミックス
    。 注: セルに応じて顕微鏡下にプレートの底からデタッチの進行状況を観察します
    5. 。
  5. MEM 10 %fbs と上下のチャンクを分割するピペット 5 mL を追加することで不活性化トリプシン携帯マサチューセッツ州
    注: トランスフェクション前めっきに使用される媒体を含めないでください抗生物質。抗生物質の添加は、トランスフェクション効率を減らすかもしれない
    6. 。
  6. は、トランスフェクションする板の数に応じて 15 mLl チューブに細胞の適切な量を転送します。各 96 ウェル プレート、プレート 2 x 10 6 セル、または 100% コンフルエント 100 mm ディッシュの約 1/5 は、ウェルあたりよくまたは約 15-30% の合流点の密度ごとの 4 セル 2 x 10 のセルの数を与えます。5 分間 200 x g でチューブを遠心し、細胞ペレットを乱すことがなく、上清を吸引します
    。 注: 短期または刺激する前にセルを undergrowing を避けるために 96 ウェル プレートの上にメッキするセルの適切な量を計算します
    7. 。
  7. は、質量セルのチャンクを分割する 10 %15 mL に FBS 管、ピペットの上下と MEM の適切な量を追加します。各 96 ウェル プレートは、6 ml の 10% と MEM の細胞を再懸濁します FBS。
    。 注: するチューブに空気の泡を生成しないように注意してください
    8. 。
  8. は、貯留層に浮遊細胞を追加します。96 ウェル プレートの各ウェルにセルの 50 μ L のピペット マルチ チャンネル ピペットを使用する。5% CO 2 と 37 ° C で一晩インキュベートします
    9. 。

3。プラスミドのトランスフェクション

  1. トランスフェクション効率を促進する前に約 30-50% 位相差顕微鏡下で井戸の適切な合流を確認し、インキュベーターに戻るメッキの細胞を観察します
    2. 。
  2. 準備事前にタグ付きのローまたは構築 11 , 21 , 22 , 28, アクセサリーの要因を構築 (RTP1S 22, 36 M3R 23) バイオ センサー バリアント miniprep によって 29 , 30 を構築します。分光光度計によって DNA の濃度を定量化し、必要に応じて蒸留水プラスミド DNA 濃度 (例えば に 100 ng/μ L) を調整します
    3. 。
  3. トランスフェクション混合
    1. 表 1 に従って各 96 ウェル プレートの MEM を 500 μ l 添加のプラスミッドのトランスフェクション混合物を準備します
      。 注: 異なる ORs 同じ 96 ウェル プレートで、テストするときトランスフェクション混合物とプラスミド DNA を追加量のボリューム合わせられなければならない特定 or transfected 井戸の数の関数にします
      2. 。
    2. 18 μ 500 μ L の槍玉に脂質を介したトランスフェクション試薬とチューブでトランスフェクション混合物の準備
  4. 上下ピペッティングによるトランスフェクション混合物とプラスミドの混合物を混ぜます。15 分、室温でインキュベート
  5. 10% と MEM の 5 mL の追加によって反作用を停止 FBS
    6. 。
  6. は細胞文化フード滅菌ペーパー タオルの厚い層に広がった。インキュベーターから細胞の 96 ウェル プレートを取る。ゆっくりと繰り返しタップ板ペーパー タオルの山の上の逆さま媒体はペーパー タオルで完全に吸収されるようにします
    。 注: 強制的にまたは突然をタップしないようにプレートとして 1 つのセルを失う可能性があります
    7. 。
  7. 96 ウェル プレートの各ウェルに結合されたトランスフェクション混合物の 50 μ L を転送し、5% CO 2 と 37 ° C で 18-24 時間一晩インキュベートします
    。 注: 時間管理のトランスフェクションと刺激スケジュールする必要があります測定の前すべてプレート同時トランスフェクションと刺激の露光時間を測定するために 1 つの実験で 1 つ以上の 96 ウェル プレートをテストするときです
    8. 。

4。刺激と測定またはリアルタイム キャンプ アッセイを用いたアクティビティ

  1. ウェルあたり 50-80% の適切な合流を確認し、インキュベーターに戻る位相差顕微鏡下で transfected セルを観察
    2. 。
  2. ハンクにグルコース 10 mM ヒドロキシエチル piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES) と 5 mM を追加して刺激メディアの準備 ' s バランスの取れた塩ソリューション (HBSS).
  3. 氷上リアルタイム キャンプ アッセイ基質試薬因数分解しなさい。PCR チューブにチューブあたり 55 μ L で-80 ° C で基質試薬を格納します。プレートごと 1 のチューブを使用します
    4. 。
  4. 基質試薬の 55 μ L と 2750 μ L HBSS/HEPES/グルコース溶液を混合することによって 2% の平衡化ソリューションを準備します
    5. 。
  5. は、ベンチにペーパー タオルの厚い層を広げた。ゆっくりと繰り返しタップ板ペーパー タオルの上の逆さまトランスフェクション媒体はペーパー タオルで完全に吸収されるようにします
    6. 。
  6. の各ウェルに HBSS/HEPES/グルコース溶液 50 μ L 分注でセルを洗浄しています
    7. 。
  7. 96 ウェル プレートから HBSS/HEPES/グルコース溶液をゆっくりと繰り返しタップします
    8. 。
  8. それぞれ 2% 平衡解のピペット 25 μ L と 2 h. のために室温でインキュベート
  9. 嗅覚原液 DMSO、-20 ° c まで使用店で事前に 1 M を準備します
    10. 。
  10. インキュベーション時間の終わりまで希釈 HBSS/HEPES/グルコース刺激培地で働く集中する臭気物質原液
    。 注: この手順で準備臭気物質の希釈液の濃度を倍にする各ウェルで正しい最終濃度を屈する
    11. 。
  11. プレート リーダーとさらに匂い、前によく 34 あたり 1000 ms の速度で 2 回連続の板の基底の発光レベルを測定、化学発光を用いたします
    12. 。
  12. は、プレート リーダーからプレートをすばやく削除各ウェルに 25 μ L の臭気物質の希釈を追加し、20 サイクルのすべての井戸の連続発光測定をすぐに30 分以内
    注: 近隣の汚染を避けるために注意深くピペット井戸同じ板の別の匂いと同じ匂いの濃度の異なるを使用する場合
    13. 。

5。データ分析

  1. 発光プレート リーダー ソフトウェアからデータをエクスポートします
    2. 。
  2. 計算式を使用して各時間ポイントまたは応答を正規化
    (発光 N – 発光 基底)/(発光 最高 – 発光 基底)
    、N = 特定の発光値よく; 基底基底の 2 つの平均発光値を =発光値;最高 = 板の最高発光値またはプレートのセットです
    。 注: 実験の目的に応じて代替のグラフィカルな表現を採用することができます。たとえば、スクリーニング アッセイ ( 図 1 参照) や最大値など、運動の測定時に必要な時点で特定の井戸の発光値濃度応答曲線を生成するため、または最終的な値を使用できます
    3. 。

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結果

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ムスコン天然ムスクから芳香主成分であります。ムスコンとマウスまたは、MOR215 1、行動マウス37,38ムスコン応答性腎糸球体からクローンに相同性に基づく他の大環状ムスク化合物のひと受容体として同定された OR5AN1 の最近の調査します。また人間またはレパートリー、当社グループと東原和グループをスクリーニングとして識別される OR5AN1 2 大環状ムスク化合物、cyclopentadecanone、ムスコンの主要な受容体, ルシフェラーゼ アッセイ システム38,39 を使用して.

ここで説明されているリアルタイムのキャンプのアッセイを使用して、30 μ M ムスコン (図...

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ディスカッション

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嗅覚情報の符号化の解読の第一歩は、正確に特定の臭気物質への露出に OR の活性化を測定します。この研究を表す方法の 1 つの例によって識別できる、体外で示されている実験 OR 式システム、人間またはレパートリーの関心とその後受容体を特徴付ける臭気化学の中で応答 ORs薬理学の化学物質の濃度を使用します。我々 の結果は、ムスコンbona fideの受容体として OR5AN1 を確認します。これは以前レポート39と一貫性のある、受容体の数が少ないがムスク臭27,40をセンシングに関与しているという憶測に対する更なる証拠を提供しています。佐藤 Akuharaら類似または異種発現系のルシフェラーゼ アッセイによって生成されるからスクリーニング データと比べると、審査結果はやや悪い信号対雑音比を示した。関与する別の技術に固有のバリエーション以外にも出力の違いは低いムスコン濃度 (μ M の対100 の 30 μ ...

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

仕事に支えられ中国国立科学財団 (31070972)、科学技術委員会の上海の自治体 (16ZR1418300)、革新的な研究チームの上海市教育委員会、上海の東のためのプログラム学者プログラム (J50201) と中国 (2012CB910401) の国民の基礎研究プログラム。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アムホテリシン BSigmaA2942
DMSOSigmaD2650
FBSGibco10099-141
GloSensor cAMP 試薬PromegaE1290
pGloSensor-20F cAMP プラスミドPromegaE1171
Hana3A cellsに応じて著者から入手可能
HBSS, without calcium or magnesiumGIBCO14175095
HEPESHycloneSH30237
Lipofectamine2000Invitrogen11668-019
M3R plasmidcloned into a mammalian expression vector such as pCI
MEM, with EBSS and L-glutamineHycloneSH30024
MusconeSantaCruzsc-200528
Musk tibeteneSigma-AldrichS359165
OR プラスミドRho タグでクローニングし、pCI PBS などの哺乳類発現ベクターにクローニング
またはマグネシウムなしCellgro21-040-CV
ペニシリン-ストレプトマイシンHycloneSV30010
プラスミド ミニプレップ キットTiangenDP103-03
PuromycinSigmaP8833
RTP1S プラスミド
0.2 mL PCR tube、AxygenPCR-02-C
1.5-mL、Eppendorf tubeEppendorf
15-mL、17 mm x 120 mm、コニカルチューブなどの哺乳類発現ベクターにクローニングBD Falcon352096
8ウェルおよび/または12ウェルマルチチャンネルピペットマンEppendorf
96ウェル平底白細胞培養プレートGreiner655098
100 mm x 20 mm 細胞培養ディッシュBD Falcon353003
Class II 生物学的安全キャビネット、層流
付き細胞培養インキュベーター、5% CO2
遠心分離機、15mlコニカルチューブ
Infinite F200プレートリーダーTecan
位相差顕微鏡(対物レンズ×10および×20 分光
光度計
付き)マルチチャンネル分配
滅菌ペーパータオル
ご要望を 、カルシウムを pCI Trypsin-EDTA Hyclone SH30236 、用スイングバケットローター付き用の滅菌試薬リザーバー

参考文献

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