生細胞測定の嗅覚受容体活性化アッセイを用いた、リアルタイム キャンプ

サマリー

嗅覚受容体の機能を特徴づける deorphanization プロセスの不可欠な部分を提供しています。キャンプの試金を使用してリアルタイムの嗅覚受容体の活性化を測定する手法を提案します。

要約

哺乳類の嗅覚受容体 (OR) 家族の巨大なサイズは、多数の揮発性化学物質の中で、同種の配位子を見つけることの難しさを提示します。効率的かつ正確には、ORs を deorphanize、我々 はリアルタイムでまたは活性化の下流 cAMP の産生を測定する哺乳類 ORs とバイオ センサー遺伝子組み換えプラスミドを表現する異種細胞ラインの使用を組み合わせます。この試金は画面ニオイ Or その逆に対して使用できます。画面から肯定的な嗅覚受容体の相互作用は、様々 な臭気濃度、濃度反応曲線を生成するテストによってその後確認できます。ここも積極的に応じる受容体が関心の化合物の同種の受容体である Hana3A 細胞で発現を行い人間またはライブラリに対して臭気化合物高速スクリーニングを実行するのにこのメソッドを使用します。効率的なまたはアクティブ化を評価する上で信頼性の高いこのハイスループット検出方法がわかったし、我々 のデータまたは機能研究の潜在的な使用の例を提供します。

概要

嗅覚は、食べ物を得るため、捕食者や危険を避けるため、種を区別、仲間^1,2を選択する彼らの嗅覚の能力に依存している動物の生存に重要な役割を果たしています。これらの機能の実現 (OE) の嗅上皮にある嗅覚ニューロン (OSNs) 毛様体表面の表現は個別に嗅覚受容体 (ORs) によって異なります。ORs は、最大約 400 と 1200 多様な OR 遺伝子とヒト G タンパク共役型受容体 (GPCR) スーパーファミリーの家族やマウス、それぞれ^3,4,5を構成します。匂いによって活性化される ORs は嗅覚 G タンパク質 (G_olf) のシーケンシャルの活性化を介して細胞内 camp を増加につながるし、III アデニル酸シクラーゼ (ACIII) を入力します。メッセンジャーの 1 つ、細胞表面のヌクレオチド依存性チャネルを開き、Ca^{2 +}や活動電位、最終的に開始するなどの陽イオンの流入をトリガーとして機能することが, 細胞内 cAMP の結果増加レベル神経電位伝送と嗅覚。検出および多数 ORs による匂いの識別のプロセスは、嗅知覚⁶

プロトコル

1 です Hana3A 細胞のメンテナンスと養殖

1. 10% 牛胎児血清 (FBS)、100 で最低限必要な媒体 (MEM) 10 mL に維持セル μ G/ml ペニシリン-ストレプトマイシン、および 1.25 μ g/mL アムホテリシン B 100 mm。5% CO ₂ と 37 ° C 細胞文化のインキュベーターで細胞培養ディッシュ。すべての他の通路に追加プラスミド (を参照してください 導入) の安定したトランスフェクションを維持するために 1 μ g/mL ピューロマイシン
   。 メモ: クラス II 生物学的安全キャビネット滅菌環境を確保するために細胞培養に関連するすべての手順を実行します
。
2. 100 mm 料理 2-3 日毎に 10 〜 20% の割合でサブカルチャー
。

2。Transfection のため細胞をめっき

1. Hana3A 細胞細胞生存率を確保し、合流を推定する位相差顕微鏡下で観察します
。
2. 細胞培養ディッシュからすべての媒体を吸い出しなさい
。
3. プレートの上にリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 mL を追加し、料理を旋回、PBS を吸引洗浄セル
。
4. は、0.05% トリプシン - エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、プレートの 3 mL を加えます。1 ....

結果

ムスコン天然ムスクから芳香主成分であります。ムスコンとマウスまたは、MOR215 1、行動マウス^37,38ムスコン応答性腎糸球体からクローンに相同性に基づく他の大環状ムスク化合物のひと受容体として同定された OR5AN1 の最近の調査します。また人間またはレパートリー、当社グループと東原和グループをスクリーニングとして識別される OR5AN1 2 大環状ムスク化合物、cyclopentadecanone、ムスコンの主要な受容体, ルシフェラーゼ アッセイ システム^{38,39 を使用して}.

ここで説明されているリアルタイムのキャンプのアッセイを使用して、30 μ M ムスコン (図.......

ディスカッション

嗅覚情報の符号化の解読の第一歩は、正確に特定の臭気物質への露出に OR の活性化を測定します。この研究を表す方法の 1 つの例によって識別できる、体外で示されている実験 OR 式システム、人間またはレパートリーの関心とその後受容体を特徴付ける臭気化学の中で応答 ORs薬理学の化学物質の濃度を使用します。我々 の結果は、ムスコンbona fideの受容体として OR5AN1 を確認します。これは以前レポート³⁹と一貫性のある、受容体の数が少ないがムスク臭^27,40をセンシングに関与しているという憶測に対する更なる証拠を提供しています。佐藤 Akuharaら類似または異種発現系のルシフェラーゼ アッセイによって生成されるからスクリーニング データと比べると、審査結果はやや悪い信号対雑音比を示した。関与する別の技術に固有のバリエーション以外にも出力の違いは低いムスコン濃度 (μ M の対100 の 30 μ .......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アムホテリシン B	Sigma	A2942
DMSO	Sigma	D2650
FBS	Gibco	10099-141
GloSensor cAMP 試薬	Promega	E1290
pGloSensor-20F cAMP プラスミド	Promega	E1171
Hana3A cells			に応じて著者から入手可能
HBSS, without calcium or magnesium	GIBCO	14175095
HEPES	Hyclone	SH30237
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-019
M3R plasmid			cloned into a mammalian expression vector such as pCI
MEM, with EBSS and L-glutamine	Hyclone	SH30024
Muscone	SantaCruz	sc-200528
Musk tibetene	Sigma-Aldrich	S359165
OR プラスミド	Rho タグでクローニングし、pCI PBS などの哺乳類発現ベクターにクローニング
またはマグネシウムなし	Cellgro	21-040-CV
ペニシリン-ストレプトマイシン	Hyclone	SV30010
プラスミド ミニプレップ キット	Tiangen	DP103-03
Puromycin	Sigma	P8833
RTP1S プラスミド
0.2 mL PCR tube	、Axygen	PCR-02-C
1.5-mL、Eppendorf tube	Eppendorf
15-mL、17 mm x 120 mm、コニカルチューブなどの哺乳類発現ベクターにクローニング	BD Falcon	352096
8ウェルおよび/または12ウェルマルチチャンネルピペットマン	Eppendorf
96ウェル平底白細胞培養プレート	Greiner	655098
100 mm x 20 mm 細胞培養ディッシュ	BD Falcon	353003
Class II 生物学的安全キャビネット、層流
付き細胞培養インキュベーター、5% CO2
遠心分離機、15mlコニカルチューブ
Infinite F200プレートリーダー	Tecan
位相差顕微鏡(対物レンズ×10および×20 分光
光度計
付き)マルチチャンネル分配
滅菌ペーパータオル

ご要望を 、カルシウムを pCI Trypsin-EDTA Hyclone SH30236 、用スイングバケットローター付き用の滅菌試薬リザーバー