ここでは、ラットの老化喉頭筋をリモデリングするために、ニューロトロフィン4（NTF4）の使用を全身的かつ直接的に記述するためのプロトコールを提示する。
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この記事について
サマリー
要約
高齢者における喉頭機能不全は、声調障害から嚥下障害および気道保護反射障害の主要な原因である。年齢関連の喉頭筋機能不全を対象とする治療法は、あるとしてもごくわずかです。ニューロトロフィンは、神経筋接合部（NMJ）の筋肉の神経支配および分化に関与する。神経栄養因子は、神経伝達物質放出を増加させることによって神経筋伝達を増強すると考えられている。神経筋接合部（NMJ）は、ラットの喉頭筋の老化において、機能低下を示す証拠とともに、より小さく、豊富ではない。私たちは、ヒトの喉頭筋の高齢化における機能を改善するための治療薬としての将来の臨床用途へのNTF4の影響を探った。ここでは、NTF4の適用に応答してラット喉頭筋の老化能力を調べるための、NTF4の全身投与および直接注射のための詳細なプロトコールを提供する。この方法では、ラットはNTF4を全身的に oまたは声帯を介して直接注入することによって行われる。喉頭筋を解剖し、形態学および年齢関連の脱神経の組織学的検査に用いた。
概要
喉頭の筋肉は急速かつ一貫して収縮し、老化の悪影響を受け易い。この一定の活動は、65歳以上の人の1日 、 2日 、 3日 、 4日 、 5日 、 6日 、 7日に観察される声の問題または嚥下障害に寄与すると考えられている。いくつかの分子的および病態生理学的機序がこの年齢関連機能不全に寄与する。これらのメカニズムには、喉頭粘膜の改造、筋繊維萎縮または喪失、筋繊維再生の欠如、または声帯の屈曲および声門閉鎖の不可能化を引き起こす萎縮が含まれ得る（8,9,10,11）。現時点で実証された治療法はありませんこれらの筋肉の年齢に関連した変化を徹底的に防止またはリハビリします。
神経筋伝達の有効性の調節は、神経運動の性能に大きく影響する可能性がある。ニューロトロフィンのファミリーには、神経成長因子（NGF）、脳由来神経成長因子（BDNF）、ニューロトロフィン3（NTF3）およびNTF4 12,13....
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プロトコル
このプロトコールには、オスのFischer 344-Brownノルウェーラットを6ヶ月齢および30ヶ月齢で使用する。ラットは国立老化げっ歯類コロニーから入手した。ラット喉頭の構造はヒトのものと類似しており、機能的に気道保護および種特異的発声に役立つので、この研究のためにラットを使用した。この研究は、実験動物の人間のケアおよび使用に関するPHS方針に従って行われ、実験動物のケアおよび使用のためのNIHガイド、および動物福祉法（7 USC以下）;動物使用プロトコールは、ケンタッキー大学の施設動物用ケアおよび使用委員会（IACUC）によって承認された。
1.ラットの麻酔
- 緩衝生理食塩水中でケタミン塩酸塩（解離麻酔薬）と塩酸キシラジン（鎮静薬と鎮痛薬）を混合して麻酔薬を調製する。最終溶液中のケタミンおよびキシラジンの濃度は、100mg / 8mg / kg体重をそれぞれ測定した。
- 25Gの針を備えた注射器を用いて腹腔内投与によりラットに麻酔薬を注入する。
- つま先または足を鉗子で挟むことによってラットが十分に麻酔されていることを確認する。ラットがピンチに反応しない場合、手術が始まります。ラットが反射または筋収縮を伴ってつま先のつまみに反応する場合は、1-2分待ってピンチ試験を繰り返します。ラットが再び反応する場合は、ラットを新しい動物に交換し、ステップ1.2から始まる手順を繰り返す。
- 角膜が乾燥するのを防ぐため....
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結果
2週間の浸透圧ポンプ注入後またはNTF4の直接注入後1週間後にラットを安楽死させた。喉頭を収穫し、凍結保護剤（30％スクロースおよび70％リン酸緩衝生理食塩水）に入れ、次にクライオスタットで10μmの幅で連続的に切片化した。高齢の喉頭筋はNTF4の投与によって影響を受ける25 。若年ラットおよび老齢ラットに加えて、我々は、甲状腺機能亢進の筋肉の注入側および非注入側を比較した。典型的には、NTF4の投与経路に基づいて変化する、年齢とともに繊維サイズの変化を見る（ 図5 ）。より少ない線維症も、治療後に定性的に観察される。老化した繊維の割合は、老齢ラットにおいてNTF4の全身的および直接的適用によって低下する（ 図6 ）。 NMJの量も増加している（ 図7 ）。この増加の意義de処置の長さまたは投与経路に依存する。
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ディスカッション
喉頭の筋肉は、老化の好ましくない影響を受け易い。以前の研究では、収縮機能およびミオシンアイソフォームシフトの変化に加えて、繊維サイズの変化、繊維の総数、再生能力、NMJサイズおよび量の変化を含む老齢喉頭筋の変化が示されている4,11,27,30,31 。高齢の喉頭筋は、ニューロトロフィンの適用によって変化させることができる。これらの変化は容易に測定することができる。したがって、ラット喉頭筋は、老化および声帯疾患/障害の影響を研究するための有用なモデルを提供する。これらの筋肉の研究は、高齢者の介入や保護プロセスの開発にも役立つかもしれません。
NTF4の全身または直接適用の我々の方法は、老齢ラット喉頭でリモデリング反応を生じる筋肉。これは、神経栄養因子が加齢に関連する筋肉機能不全に治療可能性を有し得ることを実証する。ニューロトロフィンの直接的な適用は、注入ベクター25を通じた声の老化のヒトモデルに容易に変換することができる25 。
.......
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開示事項
著者は何も開示することはない。
謝辞
この研究は、国立難聴者およびその他のコミュニケーション障害研究所（R21DC010806からCAMおよびJCSおよびR01DC011285からCAMへの助成金）の支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ニューロトロフィン 4 | Pepro Tech | 450-04 | 200 ng 50 μL |
| Alzet 浸透圧ポンプ | DURECT Corporation | 2001D | |
| 30 ° 内視鏡 | Stoltz | 61029D | |
| 50 mm 30 ゲージ 100-μL シリンジ | ハミルトン | 84850 および201812 | |
| 生理食塩水 (塩化ナトリウム溶液) | シグマ・アルドリッチ | S8776 | |
| ケタミン塩酸塩 | ヘンリー・シャイン | 56344 | |
| キシラジン塩酸塩 | ヘンリー・シャイン | 33198 | |
| 25 G 5/8 針 | ベクトン・ディキンソン | 305901 | |
| 1 mL シリンジ | ベクトン・ディキンソン | ||
| 眼軟膏 | ヘンリー・シャイン | 8897 | |
| クリッパー | オスター | 44-018 | |
| エタノール | デコン | 2716 | |
| ヨウ素 (ベタジン) | Purdue Pharma L.P. | ||
| 加熱パッド | サンビーム | 731-5 | |
| 5-0 ナイロン縫合糸 | AD 外科用 | PMN-518R6 | |
| crile 止血剤 | ファイン サイエンス ツール | 13005-14 | |
| 繊細な縫合糸を結ぶ鉗子 | ファイン サイエンス ツール | 11063-07 | |
| メロキシカム | ヘンリー シャイン | 49756 | |
| カルプロフェン | メリット獣医用品 | 148700 | |
| 抗生物質軟膏 | ヘンリー・シャイン | 57110 | |
| アセプロミジン エースプロジェクト | ヘンリー・シャイン | 3845 | |
| イソフルラン イソセシア | ヘンリー・シャイン | 50033 | |
| 誘導ボックス (麻酔ボックス) | ハーバード装置 | 50-0116 | |
| 酸素圧縮タンク | スコット・グロス | UN1072 | |
| プレキシガラスプラットフォーム | スモールパーツ株式会社(アマゾン) | ||
| ゴム先端鉗子 | ファインサイエンスツール | ラバー11075-00 | |
| ウの | 42518 | ||
| 309659 | |||
| ハロゲン光源鼻喉頭以上の鉗子用液体ゴムストロボスコープ | Kay-Pentax | RLS 9100 B | |
| ビデオレコーダー | Kay-Pentax | ||
| スクロース | Sigma-Aldrich | S0389-500G | |
| リン酸緩衝生理食塩水 | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| クライオスタット Mictotom HM525 | Thermo Scientific | HM 525 | |
| Gill 1 hematoxylin | VWR | 10143-142 | |
| シャンドン エオシン-Y アルコール | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 6766007 | |
| 抗ナトリウムチャネル Nav1.5 抗体 ウサギで産生 | シグマ-アルドリッチ | S0819 | |
| テキサス レッド-X ファロイジン | シグマ-アルドリッチ | T7471 | |
| α-ブンガロトキシン アレクサ フルオ 488 コンジュゲート | サーモフィッシャーサイエンティフィック | B-13422 | |
| 小動物麻酔機械 | Smiths Medical | CDS 9000 |
参考文献
- Trupe, E. H., et al. Correlates and consequences of eating dependency in institutionalized elderly. J. Am. Geriatrics Society. 34 (3), 192-198 (1986).
- Ward, P. H., Colton, R., McConnell, F., Malmgren, L., Kashima, H., Woodson, G. Aging of the voice and swallowing. Otolaryngol. Head Neck Surg. 100 (4), 283-286 (1989).
- Gay, E. ....
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