細胞分化および単細胞イメージングの誘導腸炎ビブリオスイマーとスマーマー細胞

Summary

このプロトコールは、差異的に異なる腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）スイマーおよびスマーマー細胞の単一細胞顕微鏡検査を可能にする。この方法は、単細胞分析のために容易に入手可能なスマーマー細胞の集団を産生し、細胞培養の調製、スマーマー分化の誘導、試料調製および画像分析を包含する。

Abstract

タンパク質の細胞内局在を研究する能力は、多くの細胞プロセスの理解に不可欠です。これは、蛍光顕微鏡検査のための単一細胞を得る能力を必要とし、細菌集団内に存在する細胞を画像化する場合に特に困難であり得る。例えば、ヒト病原体Vibrio parahaemolyticusは、表面接触時に固体表面上での増殖に特化した非常に細長いスマーマー細胞の亜集団に分化する液体状態の短い棒状のスイマー細胞として存在する。本稿では、 V.parahaemolyticusの 2つの異なる状態における単一細胞蛍光顕微鏡分析を行う方法を提示する。このプロトコールは、V.parahaemolyticusのスワマー細胞ライフサイクルへの分化を非常に再現性よく誘導し、固体表面上でのそれらの増殖を促進する。この方法は、tから伸びる分化したスマーマー細胞のフレアを生成する群れコロニーの縁である。注目すべきは、群れのフレアの先端では、スワマー細胞が細胞の単一層内に存在し、顕微鏡スライドおよびその後の単一細胞の蛍光顕微鏡画像化への容易な移行が可能になることである。さらに、細菌学の人口学的表現のための画像分析のワークフローが提示されている。原理の証明として、V.parahaemolyticusのスイマーおよびスマーマー細胞における走化性シグナル伝達アレイの細胞内局在の分析が記載されている。

Introduction

細菌は、常に外部環境の変化を経験し、それに応じて行動を変化させ適応させるためのいくつかの技術を開発してきた。そのような機構の1つは、変化した環境をよりよく補う別個の細胞型への分化を含む。分化は、しばしば、細胞周期の調節、細胞形態学、および細胞の時空間組織化における主要な変化を伴う。分化を受けることができる1つの生物は、腸炎ビブリオである 。 V.parahaemolyticusはVibrionaceaeに属し、これは通常新鮮なまたは塩水に棲むプロテオバクテリアのファミリーである。 Vibrionaceaeは環境に広く分布しており、Vibrio cholerae.Vを含むヒトに腸管感染を引き起こすいくつかの種を含む。腸炎菌は二形性生物であり、その変化に対応するための応答として2つの異なる細胞型に分化することができる外部環境。水性環境では、それは古い棒状のスイマー細胞として存在し、単一の極性鞭毛が古い細胞極に位置する。表面が接触すると、スマーマーセルへの分化が引き起こされる。スワマー細胞の分化には、2つの大きな変化が含まれる：細胞分裂の阻害によるスワマー細胞の形態形成、および第2の鞭毛系の誘導。この結果、蠕虫状の非常に細長い棒状のスマーマー細胞が形成され、スマーマーライフスタイルを続けることができ、分裂イベントは後代のスマーマー細胞を生じるか、または代わりにスイマー細胞に分化する。

スウォーマーの分化を誘導または影響するいくつかの因子が報告されている。一次刺激は、 V.腸炎菌が表面接触時の回転の阻害を検出する触覚センサとして極性鞭毛を使用するメカノセンシングによって駆動されると思われるが、他のいくつかの要因がウェル¹ 。実験室では、フェナミルを添加することにより、極性鞭毛の回転を人為的に阻害することができます。フェナミルは、ナトリウムチャネル駆動の鞭毛回転を阻止し、それによりスワマー分化を誘発します² 。さらに、初期の研究では、細胞を透明なプラスチックテープでシールしたペトリ皿中で増殖培地上で増殖させると、 ビブリオ・アルギノリチカスは固体培地上に集まるように誘導された。アルカリ性の濾紙は、これらの条件下での群れを防ぎ、したがって、1つまたは複数の揮発性酸が群れ誘導に関与している可能性があることを示唆している。従って、プラスチックテープでペトリ皿を密封することは、プレートのヘッドスペース内で、細胞代謝の副生成物として形成される揮発性酸の蓄積を可能にする可能性が高い。培地成分を加水分解することによって人工的に揮発性酸を生成するために、シールされていないペトリ皿中で増殖培地にH ₂ O ₂を添加した場合にも同じ効果が達成された 3、4、5。それにもかかわらず、このような揮発性酸のアイデンティティは未知のままである。さらに、カルシウム⁶および鉄制限^7の過剰な利用は、固体表面上のスマーマー分化および増殖を促進することが示されている。化合物2,2'-ビピリジルをスウォーマー分化に影響することが示されている増殖培地に添加することにより、細胞を鉄で飢えさせることができる⁸ 。分化を調節することが知られている因子は、スワマー細胞への腸炎ビブリオ寄生虫の分化および固体寒天表面上でのそれらの増殖を再現可能に誘導するプロトコールの設計において現在実施されている。

V.腸炎ビブリオの分化は、細胞分裂、細胞形態の調節、および鞭毛のような巨大分子機械の配置における主要な変化を伴うaおよび走化性装置 - 細胞周期に従ってタンパク質の特異的局在を必要とするプロセス。従って、このようなタンパク質の細胞内局在を研究する能力は、前述の細胞プロセスの理解に必須である。そのような研究を行うためには、単一細胞に対する蛍光顕微鏡法が必要である。これは、スマーマー細胞の場合のように、高密度細菌集団内に存在する細胞を画像化する場合に特に困難であり得る。顕微鏡検査のために単一細胞を潜在的に生成する可能性がある液体培地中のスマーマー分化を誘導する試みがなされている。そして、転写レベルでは、これらの細胞は部分的にスワマー分化プログラムを誘導したが、固体培地上で増殖させた完全に分化したスマーマー細胞と同じ形態変化を受けなかった⁸ 。この論文は、スワーマーを誘発する方法の堅牢で再現性のあるプロトコルを提供する寒天表面での分化。プロトコールは、単一細胞顕微鏡法およびその後の分析のために容易に入手可能な容易に入手可能なスマーマー細胞の集団を産生する。さらに、このプロトコールは、スイマー細胞およびスワマー細胞型（セクション1,2,3,4）の両方において蛍光標識タンパク質の局在化研究を可能にする。さらに、このプロトコルは、細菌顕微鏡の人口統計的分析を可能にする蛍光顕微鏡検査（セクション5）から生成されたデータを処理および分析する方法に関する後続のワークフローを記述する。

Protocol

1.エレクトロコンピテントV.腸炎ビブリオ菌細胞の調製およびスイマー細胞へのプラスミドDNAのエレクトロポレーション

注記：プロトコルの次のセクションでは、エレクトロコンピテント細胞の調製とその後のスイマー細胞へのプラスミドDNAのエレクトロポレーションが可能です。蛍光タンパク質がプラスミドから異所的に発現される場合、この工程は重要である。

1. 100μg/ mLのアンピシリンを含有する新鮮なLB寒天プレート上に-80℃のグリセロールストックからのV.parahaemolyticus細胞をストリークし、37℃で一晩インキュベートする。
2. 翌日、200mLのLB培地にV.parahaemolyticusの単一コロニーを接種し、振盪条件下でOD ₆₀₀が1.0に達するまで37℃でインキュベートする。それは、細胞培養物が所望の光学濃度に達するために通常5〜6時間のインキュベーションを要する。
3. 直ちに細胞を氷上に移し、perf氷上で4℃の予冷した遠心分離機でさらにすべてのステップを行う。
4. 細胞を4℃で10分間2,000 x gで収穫する。
5. デカンテーションにより上清を捨て、25mLの氷冷273mMスクロース溶液（pH7.4、KOHで緩衝化した）に細胞ペレットを再懸濁する。
6. 4℃で10分間、2000×gで細胞を再度採取する。さらに2回繰り返します。
7. 洗浄した細胞ペレットを400μLの氷冷273mMスクロース溶液に再懸濁する。続いてグリセロールを15％vol / volの最終濃度に添加する。細胞はエレクトロポレーションの準備が完了していますが、後で使用するために-80℃で70μLのアリコートで凍結することもできます。
8. エレクトロポレーションのために、エレクトロコンピテント細胞の70μLアリコートを100〜1,000ngのプラスミドDNAと混合し、混合物を氷冷エレクトロポレーションキュベット（0.2cmの電極ギャップ）に移す。 25μF、2400 V、200Ωの設定でエレクトロポレーションを行います。
9. 中断する細胞をLBブロス600μL中のエレクトロポレーションキュベットに入れ、2mLチューブに移し、37℃で3時間振とうしながらインキュベートする。
10. 細胞を2,000 xgで5分間遠心し、100μlのLBブロスにペレットを再懸濁する。必要な抗生物質を含む選択的LB寒天プレートに細胞懸濁液を広げ、37℃で一晩インキュベートする。
11. 翌日、コロニー形成についてプレートをチェックする。増殖するコロニーはプラスミド上にコードされた正しい抗生物質耐性遺伝子を保有し、さらなる実験に使用することができる。

スワマー細胞分化誘導

注：以下のステップは、V.parahaemolyticusのスワマー細胞のライフサイクルへの分化を誘導する方法、および固体表面上の増殖を刺激する方法を記載する。

1. スワンミングプレートを調製するために、4mLのハートインフュージョン（HI）寒天を100mLのddH ₂ O中に懸濁する。
2. HI寒天溶液を電子レンジで注意深く沸騰させ、粉末が溶解するまで瓶を随時振とうする。 121℃で20分間オートクレーブ処理する。
3. オートクレーブ後、HI寒天を60〜65℃に冷却する。最終濃度50μM（100％エタノール中50mMのストック溶液）に2,2'-ビピリジルを添加する。 4mMの最終濃度（ddH ₂ O中の4Mのストック溶液）にCaCl ₂を添加する。必要に応じて、抗生物質を溶液に加えてプラスミドを維持する。
   注：誘導性プラスミドを使用する場合は、最終濃度に誘導剤を加えてください。
   注意：2,2'-ビピリジル：急性毒性（経口、経皮、吸入）。この化学物質を取り扱う際には、手袋および安全ゴーグルを使用する。
4. 最後のHI寒天溶液30〜35mLを丸150mmペトリ皿に注ぎ、寒天を凝固させる。
5. 細胞培養物をスポッティングする直前に、寒天プレートを37℃で少なくとも10分間乾燥させます（または液体残渣にdisappeared、しかしもはや）右上に開いた蓋があります。
   注：乾燥時間は、使用したインキュベーターに大きく依存し、重度に乾燥したプレートは、 腸炎ビブリオの蔓延を許さない 。 （このステップは非常に重要です！）プレートは新しく使用する必要があり、2〜3時間以上経過してはいけません。古いプレートはあまりにも乾燥して群れを刺激することはありません。
6. 単一コロニーの端から少量の細胞を5mLのLBブロスに接種する。 OD ₆₀₀ = 0.8に達するまで37℃で振とう培養物をインキュベートする。通常、約2〜3時間かかる。その後、細胞はHIスウィング寒天プレート上にスポットされる準備が整う。
7. HI寒天プレート（ 図1A ）の中央に細胞培養液1μLをスポットする。
8. スポットを乾燥させる（ 図1B ）。
9. 透明なプラスチックテープでプレートを密封し、しっかりと取り付けてください。そうでなければ、一晩のインキュベーション中に取り外す可能性があります（ 図1C ）。
   注：これはシールが完璧であることが非常に重要です。適用時にテープに気泡や折れ曲がりが発生しないように注意してください。
10. 24℃で一晩インキュベートする。これにより、鞭毛コロニー（ 図2 ）の周辺部から伸びる群発虫が発生した腸炎ビブリオの群集が形成される。

3.蛍光顕微鏡用のV.parahaemolyticus Swarmer細胞の調製

注：以下のプロトコールは、顕微鏡検査のための単一のスマーマー細胞を得るために、顕微鏡アガローススライドを調製する方法およびアガロースパッド上に猛烈なフレアの続くインプリンティングを記載する。

1. 顕微鏡用アガローススライドを調製するには、20％vol / vol PBSおよび10％vol / vol LBブロス溶液100 mLに1 gのアガロースを加えます。注意深く電子レンジで溶液を沸騰させてアガロースを溶解させ、マグネチックスターラーで混合しながら65〜70℃に冷却します。
2. 交流する場所リーン顕微鏡は作業台の完全な水平部分にスライドします。スライドの両端を汎用ラボ用ラベリングテープの2つの層で覆い、スライドを作業台に固定します。 2枚のテープの間隔は3cm程度にしてください。
   注：テープの2つの層は、アガロースパッドの高さを決定する非常に小さな標高を作成します。細胞が顕微鏡分析のために同じ平面内にあることを確認するために作業空間が水平であることが重要です。
3. 先に調製したアガロース溶液250μLを非被覆ガラス表面上にピペットで入れる。
4. 2番目の顕微鏡スライドを底に1つの上と同じ向きに置き、少し残して残ったアガロースが側面に流れ出るようにします。
5. アガロースを1〜2分間固化させ、次に水平方向の動きで上部ガラススライドを底部ガラススライドからゆっくりと引っ張ります。
6. メスを使用し、メスに付着している残りのアガロースをすべて切り取ってください。顕微鏡スライドの両側をゆっくりとスライドさせ、顕微鏡スライドの端部からテープをゆっくりはずします。
   注：アガローススライドはすぐに準備ができており、ゆっくりと乾燥が始まるので、できるだけ早く使用する必要があります。
7. スマーマー細胞で顕微鏡検査を行うには、群集のコロニーの最も外側の端から3mm×10mmのスウォーミング寒天片を切り取ってください（ 図1D ）。スイマーセルを顕微鏡スライドに移す直前まで、スウォームプレートのテープシールを壊さないことは非常に重要です。テープを剥がすと、 鞭毛鞭毛虫細胞はスイマー細胞への分化を開始する。
   注：群集の端から外へのカットをコロニーの内側に向けるようにしてください（ 図1D ）。この方法で、群れのコロニーの端に「水泳者の汚染」を防ぐことができます。
8. 細胞がアガロースpaに面している顕微鏡アガローススライド上に群れの寒天片を転送d（ 図1E ）。これは、群れの細胞をアガロースパッド上にインプリントする。
9. 約30秒待ってから、アガロースパッドから寒天片を注意深く取り除いてください（ 図1F ）。
10. 細胞がインプリントされたアガロースパッド上にガラスカバースリップを置く。細胞は顕微鏡検査の準備ができています。
    注：スマーマー細胞はゆっくりとスイマー状態への分化を開始するので、スマーマー細胞を直ちにイメージングすることが重要です。

4.蛍光顕微鏡検査のためのV.parahaemolyticusスイマー細胞培養物の調製

注：プロトコールのこのセクションでは、スイマー細胞型で蛍光顕微鏡検査を行うためにV.parahaemolyticusの培養液を調製する方法について説明します。

1. 単一コロニーの端から少量の細胞を5mLのLBブロスに接種する。培養物を37℃で1時間、またはわずかな細胞増殖が見えるようになるまで振とうする。
2. でこの段階は、必要であれば、目的のタンパク質の発現のための誘導剤を添加する。この実施例では、YFP-CheW9の発現を誘導するために、L-アラビノースを0.2％（w / vol）の最終濃度まで添加した。
3. 培養物を37℃でさらに2時間振とうさせる。
4. 顕微鏡のアガローススライドを準備するために、3.1-3.7のステップに従ってください。
5. アガロースパッドの中央に細胞培養液1μLをスポットし、乾燥するまでインキュベートします。
6. ガラスカバースリップを細胞が見つかったアガロースパッド上に置く。細胞は、蛍光顕微鏡下で画像化する準備が整っている。

5.画像解析

このプロトコルの部分では、画像分析のワークフロー、特に、人口統計解析のための単一細胞の蛍光データの抽出方法について説明します。

1. 画像解析を開始する前に、すべての顕微鏡画像が16ビットTIF形式で保存されていることを確認してください。
2. DIC（または位相コントラスト）および対応する蛍光チャネル画像をソフトウェアにロードします。
3. 「表示/オーバーレイ画像」を選択して、両方のチャンネルのオーバーレイ画像を生成します。画像の数（「＃Images：」）を2に設定し、第1チャンネルのDIC画像と第2チャンネルの蛍光画像を選択します。
4. ツールバーから「マルチライン」ツールを選択し、セルの中央から一方のポールから他方のポールにセルをマーキングします。生成されたすべての線（線オブジェクト）のリストを取得するには、「Measure / Region Measurements」を開きます。領域のラベル、距離、および平均強度のみを表示するように、領域の測定値を設定します。
5. 「測定/キャリブレーション距離」のピクセルサイズを、顕微鏡セットアップに特有のピクセルサイズに較正し、「すべての開いている画像に適用」をクリックします。
6. すべての領域（線オブジェクト）を蛍光チャネル画像に転送します。 「地域/トランスフソース画像（オーバーレイ画像）とデスティネーション画像（蛍光灯画像）を選択し、「すべての領域」を選択して「OK」を押します。
   注記：後で正確な線（線オブジェクト、領域、ROI）を再生成するには、「領域/領域の保存」を開いて領域を保存します。
7. "Measure / Region Measurements"を開いて "Open Log"を押して、すべての領域測定値をスプレッドシートにエクスポートします。データを開いてエクスポートすることを確認します。スプレッドシートをバックグラウンドで開くと、最後に "F9：Log Data"を押してデータをエクスポートします。
8. セルに沿って蛍光焦点の位置を決定するには、 "Measure / Linescan"を開きます。セルの全幅が、以前に作成した領域で覆われるように、「線の幅」を値に設定します。ラインスキャングラフを右クリックし、「グラフデータを表示」を選択します。マウスを左クリックしてドラッグすると、ラインスキャンに沿って「Graph Data」ウィンドウには、2点間の対応するピクセル/距離が表示されます。青色の強調表示された行を選択し、内容をコピーします。
   注：ラインスキャン強度プロファイル全体は、「ラインスキャン」ウィンドウで「ログデータ」を押すことでスプレッドシートに記録できます。抽出されたデータは、グラフやその他の統計分析での視覚化に使用できます。細胞周期にわたる局在化パターンは、細胞体に沿った細胞長および蛍光強度の人口統計学的表現で容易に視覚化することができる。これらの表現は、前に選択した同じROIを使用して取得できます。以下のステップは、 図3Cおよび4Cに示されるものと同様の人口統計を生成する方法の例を与える。
   1. "Metamorph nd＆ROI files importer"を使用して、ソフトウェアで以前に作成されたフィジー/ ImageJのロード領域マーキング（.rgn）（ステップ5.6）;あるいは、分析される細胞の関心領域（ROI）は、組み込み「セグメント化された線」ツールを使用して、Fiji / ImageJで直接作成することができる。
   2. 「Analyze / Tools / ROI manager」を開き、すべてのアクティブなリスト項目をマークします。
   3. その後、 "More / Multi Plot"をクリックし、新しい "Multi Plot"ウィンドウで "List"を選択します。テーブルエントリをクリックして、「すべてコピー」を選択します。その後、新しいスプレッドシートに貼り付けます。
      注：最も長いセル（対応する2つのXとYの列が最も多くの行を持つ）のデータがスプレッドシートの最後のものであることを確認してください。
   4. スプレッドシートを「CSV（カンマ区切り）（* .csv）」として保存します。
   5. Rスクリプトはここからダウンロードしてください。 "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" ^10.スクリプトは長さ別に細胞を分類し、各細胞の蛍光強度の平均としてすべての細胞の蛍光強度プロファイルを正規化しますe。
   6. R [バージョン3.0.1のスクリプト "cell profiles function.R"全体を実行します。 ¹¹ ]。
   7. 30行目の "example plots.R"スクリプトを編集して、ファイルパスが以前に生成された.csvファイルが保存されているフォルダを参照するようにします。さらに、31行目のファイル名 "profile.csv"を、手順5.9.4で生成した.csvファイル用に選択したファイル名に変更します。その後、 "example plots.R"を実行し、 "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles"のドキュメントとスクリプトファイルのコメントに従って、人口統計解析を生成します。

Results

集団コロニーの分化誘導

図1は、 V.parahaemolyticus （ 図1A〜C）の 鞭打ちコロニーを産生することに関与する重要なステップのスキーマを提供する。スイマー培養物を群寒天にスポットし、24℃でインキュベートし、固体寒天表面上のスマーマー分化および増殖を誘導した。群れたコロニーの代表的な立体顕微鏡画像を図2に示します。ステレオ顕微鏡法によるイメージングでは、群コロニー周辺の外側に広がる群発発射が明確に示されます。より高い倍率は、群発発火において、細胞が単層または二層のみにグループ化されるのに対して、群のコロニーでは、複数の層に細胞が積み重なっていることを明らかにする（ 図2A ）。スウォームフレアは容易に転送することができます（ステップ3.8-3.11、 図...

Discussion

本稿では、 V. parahaemolyticus swarmer細胞の顕微鏡画像化方法とそれに続く下流分析を用いて、細胞内局在および研究された蛍光標識タンパク質の他の特徴を解明および定量する方法を報告する。顕微鏡検査画像処理および分析のためのいくつかのツールが存在するが、V.parahaemolyticusスウォーム細胞の分析は、大部分が高密度細胞集団内に通常存在し、細胞長の変動が大きいために依然として挑戦的である（14,15,16,17,18） 図2 ）。したがって、自動化された細胞の検出には時には欠陥があり、結果はやや信頼性がありません。このプロトコルは、 V.parahaemolyticusの鞭打ち細胞を増殖、画像化および分析するために設計されたパイプラインを概説しており、近接して成長する可変長の細胞の存在に対応する表面および下流の画像解析上の制御された増殖環境のような、これらの細胞の必要性が存在する。

目的のタンパク質をプラスミドから異所的に発現する能力は、いくつかの実験、 例えば顕微...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mediaコンポーネント
LB中	Roth	X968.3
Difco寒天、粒状	BD	214510	LB中
Difco Heart Infusion寒天培	BD BD	244400	HI寒天スウォーミングプレートの調製用
アガロースNEEO、超高品質	Roth	2267.3	顕微鏡検査用アガロースパッドの調製
用名前	会社	カタログ番号	コメント
Additives
L-アラビノース	ロスロス	5118.3	pBAD誘導体
2,2'-ビピリジル	を誘導するために使用されますシグマアルドリッチ	D216305-25GHI	寒天スウォーミングプレートの調製用
塩化カルシウム二水和物	ロス	5239.1HI	寒天スウォーミングプレートの調製用
ピシリンナトリウム塩	ロス	K029.3
ラムフェニコール	ロス	3886.3PBS
バッファー	-	リン	酸塩緩衝生理食塩水
D(+) ショ糖	Roth	4621.1	電気コンピテントセルの調製用
グリセロール	Roth	3783.5	電気コンピテントセルの調製
用名前	会社	カタログ番号	コメント
Hardware
ペトリ皿 150 mm x 20 mm カム付き	Sarstedt	82.1184.500	HI 寒天スウォーミングプレートの調製用
kelvitron t (B 6420)	ヘレウス	-	HI 寒天スウォーミングプレートの乾燥に使用
遺伝子パルサー Xcell 微生物システム	BioRad	1652662	プラスミド DNA
Name		カタログ番号	コメント
Software
MetaMorph Offline (version 7.7.5.0)	Molecular Devices	-	顕微鏡画像解析に使用
Excel	Microsoft	-	顕微鏡データ解析に使用