三次元組織配置に発達メカニズムを要約し、神経系の再生を容易にするアストロ サイト ネットワーク

サマリー

縦一直線に並べられたアストロ サイトの突起と新規の生体材料箱詰め内のプロセスの自己組織化、三次元の束の開発を紹介します。これらは「生活足場」、神経発達メカニズムを研究したり、演出の神経細胞移動や軸索再生に関するを促進するテストベッドとしてセンチメートル長さを拡張する可能性がありますまだミクロン径を展示設計草分け。

要約

頭部外傷、神経変性疾患は、失われた神経細胞を置き換えるし、軸索経路を再生成する中枢神経系 (CNS) の限られた容量のための神経学的な欠損を永続的によくあります。ただし、神経システムの開発、神経細胞移動と軸索の延長中にしばしば「生活の足場」と呼ばれる他の細胞によって形成された経路に沿って発生します。これらのメカニズムをエミュレートするために、中枢神経系の抑制性の環境を回避する戦略の設計を求めて、本稿では提案設計組織を作製するためのプロトコル アストロ ベース「生活足場」。これらの構成要素を作成するには、自己バイポーラ縦揃え突起とプロセスの高密度三次元バンドルにまとめるアストロ サイトを誘導する新規生体材料箱詰め方式を採用しました。最初、中空ゲル マイクロ列が組み立てていた、および内部ルーメンだったコラーゲン細胞外マトリックスでコーティングします。解離の大脳皮質アストロ サイト、マイクロ円柱との重要な内径の内腔に配信された < 350 μ m、自発的に自己整列し、密な束から成る長い繊維のようなケーブルを製造委託するにはアストロ サイトのプロセスおよび測定コラーゲン線維の < 150 μ m の直径はまだいくつかの cm の長さを拡張します。これらは展示の生活の足場を設計 > 97% 生存率を携帯され事実上独占的、中間径フィラメント蛋白質グリア線維性酸性蛋白質 (GFAP), ビメンチンの組み合わせを表現して、ネスチンはアストロ サイトで構成されています。これらはアストロ サイト ネットワーク神経添付の寛容な基板を提供するために発見され、神経突起の伸展を整列配置されます。さらに、これらの構成要素は、整合性とハイドロゲルの箱詰めは、中枢神経系の注入に適してから抽出されるときの配置を維持します。これらの前もって形成された構造は構造的に自然発生するキー細胞要素をエミュレート グリア ベース「足場を生きている」 in vivo。など、これらの設計された生活の足場は、神経発達機構研究生体外でまたは神経移行および/または中枢神経系変性体内に続く軸索経路の指示により容易に再生に関するテスト ベッドとして可能性があります。.

概要

中枢神経系 (CNS)、限られた容量の損失および/またはニューロンと外傷性脳損傷 (TBI) などの条件を伴う軸索経路の機能不全を打ち消すために脳卒中、脊髄損傷 (SCI) と神経変性疾患^{1 ,2,3,4,5}。中枢神経系における神経新生は、失われたニューロン^6、7の復元を妨げる、脳内領域の限られた数に制限されます。さらに、失われた中枢神経系軸索経路の再生は十分な監督指導の欠如、伸長阻害剤および神経組織^{2,8への損傷、次反応性アストロ サイトの増生の存在により 9,10}。アストロ サイトは通常、イオン恒常性、神経伝達物質のクリアランス、シナプス形成、神経血管¹¹を結合ニューロンの支援に多様な機能を持っています。それにもかかわらず、次の神経組織にも軽度の損傷、アストロ サイト変わることがあります分子・構造・機能肥大状態¹¹に移行していくようです。重症頭部外傷に対しては、これらの変更は移行反応性アストロ サイトと破裂血液脳関門 (BBB)、ミクログリアから流出した白血球を含む病変コアを含む半影と傷跡の形成の結果します。オリゴデンドロ サイト、および線維芽細胞^11,12,13。これらの反応性アストロ サイトは糸状、解体プロセスの形態を達成して中間径フィラメント蛋白質および神経再生¹²を妨げるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン (CSPGs) の発現の増加を展示します。にもかかわらず、グリア瘢痕最初 BBB の整合性を復元し、周囲の健康な組織に炎症性応答の送信を避けることができます、それは軸索再生^{12,14 に対して物理・生化学的バリアとして機能します。 ,,1516}。例えば、グリア瘢痕が発生する軸索は球根の栄養障害による成長円錐を表示し、発育成長¹²。さらに、星状膠細胞の傷害の後の解体は、再生軸索¹⁷の拡張を妨げます。これらの抑制特性の結果、TBI、科学を含む重度の頭部外傷後の患者は苦しむ多くの場合永久的な物理的および神経学的な障害で明らかに

外因性課題中枢神経系機能の再生、関係なく軸索が再生する本質的な能力を所有する示されています。例えば、グリア瘢痕と接触して栄養障害による成長円錐の動的な性質は、これらの終末が¹²を拡張するための能力を保持することを示唆します。したがって、受傷後の中枢神経系のグリア瘢痕・傷跡再生橋になる提供を減らすことでより寛容な環境を提供する抑制性の環境を軸索再成長への主な障害にはいわれています。有利であります。確かに、以前の研究は中枢神経系ニューロンが軸索軸索再生^{12,18のより好ましい環境を現在のブリッジとして末梢神経移植を使用して病変を拡張することができることを実証しています。 19}。他のいくつかの戦略は、この痕跡の再生能力を悪用する追求されています。たとえば、さまざまな傷害モデルにおける細胞成長シグナル伝達経路の操作は、軸索再生とグリア瘢痕削減^10,20,21になりました。さらに、研究はコンドロイチナーゼ ABC は、CSPGs の糖鎖の大半を裂く、治療が反応性アストロ サイト²²から分泌される CSPGs の抑制効果を減少することを示しています。結果の奨励にもかかわらず、これらのアプローチは監督の迷入再生¹²、ことがあります、またニューロンの損失を考慮しない成長円錐ガイダンスを提供しています。セル ベースのアプローチは、グリア瘢痕の与える影響を克服するため、失われた細胞、特に神経細胞を補充するための試みで利用されています。いくつかのグループが脱分化型反応性アストロ サイトのニューロンに損傷領域を再作成し、軸索再生^23,24,を促進する中枢神経系病変に神経前駆細胞を移植したが他の中²⁵します。 ただし、幹細胞移植だけでは生存率が低、統合が不完全と損傷した組織⁵ささやかな保有期間によって制限されます。さらに、これらのセルに基づく戦略は、制御された方法で特に長距離軸索路を復元に失敗します。したがって、他のアプローチとの組み合わせで生体材料は、様々 な神経の配送車として検討されています、前駆細胞と成長因子²⁶。生体材料ベースのアプローチの高度な特定の物理的な haptotaxic を模した構造を生成する設計制御機能し、ターゲット ホスト組織^{27の三次元 (3 D) の微小環境に存在する chemotaxic キュー 28,29,30,31,32,33,34}。これらの環境の信号の再現は、ネイティブのような形態、増殖、移行、および他の神経生物学特性²⁹の間で、シグナリングを提示する移植細胞の最も重要です。これらの有利な性質にもかかわらずシード従来の携帯バイオマテリアル足場を超えて進歩は同時に監督の長距離軸索再生を促進し、失われた神経細胞を置き換える必要です。

ネイティブ神経解剖学をエミュレートする前もって形成された細胞構築と神経細胞の存在のため他のセル ベースのアプローチとは異なる「生活の足場」、有望な代替手法は、神経ティッシュ エンジニア リングおよび/または対象となる交換、再建そして神経回路^4,35の再生を容易にする機構。生活の足場の設計に関する考慮事項は、表現型、機械・物理プロパティと同様に、神経細胞の源および生化学的なシグナルは任意の付随のバイオマテリアル³⁵の組成によって決まります。生体外作製後、これらの生活の足場注入体内細胞接着分子と走化性、神経信号を神経細胞移動と軸索伸長の状態に応じて積極的に調整して再生の進行は、³⁵を処理します。グリア細胞は、これらの細胞は、生体内のさまざまな発達のメカニズム仲介以来生活の足場の設計研究のための基礎として使用できます。脳の発達中に新しい神経細胞は、基底プロセスの指示移行^36,37の生活の足場として発展途上の骨皮質骨板に向けた心室ゾーンから放射状グリア細胞による拡張に依存します。さらに、グリア済みパターンに沿って拡張することによって正しいターゲットに到達する示唆、錐体は、グリア道標細胞によって誘発される魅力的で撥の信号を感知して自体の向きを示すといわゆる「先駆的な「軸索成長の拡張骨格の^35,38,39。したがって、グリア細胞は軸索、後に軸索ベースを提供する先駆的な指導のために必要な「生活足場」「追従」の軸索投射を指示します。また、グリア細胞を介した成長機構が神経芽細胞下帯 (SVZ) 成体脳における神経新生のいくつかの残りの部分のいずれかから移動する (RMS) 吻側渡り鳥ストリームに従ってください、後天的、保持するために示されている、嗅球 (OB)⁴⁰。直接細胞接着斑での縦揃えのアストロ プロセスは構成され、可溶性因子^37,をローカライズ グリア管 (図 1 a-1) 内に RMS でこれらの神経を移行します。⁴¹します。 最後に、哺乳類の原因で傷ついた中断するアストロ サイト プロセス配置軸索再生¹⁷を物理的に阻害するグリア瘢痕形成と、多くの非哺乳類システムを欠いている有害なグリア瘢痕の形成。むしろ、非哺乳類種のグリア細胞維持組織、負傷した領域^17,42,43をガイドとして使用されるパターンを配置しました。例えば、非哺乳類科学モデル、軸索の軸索の再生と機能回復 (促進する基板としてグリア足場の組織の重要な役割を示唆している病変のグリア橋と密接な関係に成長する表示されます。図 1A-2)^42,44,45反復の神経解剖学的機能と上述の発達/再生機構が未熟な神経細胞移動をドライブすることができます同時に設計されたグリア ベースの生活の足場の新しいクラスをもたらす可能性があります、軸索。そうでなければ寛容な環境では、神経の影響を軽減させる可能性がありますを草分けと中枢神経系の損傷や疾患に関連付けられている軸索路変性。

我々 の研究グループは複数の種類の生活復興のため足場を設計して以前とマイクロ組織を介して末梢神経系 (PNS)、中枢神経系の軸索路の再生設計ニューラル ネットワーク (マイクロ TENNs) と組織神経移植 (TENGs)、それぞれ^27,46,47,48を設計されています。両方の戦略は、バイオミミ クリーに本質的に基づいています。マイクロ TENNs は、解剖学的に触発された構造の構造的、機能的脳の異なる神経細胞の集団を接続する軸索路を置き換えるために設計です。TENGs 軸索促進の軸索の再生をターゲット ホスト軸索再生^35,46,48を達成するために、「パイオニア」の軸索に沿って"追従"の軸索成長に代表される発達のメカニズムを利用します。我々 は最近、生活足場の汎用性を資本金法マイクロ TENNs として箱詰め、同様のスキームを使用して、グリア細胞ベースのメカニズムからのインスピレーションを求めて開発全体を通して提示します。ここでは、ハイドロゲル マイクロ列⁴⁹の膠原線維の内腔にまたがる整列アストロ サイトの束から成る構造を開発しました。これらのアストロ サイト生活の足場が開発の直径に対応する外径 (OD) と内径 (ID) 中空円筒状のゲルを作成する液体の agarose が付いてキャピラリー チューブ鍼針アセンブリを記入、管、針、それぞれ。Agarose のゲル化とキャピラリー チューブからゲル マイクロ列の抽出、中空のインテリアはタイプ私アストロ接着のために寛容な環境を供給するコラーゲンをコーティングし、束形成 (図 1 bを揃え-1)。その後、内腔は生後仔 (1 b を図-2) から分離された大脳皮質アストロ サイトとシードします。二次元 (2 D) 配置手法 (ECM) タンパク質パターンニング、電界、マイクロパターニングゲル溝と細胞外マトリックスのアプリケーションに依存している生活の足場でアストロ配置に反する手法では, 自己組織化基板曲率 (ID 列)、細胞密度、コラーゲン濃度^50,51,52などの制御可能な変数に基づいています。アストロ サイトは契約し、コラーゲンをフルモデル チェンジし、バイポーラ、縦配置の形態観察生体内で(図 1 b-3) 自然な足場に似ていますを取得します。確かに、進めてこれらのケーブルのような構造の使用特に破損した CNS の不利な環境による軸索再生を促進することと同様、未熟な神経細胞の移行の対象となる指導のため物理的な基質として哺乳類グリア瘢痕 (図 1)。この記事はアストロ サイトのマイクロ列の詳細な製作方法を提示する、位相コントラスト蛍光イメージの予想される細胞構築と現在の制限に関する包括的な議論と今後の方向性、技術。

図 1: インスピレーション、作製プロトコル、および整列のアストロ サイト ネットワークの提案されたアプリケーション。(A) 神経生物学のインスピレーション: (1) 神経芽細胞由来神経因性脳室下帯 (SVZ) を利用 (OB); 嗅球に向かって指示の移行で吻側の渡り鳥ストリーム (RMS) に縦一直線に並べられたグリア チューブ(2) 両生類や魚など非哺乳類神経組織の一部病変 (例えば切断脊髄) の両端を接続しの指導のための足場としてグリア橋の形成に起因する損傷後の再生を耐えることができます。軸索の再生。(B) 製造の概要: ミクロン サイズの中空ゲル マイクロ段 ECM、被覆ルーメンの構築 (1) (2) ラットの子犬で、縦型の (3) 自己組織から分離された主な皮質アストロ サイトの播種文化、将来移植研究のための生体材料箱詰めからバンドルの (4) の抽出のバンドル。(C)体内のアプリケーション: (1) これらの生活の足場はニューロン欠損領域を再作成する神経因性センターから指示されたニューロン移行のため設計されたグリア チューブとして可能性があります(2) の軸索ガイダンスを先駆的な発達のメカニズムと再生機構非哺乳類におけるグリア橋の反復可能性があります非寛容で軸索の再生を指示する容量を持つこれらのアストロの足場を授ける哺乳類のグリア瘢痕の環境。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

プロトコル

すべてのプロシージャ機関動物ケアとペンシルバニア大学で、マイケル ・ j ・ Crescenz 退役軍人医療センター利用委員会によって承認され、慈悲深いの NIH 公衆衛生サービス ポリシーのガイドラインを遵守ケアと動物実験 (2015 年)。

1. Agarose のゲル マイクロ列の開発

1. 寒天 3 g を計量してダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 100 mL を含む滅菌ビーカーに移し agarose 3% 重量/体積 (w/v) ソリューションを行います。ビーカーに滅菌磁気棒を加えてホット プレート ・ スターラーの表面の上に置きます。次の手順でその内容の蒸発を防ぐために覆われたビーカーを維持します。
2. アガロースと DPBS 100 ° C の温度で熱を 60 120 rpm でかき混ぜる。必要に応じて、これらの設定を調整して、ソリューションに変更当初から不透明な agarose が完全に解散したことを示す明確な外観と溶解過程の進行を常に監視します。
   注意: ホット ビーカーとソリューションは、高温!
3. アガロース溶液は加熱し攪拌、4 空 10 cm シャーレを取得し、それらの 2 つに DPBS の 20 の mL を追加します。鍼を置く (直径: 300 μ m、長さ: 40 mm)、1 マイクロリットル キャピラリー チューブをガラス (直径: 701.04 μ m、長さ: 65 mm、容量: 25.0 μ L)、およびバイオ セーフティ キャビネット内部電球ディスペンサー。液体アガロース溶液を消して、定数の約 50 ° C で加熱と agarose のゲル化を避けるために攪拌を維持します。
4. 電球ディスペンサーの下部開口部に鍼針を紹介します。キャピラリー チューブを外気に針を挿入します。キャピラリー チューブを固定するには、電球ディスペンサー シリンダーのゴム部分にそれの一部を入力します。
5. 空のシャーレの表面に液体のアガロース マイクロ ピペットで 1 mL を転送し、ながら内側に電球ディスペンサーのゴム製のキャップが挟まる、アガロース、接触 (挿入針) と垂直キャピラリー チューブの一方の端を配置します。ゆっくりとキャピラリー チューブにアガロースを描画する電球ディスペンサー キャップの圧力を解放します。
   注: キャピラリー チューブに液体 agarose の転送を急速に実行する必要があります。液体 agarose が残っている場合ペトリ皿表面で冷却し、十分な時間を (約 60 秒)、キャピラリー チューブに沿って agarose の適切な吸引を防止する、ゲル化開始。
6. 針を残して 5 分は、ゴム栓を手でキャピラリー チューブを慎重に引いて、電球ディスペンサー シリンダー内のキャピラリー チューブ内のゲルの無料ペトリ皿と聞かせて agarose の各電球チューブ針アセンブリの場所を固めると、チューブ内に agarose のゲル。
7. ゆっくりと引き出してキャピラリー チューブ; から、鍼針を手動で抽出します。新しく凝固 agarose シリンダーはまだ針を取り巻くこの手順でチューブからもスライドします。終わりに移動する滅菌鉗子の先端で鍼に沿ってマイクロ列を少しずつ動かして。オープン、DPBS 含むペトリ皿の上針を置き、鉗子でマイクロ列に、DPBS 押し込みます。
   注: アガロース マイクロ鍼針の除去時にガラス キャピラリー チューブ内で残っている場合ゆっくりとキャピラリー チューブからアガロース マイクロ段 25 mm ゲージの針とプッシュ DPBS と皿にします。
8. Microscalpels やホット ビーズ滅菌器を使用して鉗子を滅菌します。4% の w/v agarose を作る、寒天 4 g を計量し、DPBS 100 mL に転送します。熱し、ステップ 1.2 クリア 4% 液体アガロース溶液を取得するで説明したようにかき混ぜます。加熱と次の手順でソリューションの攪拌を維持します。
9. 郭清フードにマイクロ列シャーレを転送し、微細鉗子でマイクロ列を空のシャーレに移動します。視覚的なガイダンスの万国実体写真とマイクロ列を希望の長さにカットする microscalpel を利用します。ECM とセル追加マイクロ列の処理を容易にするために水平から 45^o角度で傾斜形両端に両端をトリミングします。
10. 以前同じシャーレのマイクロ-列を 3 つのステップし、の分離と並行して 4 つの構成要素を繰り返す < 各シリンダーの間 3 mm。マイクロ ピペットと 4% アガロース溶液 50 μ L をロードし、液体のストリーク/ラインを接続、4 つのグループに構造をバンドル マイクロ列配列に注ぐ (来世は「マイクロ列ボート」と呼ばれる)。構成要素間の距離を最小限に抑え、細い線ですばやく agarose を追加することによって、内部を詰まらせることがマイクロ柱の両端に 4% の agarose の動きを避けてください。
    注: は、アストロ サイトの足場を作製する必要はありません「ボート」に 4 つのマイクロ-列のグループを配置します。それにもかかわらず、船は作製プロセスを早めるためと移動し、後の手順でマイクロ列を処理するより安全な方法を提供するを提供します。
11. 追加の 4% の agarose のゲル化を許可するように 1-2 分のマイクロ列ボートを冷ます。接続の 4% の agarose によって微細鉗子でマイクロ列ボートをピックアップし、他 DPBS 含むペトリ皿 1.1.3 の手順で準備するマイクロ列を移動します。必要に応じて残りのマイクロ列とより多くのボートを作製します。
12. シャーレ マイクロ列やバイオ セーフティ キャビネットへのボートを移動し、30 分の紫外 (紫外線) ライトへの露出で消毒します。
    注意: は、紫外線への露出を防ぐために適切な保護具を着用します。
13. ECM 加算およびセルめっきがすぐに発生しない場合は 4 ° c、DPBS にマイクロ列ボート料理を格納後、1 週間まで。構造はこの期間内に使用しない場合は、マイクロ列作製手順を繰り返します。

2. 一次電池文化および分離

1. ラットから皮質アストロ サイト分離
   1. 次の手順の準備として、ハンクの 20 mL 平衡塩類溶液 (HBSS) 切り裂かれたティッシュのための貯蔵所として機能する 4 つの 10 cm のシャーレを追加します。氷の上のすべての料理を保つため。きれいな外科はさみ、鉗子、マイクロ-ヘラ、ホット ビーズ滅菌器でマイクロ メスを殺菌します。
   2. Prewarm 1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) と 0.15 mg/mL デオキシリボヌクレアーゼ (DNase) 0.25% トリプシンで 37 ° C で HBSSさらに、prewarm のダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) ハムの F-12 栄養混合物と 10% 牛胎児血清 (FBS) から成る 37 ° C でアストロ培。
   3. 低体温の状態にそれらを公開することで生後 0 または 1 日目 Sprague-dawley ラット仔の麻酔し、斬首で安楽死させます。ピン頭 19 mm を使用してステージにゲージの針が鼻、目の前方に配置されます。
   4. 目のすぐ後ろに、首の付け根からの前方、後方真ん中にメスで切開を行います。直接 T 字を形成、目の後ろから横に行く別の切開を行います。微細鉗子を使用して、頭蓋の皮膚/スカルを路肩側にします。
   5. 鉗子の 1 つのピンを配置することによって (上向き) 鼻で動物と外側の表面上の他の口の中に頭を保持します。滅菌マイクロ ヘラで脳を取り出し、冷蔵 HBSS でシャーレのいずれかに置きます。場所このシャーレ氷の上すぐにその後、すべては、使用時に除く回します。
   6. 以前解離フード内部万国実体写真下-20 ° C で保存花崗岩ブロックを移動します。解剖手順の間に、低温を維持する花崗岩ブロックの表面に脳組織でシャーレを配置します。次の手順で視覚的なガイダンスとして、万国実体写真を使用します。
   7. 嗅球は、そのまま残ります、鉗子または microscalpels でそれらを抽出切り出して。さらに、小脳を削除し、2 つの大脳半球を分ける正中切開、microscalpel を使用します。鉗子で半球を含む生鮮・冷蔵 HBSS ペトリ皿に転送します。
   8. 分離皮質のみを取得する microscalpel と半球の内側から中脳の構造を解剖します。皮質の組織から髄膜、シート状の構造物を剥離し、冷たい HBSS で新しいシャーレに分離皮質を転送する微細鉗子を使用します。次の手順でトリプシンの表面積を高めるために、組織をミンチに、microscalpel を使用します。
   9. Prewarmed トリプシン-EDTA (各管内 8 野) の 4 つの mL を含む 15 mL 遠心管に、野を転送するのにパスツール ピペットを使用します。37 ° C で 5-7 分のトリプシン-EDTA に大脳皮質組織を公開します。
   10. パスツール ピペットで慎重にトリプシン-EDTA を削除し、0.15 mg/mL DNAse の 400 μ l を追加私遠心管にソリューション。すべての組織に分離される液体の残りの組織部分がなくなるまで管または渦流を振りま します。組織を完全に解消できない場合は、パスツール ピペットの先端で残りのフラグメントを削除します。
   11. 遠心分離機管 200 x g で 3 分間の解離細胞のソリューションが含まれているセルを妨げないでパスツール ピペットで上澄みを削除します。マイクロ ピペット管にアストロ培 (2.1.2 のステップで定義されている) の 1 つの mL を追加し、再懸濁します、均一溶液を作成する揺り動かしなさい。
   12. T-75 フラスコにアストロ培地と血清ピペット 10 mL を転送します。マイクロ ピペットの 1 mL セル溶液 (2.1.11 の手順で準備) の 250 μ l をプレートにフラスコあたりのセルの価値がある 1 つの子犬脳フラスコに追加します。均等に排出された細胞液を培養培地に, 均一な配分を促進するフラスコを振といます。
   13. 37 ° C、5% CO₂で加湿のインキュベーターでメッキのフラスコの文化.24、72 h 文化に達すると、機械的に非付着細胞の種類、ニューロン、オリゴデンドロ サイトなどをデタッチするフラスコを揺り動かしなさい。
   14. その後、これらの縦長の各で、メディアの変更を実行します。培地付着細胞をカバーしていない、フラスコの底にあるので、フラスコを垂直に保持します。セルの抽出を避けるために、フラスコの底角に対してピペットの先端を押してパスツール ピペットで培を吸い出しなさい。元の水平位置にフラスコを置き、優しく血清ピペットで細胞をアストロ培地 10 mL を追加します。
   15. 各メディア変更後、フラスコをインキュベーターに返します。90% の confluency が達成された後は、機械的に任意の残りの非付着細胞を除去するもう一度フラスコを振りま します。
   16. 真空とパスツール ピペットで培を取り出すことでアストロ サイトを通路します。付着細胞上の 0.25% トリプシン-EDTA 血清ピペットで 5 mL を追加します。振とうフラスコ、トリプシンをカバーするすべてのセルを確認して 37 ° C および 5% CO₂で 5-7 分のフラスコを孵化させなさい。
   17. 血清ピペットで細胞にアストロ サイトの中の 1 つの mL を追加してトリプシンを癒します。血清ピペットでフラスコから細胞液を抽出し、滅菌 15 mL 遠心管にそれを転送します。3 分間 200 x g でチューブを遠心します。
   18. 血清ピペットで上澄みを除去し、アストロ サイト培養液 1 mL でそれを再懸濁します。同種細胞ソリューションにチューブを揺り動かしなさい。診断またはセルの自動カウンターにソリューション内のセルの数をカウントします。
       注: 90% 合流は、フラスコ約 300 万アストロ サイトが生成されます。
   19. T-75 フラスコにアストロ培地 10 mL を追加します。1:4 希釈を実行するには、培地を既に含む T-75 フラスコにピペットで細胞液 (ステップ 2.1.18) の 250 μ l を転送します。振とうフラスコのサーフェス全体で均質な細胞の分布を確認します。
   20. セルを通過する 90% の confluency を達成するたびに 2.1.16-2.1.19 の手順を繰り返します。
2. ラット胎仔の大脳皮質ニューロン分離
   1. 2.1.1 と 2.1.2 の手順 prewarmed のメディアが共同培地、Neurobasal 培地 (ニューロン) のための 2 %b-27 サプリメント + 1 %g-5 無血清サプリメント (アストロ) + 0.25% から成る例外として同じような準備に従う L-グルタミン。
   2. 二酸化炭素の窒息とタイミング妊娠 18 日ラットを安楽死させるし、斬首で死を確認します。
   3. ラット胎仔を抽出し、視覚的なガイダンスと滅菌はさみ、microscalpel、鉗子⁵³に堅実を使用して冷蔵花崗岩ブロックの表面にシャーレ HBSS で脳組織の残りの部分から皮質の解剖.頭や脳、大脳半球皮質の連続郭清後新しい HBSS いっぱいシャーレに各組織を転送します。
   4. トリプシンの表面積を高めるための小さな断片に大脳皮質組織をミンチします。転送、パスツールと 4-6 野 5 ml prewarmed トリプシン-EDTA の管にピペットし、組織を分離する 37 ° C で維持します。5-7 分で手動でミックスして組織の凝集を防ぐため管を揺り動かしなさい。
   5. 10 分後に、37 ° C からチューブを削除します。手順 2.1 で前述したように、トリプシン-EDTA を抽出し、0.15 mg/mL DNAse 液 1.8 mL で代用します。その後、渦ソリューションまで組織が表示されます同質、液体に浮かんでない組織片。
   6. 3 分間 200 x g で解離組織ソリューションを遠心します。上清を除去した後は、共同培養培地 2 mL に再懸濁します。診断またはセルの自動カウンターでこのソリューション内のセルの数をカウントします。
      注: 通常の利回りは、10⁶セル/大脳皮質半球 x 3.0 5.0 です。
   7. 2.0-4.0 x 10⁵セル/mL 上で定義した培養メディアの密度を持つ新しい携帯ソリューションを準備します。

3. マイクロ列内部アストロ サイトのケーブルの開発

1. ECM コア製造
   注: ECM、ハイドロゲル マイクロ柱の内部に実行するが細胞を同じ日に追加します。
   1. バイオ セーフティ キャビネット、内部準備 1 mg/mL 滅菌遠心チューブの共同培養培地における I 型コラーゲン ラットの尾のソリューション。使用している場合を除いてすべての回で氷の ECM ソリューションと遠心チューブを維持します。
   2. その pH を推定するリトマス試験紙のストリップにピペットで ECM ソリューションの 1-2 μ L を転送します。1 N 水酸化ナトリウム (NaOH) の ECM ソリューションの pH をそれぞれ増減するマイクロ ピペットと塩酸 (HCl) 1 μ L を追加し、ピペットの上下を均質化します。リトマス試験紙のストリップと新しい pH を確認し、pH が 7.2 7.4 範囲で安定するまで、必要に応じてより多くの酸またはベースを追加します。
   3. ステップ 1.2 から郭清フードにペトリ皿を移動し、空、滅菌 35 または 60 mm シャーレに滅菌微細鉗子で 4-5 マイクロ列またはボートを転送します。株分け業を使用すると、指導のため、各マイクロ列と空の DPBS と空気の泡の内腔に吸引の一方の端でピペットの 10 μ L チップを移動します。次の手順で追加した ECM が内腔の間で自由にやり取りできるように万国実体写真と気泡の有無を確認します。
   4. ECM ソリューション、10 μ L ハイドロゲル マイクロ列の一方の端に対してヒントし、ルーメン (約 3-5 μ L)、万国実体写真と ECM のエントリを観察に合わせて十分なソリューションを提供できる場所で P10 マイクロ ピペットを充電します。マイクロ列の両端に ECM ソリューションの小さな貯水池 (2-4 μ L) のピペットします。
      注: は常に 4-5 マイクロ列を管理または防ぐために一度に 1 つのボート長期言語構造には、乾燥のマイクロ列構造のくしゃくしゃがありますので。完全に乾燥させたマイクロ列に細胞の利用を防止する、ペトリ皿の面にしっかりと取り付けます。これは後述の潜伏期間中に流出する ECM を引き起こす可能性がありますので、(として水和) 共同文化メディアの過剰な量をマイクロ列に追加できません。
   5. 列の潜伏中に完全に乾くことを防ぐために湿度のシンクを提供するシャーレの周りのリングでピペットの共培養メディア。神経細胞やアストロ サイトを追加する前にコラーゲンの重合を促進する 1 時間の 37 ° C および 5% の CO₂で ECM を含むマイクロ列を含むペトリ皿を孵化させなさい。
      注: はインテリアを含む固体 ECM のコアは、どちらも観察できる、万国実体写真を使用してなく ECM は中空の内腔の内面をコーティング層を形成する必要があります。ECM は、コアを形成する層だけが残っているまでに潜伏期間を続行します。この層を形成とアストロ サイト細胞液はメッキの手順でマイクロ列の内部を埋めることができます。
   6. 潜伏期間中に (後述)、アストロ サイト細胞液を準備します。
2. グリアとニューロン シード マイクロの列
   1. 手順 2.1.16-2.1.19 で説明したように (の間に第 4 そして第 12 道) メッキ アストロ サイトを通路します。フラスコ内のセルの数をカウント後、細胞培養液中に浮遊 9.0 12.0 × 10⁵セル/mL の溶液の密度で細胞液を準備します。
   2. 堅実を使用して、マイクロ-列の一方の端に P10 マイクロ ピペットの先端を置き、完全にそれを埋めるための内腔に十分な電池ソリューション (~ 5 μ L) を転送します。上記、ECM で行われ、各マイクロ列の両端に携帯ソリューションの小さい貯蔵所を追加します。
   3. ECM にアストロ サイトの添付ファイルを促進する 1 時間の 37 ° C および 5% の CO₂でペトリ皿上メッキ マイクロ列を孵化させなさい。ニューロンは、マイクロ列には追加されない場合、3.2.5 をステップに進みます。
   4. 初期潜伏期 1-2 μ L での株分け業を観察しながらピペット、マイクロ柱の両端に 2.2.7 手順で取得した大脳皮質ニューロン ソリューションの追加します。十分なメディアが、乾燥を避けるため、再び神経細胞の接着のため許可する CO₂を 37 ° C、5% で 40 分間インキュベートし料理の存在を確認します。
      注: 大脳皮質ニューロンのソリューションも追加できます慎重にマイクロ ピペットをシャーレから培地を除去した後の手順 3.2.4 束形成後 1 〜 2 日。
   5. 孵化後期間、慎重には、それぞれ 3 または 6 ml の 35 または 60 mm のペトリ皿、共同文化メディアのメッキ マイクロ列を含むペトリ皿を入力します。文化を促進する CO₂を 37 ° C、5% でメッキ マイクロ列を維持、6-10 時間後バンドルされており、ケーブルのような構造を形成する必要があります整列のアストロ バンドルの自己集合。
3. アストロ サイト ケーブル アーキテクチャの安定化
   注: バンドル構成要素、養殖の約 6-12 時間の形成後、アストロ サイトの足場の配置構造の崩壊を防ぐために以下の手順を実行します。
   1. 滅菌遠心管では 3 mg/mL ラット尾コラーゲンを準備私共培養メディア ソリューション。7.2 7.4 3.1.2 のステップで説明する手順を次に溶液の pH を調整します。使用しないときは、氷の上コラーゲン株式と共培養メディアを管理し、すべての回で氷の上準備されたコラーゲン溶液を配置します。
   2. マイクロ ピペット、マイクロ列の水和により湿度シンクを作成する皿の両側にいくつかのメディアを残してとアストロ サイトの足場シャーレからメディアを削除します。可視化を支援する万国実体写真の下皿を配置します。
   3. マイクロ ピペット、マイクロ列、株分け業を用いた視覚誘導の各終わりにコラーゲン溶液と放電の 2-3 μ L を取る。この料理は、皿の周囲湿度シンクとして機能する側面のまわりの十分なメディアであることを確認します。新しく追加されたコラーゲンのゲル化を促進するために加湿のインキュベーターで CO₂を 5% と 37 ° C で 30 分間マイクロ列とペトリ皿を孵化させなさい。
   4. ゆっくりと共培養メディアの 3 または 6 mL を追加 (35、60 mm ペトリ料理、それぞれ)、ペトリネット、ピペットと料理や文化を 37 ^oC と 5% CO₂で加湿のインキュベーターで料理。

4. ゲル内部からアストロ サイトの束の抽出

1. ガラス coverslips オートクレーブで滅菌します。無菌細胞培養グレード水ポリ-L-リジン (PLL) の 20 μ g/mL の溶液を準備します。
2. バイオ セーフティ キャビネット、内部手動で滅菌 10 cm シャーレに滅菌ガラス coverslips を転送し、coverslips をカバーする十分な PLL のソリューションを追加します。
3. 表面をコートする 37 ° C で 30 分間、PLL ソリューションで覆われて、coverslips を孵化させなさい。Coverslip に細胞培養グレードの水を追加し、Pasteur のピペットを使用する 3 回 30 分すすぎ後パスツール ピペット PLL ソリューションを削除します。
4. 整列のグリア束の形成後滅菌微細鉗子を滅菌シャーレに繊細なマイクロ列を転送し、脱水を防ぎバンドル健康を維持するマイクロ ピペットと共培養メディアの 10 μ L の小さなプールを追加します。堅実を用いた視覚的なガイダンス、滅菌手術用鉗子を端から端まで注意深く引いてハイドロゲル マイクロ列からアストロ サイトのバンドルを抽出します。
5. 鉗子でアストロ サイトのバンドルを保持、PLL コート coverslip でそれをマウントします。修正し、以下のプロトコルで染色します。

5. 研究の in Vitro免疫細胞化学

注: この研究の一次抗体がウサギ抗グリア酸性線維性蛋白 (GFAP) (1: 500)、抗 β-チューブリン III (1: 500) をマウス、ウサギの抗コラーゲン I (1: 500), マウス抗ネスチン (レバレッジ) とウサギ抗ビメンチン (1: 100)。ロバ抗マウス 568、ロバ抗家兎 568、ロバ反うさぎ 488、ロバ抗マウス 568 (すべての 1: 500) され、二次抗体。すべてのインスタンスで完全マイクロ列をカバーする各ソリューションの十分な量を追加します。

1. 化学の発煙のフードの中 1 x DPBS で 4% (v/v)/ボリューム ホルムアルデヒド溶液を準備します。
   注意: ホルムアルデヒドは、毒性化合物には発癌性、知られている別の容器で処分する必要があります。常にこの化合物化学の発煙のフード内を操作し、白衣、安全メガネと手袋などの個人保護用具 (PPE) を利用します。
2. マイクロ-列の場合ハイドロゲル シリンダーを誤って吸引せずパスツール ピペットの構造体を含むシャーレから文化メディアを破棄します。マイクロ列または (どちらのまま、ペトリ皿上に) マウントされた coverslips をカバーする十分なホルムアルデヒド溶液を追加し、18-24 ° c. で 35 分間インキュベート
3. 固定マイクロ列または血清ピペットと coverslips から 4.0% ホルムアルデヒド溶液を抽出します。すぐに追加し PBS を 2 回削除、それから 10 分 3 分の 1 の時間に浸ることによって 3 回 PBS で固定マイクロ列をすすいでください。
4. 濃度 4 %v/v の濃度 0.3 %v/v NHS 溶液を溶媒として用いた非イオン性洗剤を使用してソリューションの準備のため PBS で通常の馬血清 (NHS) を溶解します。
5. マイクロ列またはピペットと coverslips シャーレから PBS を削除します。セルを permeabilize 18-24 ° C で 60 分のマイクロ-列/coverslips をカバーする十分な 0.3% 中性洗剤溶液を追加します。
6. 取り、洗剤とリンスを 2 回すばやく PBS で 3 回 5 分 4 %nhs の必要な量と一次抗体の各計算を浸すことによって目的とする抗体の濃度の溶液を調製します。
7. ペトリ皿から PBS を削除し、十分な一次抗体を追加 (4% で希釈した NHS DPBS) マイクロ列または抽出されたアストロ サイトの束をカバーするソリューション。孵化 4 ° C で一晩 (12-16 h)
8. 第一抗体溶解液を取り出して、5 分間浸漬による PBS で、3 回に 2 回をすぐに洗います。各抗体希釈 1: 500 で 4.0 %nhs ソリューションに存在して、暗闇の中、二次抗体溶液を準備します。
9. 18-24 ° C で 2 時間二次抗体溶液を細胞を孵化させなさいインキュベーションの全体の時間、光への暴露を避けるためにアルミ箔のマイクロ列シャーレをカバーします。
10. 二次抗体溶液を削除し、核を染色する 18-24 ° C で 10 分間のヘキスト ・ ソリューション (1:10, 000) を追加します。
    注意: ヘキストは知られている変異原性発癌物質として扱う必要があります。したがって、別の容器に処分する必要があり、PPE を使用する必要がありますすべての回でこのエージェントを操作するとき。
11. 5 回、その後 5-10 分のたびに PBS で洗い、PBS とアルミ箔でカバーの 4 ° C で汚されたマイクロ列を格納します。マウントされたアストロ バンドルの場合水土台媒体のドロップをバンドルに追加固定バンドル上別のガラス基板に配置、長期的なストレージおよびその後画像処理用マニキュアで両方 coverslips をシールします。

6. Live 死んだ (カルセイン AM/エチジウム ホモ) 生存率アッセイ染色

1. 試薬溶液を準備するには、1 x DPBS 10 mL に 5 μ l カルセイン AM (無水ジメチルスルホキシド (DMSO) 4 mM) と 20 μ l エチジウム ホモ-1 (EthD-1) (DMSO/H₂O 1:4 v/v 2 mM) を追加します。アルミ箔とソリューションをカバーしたり、光から保護するために暗闇の中で保存します。
2. パスツール ピペット メッキ マイクロ列を含むシャーレからメディアを吸引し、(上記準備) 構造をカバーする十分なソリューションを追加します。37 ° C、5% CO₂、光からソリューションを保護するために覆われてペトリ皿で 30 分間インキュベートします。
3. マイクロ ピペットやパスツール ピペットとソリューションを削除します。ステップ 5.3 で説明したように、DPBS で 2-3 回を洗い流してください。皿のサイズに従って DPBS とペトリ皿の洪水します。イメージ セルすぐにその後または使用して落射蛍光顕微鏡を用いたイメージング。
   注: 変換膜透過性のカルセイン AM カルセインを代謝活性の高い細胞のカルセインの蛍光グリーンが得られます。死んだ細胞は、EthD 1 のセルと核酸、赤い蛍光性の原因とそのバインディングへの参入を可能にする膜侵害セルとしてマークされます。

結果

当初は、位相差顕微鏡は、アストロ サイトの接着とバンドル形成の進行と時間の関数として、細胞構築全体の安定性を監視する使用されました。めっき後 1 h で、球状形態 (図 2 a) マイクロ柱のルーメンを通してアストロ サイトが見つかりました。5 h で、アストロ サイト始めプロセスを拡張する、契約、8 h で中細胞展示完了プロセス入り形態マイクロ列 (図 2 a) の長手方向の軸に沿ったケーブルのような構造を形成します。特に、マイクロ列にわたって細胞の分散最初の存在と比較して、アストロ サイトの内部に沿って密な束のネットワークを形成するために契約している登場(図 2 b)。初期セルの配置は、しばしば、縦軸に沿ってまとめアストロ サイト ネットワークの後のジッパーを閉じて、マイクロ列 (図 2) の中心部...

ディスカッション

PNS のより協力的な環境と比較して、中枢神経系特に頭部外傷、神経変性の有害な結果の処理に制限されます。哺乳類の中枢神経系への深刻な侮辱、グリア瘢痕が形成されると、軸索の伸長を阻害するプロテオグリカン¹⁴を分泌する無秩序の反応性アストロ サイトの密な網目に囲まれた線維化と炎症性細胞の核心から成る。この傷跡は、軸索終末¹²の再生に対して物理的および生化学的な妨害として機能します。なお、成人の哺乳類の中枢神経系は神経因性センターは下帯、海馬歯状回および可能性のある他の通常非アクティブに制限されますので外傷や神経変性の後で失われた細胞を復元する新しい神経細胞の限られた資源を所有しています。エリア⁵⁴。理想的な戦略は、現在のアプローチは、アドレスに失敗する中枢神経系の再生能力に限界の両方の側面を回避でしょう。など、我々 の研究グループは、神経欠損領域と再生軸索成長円錐のガイド付きの拡張に向けて神経移行経路の生活を提示を目的としたアストロ ベースの足場を開発しました。アガロース マイクロ柱の内部にコラーゲ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
鍼灸(300 µm直径)	Lhasa Medical	HS.30x40	マイクロカラムルーメンの希望のサイズに応じて、直径を変えることができます。
ペトリ皿	フィ	ッシャー08772B
ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水(DPBS)	Invitrogen	14200075
ポリスチレン使い捨て血清ピペット	フィ	ッシャー13-678-11D
アガロース	シグマ	A9539-50G
マイクロリットルガラス毛細管(701 µm)	フィ	ッシャー21-170J	直径は、マイクロカラムシェルの所望のサイズに応じて変えることができる。
マイクロキャップバルブディスペンサー	フィ	ッシャー21-170J	には、マイクロキャップチューブが付属しています。
ホットプレート	フィッシャー	SP88857200
磁気バー	フィッシャー	1451352
ピペット	シグマ	Z683884-1EA
25mmゲージ針	フィ	ッシャー14-826-49
マイクロメス	ロボズサージカル	RS-6270
はさみ	ファインサイエンスツール	14081-09
鉗子	ワールド精密機器	501985
ホットビーズ滅菌器	シグマ	Z378550-1EA
ステレオスコープ	ニコン	SMZ800N
マイクロヘラ	フィ	ッシャーS50821
テールI型コラーゲン	コーニング	354236	4およびordmで維持します。Cを選択し、必要な場合にのみ取り外します。使用中は氷を使用して温度を保ちます。
微量遠心チューブ	フィッシャー	02-681-256
水酸化ナトリウム (NaOH)	フィッシャー	SS2661
塩酸 (HCl)	フィッシャー	SA48-1
リトマス紙	フィッシャー	09-876-18
ハンクの平衡塩溶液 (HBSS)	Invitrogen	14170112	4°Cで保存します。
0.25% トリプシン-EDTA	Invitrogen	25200056	-20 & ordm で保存します。Cと37ºで暖かい。使用前にC。
ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼ(Dnase)I	Sigma		10104159001-20ºで保存。Cと37ºで暖かい。使用前にC。
Gibco	11330-032	とDulbeccoの変更されたイーグルミディアム(DMEM)	、4 ºCで保存します。
ウシ胎児血清(FBS)	Atlanta Biologicals	S11195	-20°Cで保管。
出生後0日目または1日目 Sprague Dawleyラットの子犬	Charles River	strain 001
神経基底胚性ニューロン基礎培地	Invitrogen	21103049	4ºで保存;Cと37ºで暖かい。使用前にC。
B-27 無血清サプリメント	Invitrogen	12587010	-20 º で保存。Cと37ºで暖かい。使用前にC。
L-グルタミン	Invitrogen	35050061	-20 º で保存します。Cと37ºで暖かい。使用前にC。
G5 星状細胞サプリメント	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley 胚の日 18 ラット	Charles River	Strain 001
パスツールピペット	Fisher	22-042816
15 mL 遠心チューブ	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
遠心分離機	Fisher	05-413-115
血球計算盤	フィッシャー	02-671-6
インキュベーター	フィッシャー	13 998 076
ホルムアルデヒド 40%	フィッシャー	F77P-4	ホルムアルデヒドは発がん性があることが知られている有毒化合物であり、別の容器に廃棄する必要があります。
ガラスカバースリップ	フィッシャー	12-548-5M
マニキュア	電子顕微鏡科学 (EMS)	72180
フルオロモント マウント メディウム	サザン バイオテクノロジー	0100-01
ポリ-L-リジン	シグマ	P4707
リン酸緩衝生理食塩水	フィッシャー	BP3994
トリトン X-100	シグマ	T8787
正常な馬の血清	Gibco	16050-122
ウサギの抗グリア酸性fibrillary蛋白質(GFAP)の一次抗体	Millipore	AB5804	-20ºCで保存。
マウス抗β-tubulin III一次抗体	Sigma	T8578	-20°Cで保存
ウサギ抗コラーゲンI一次抗体	Abcam	ab34710	-20°Cで保存。
ウサギのanti-vimentin	Millipore	AB3400	-20°Cで店。
マウス抗ネスチン	ミリポア	AB5326-20	°Cで保存。
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	4°Cで保存してください。
ロバ抗ウサギ568二次抗体	Invitrogen	A10042	4°Cで保存。
ロバ抗ウサギ 488 二次抗体	Invitrogen	A21206	4°C で保存します。
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC. Hoechstは、発がん性物質として扱うべき変異原物質として知られています。したがって、別のコンテナに廃棄する必要があります。
カルセイン AM	シグマ	C1359	4 mM 無水 DMSO
エチジウム ホモダイマー-1	ライフ テクノロジー	E1169	2 mM DMSO/H2O 1:4 (v/v)
ジメチルスルフォキサン (DMSO)	シグマ	276855
A1RSI レーザー走査型共焦点顕微鏡	ニコン		免疫標識コンストラクトの共焦点再構成を行うために使用されます。
Eclipse Ti-S 顕微鏡	ニコン		位相差画像の撮影に使用します。Nikon Elements Basic Researchソフトウェア(4.10.01)とインターフェースしたQiClickカメラを使用したデジタル画像取得。