この研究は、WT新生児マウスからのニューロンの単離のための技術を提示する。新生仔マウスから脊髄を注意深く切開し、続いて脊髄組織からニューロンを機械的および酵素的に切断することが必要である。
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この記事について
サマリー
要約
我々は、脊髄ニューロンの単離および培養のためのプロトコールを提示する。ニューロンは、新生児C57BL / 6マウスから得られ、生後1〜3日に単離される。通常、1匹の繁殖対から生まれた4〜10匹の仔マウスを1回の実験で集め、イソフルランで安楽死させた後、各マウスから脊髄を個別に採取する。脊柱を切開し、次いで脊髄を柱から解放する。次いで、ニューロンおよび他の細胞が組織から放出されることを可能にする酵素的プロテアーゼの送達の表面積を増加させるために、脊髄を細かく切り刻む。次いで、粉砕を用いて細胞を溶液に放出する。その後、この溶液を密度勾配で分画して、溶液中の様々な細胞を分離し、ニューロンを単離することができるようにする。約1-2.5×10 6個のニューロンを1つの繁殖群から単離することができる。次いで、ニューロンを接着剤でコーティングされたウェル上に播種する適切な成長および成熟を可能にするrs。ニューロンは、成長および培養培地中で成熟に達するまでに約7日を要し、その後、治療および分析のために使用することができる。
概要
脊髄の病理を理解するには、巨視的レベルと顕微鏡レベルの両方で、様々なモデルを使用する必要があります。大小の動物モデル1,2,3は 、脊髄疾患および傷害のインビボ研究のために使用される。 インビボでこれらの問題を研究することにはメリットがありますが、脊髄の解析は全脊髄ホモジネートまたは組織切片4に限定されます。これは、居住ニューロンおよび周囲グリアの間で脊髄における特定の応答および標的を分離しようとするときに、あいまいさを生じる。遺伝的に操作されたマウスの利用可能性の増加は、細胞レベルおよび分子レベルでの生物学のより詳細な調査を可能にする。したがって、ここでは新生仔マウスモデルが使用され、 インビトロでの脊髄ニューロンの固有の特性および生物学の研究が可能になる。
in vitroでのニューロンの単離と維持は特に簡単ではない大人のげっ歯類の皮質組織からのニューロンの単離のための技術が比較的豊富にあり、それは相当数の単離されたニューロン（ すなわち数百万個）これとは対照的に、脊髄組織からのニューロンの収量は、組織の質量がより少ないために、部分的に8,9,10よりも低い。さらに、マウスでは、新生児の単離のための技術が相対的に不足している脊髄ニューロン、および既存の方法は、より低いニューロン収量（ ....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
この手技における動物のケアおよび治療は、コロラド大学の動物実験および使用委員会のガイドラインに従って行われた。
1.ソリューションの準備
- 表1に示すように、すべての溶液を適切な温度で調製して保管します。
2.コーティングウェルとスライド
注：ニューロンはプラスチックやガラスの表面には接着しません。
- ニューロンの単離の1日前に、無菌の24ウェル培養プレートのウェルを0.5mLのPoly-D-Lysine（PDL; 表2 ）でコーティングし、それを層流フードO / Nに残す。
注：好ましい方法は、周辺ウェルからの蒸発がより加速され、一貫性のない結果につながる傾向があるため、24ウェルプレートを使用し、中心ウェルのみをコートすることである。さらに、ガラススライドはウェルの前に配置することができますoコーティング。ニューロンは、コーティングされたガラススライドに付着し、後でさらなる顕微鏡画像化のために除去することができる。 - 分離の日に、ウェルからPDLを除去する。残りの水を取り除いて1時間乾燥させる前に、滅菌水で数分間洗ってください（下記参照）。
- 乾燥後、スライドをラミニンで被覆する（ <....
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結果
この技術を用いて、1匹のリター（4〜10匹の仔）は、培養プレートへの播種に適した1-2.5×10 6個のニューロンの単離を可能にする。典型的には、4〜8ウェルを上記の濃度（ すなわち 300,000細胞/ mL）で播種する。 図3は低倍率（ a ）および高倍率（ b ）倍率の光学顕微鏡で培養して1週間後のこの濃度でのニューロンの出現を示す。しかしながら、我々はまた、500,000細胞/ウェルの高濃度および100,000細胞/ウェルの低濃度で細胞を培養することもできた。より高い濃度を使用するには、栄養素が急速に枯渇し、細胞にとって有毒な酸性環境につながるため、環境条件に中程度の注意を払う必要があります。より低い濃度では、細胞は完全な成熟に達しない傾向があり、支持細胞の過増殖（ すなわち希突起膠細胞、miクロストリジウム、星状細胞）が観察される。
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ディスカッション
この技術は、脊髄ニューロンの信頼できる培養を可能にする。技能の習熟度が達成されると、完了するまでに約3.5時間かかります。我々は、約4時間で2匹の別個の同腹仔（合計16匹のマウス）からニューロンの単離を行うことができた。実行可能性の重要なステップは、マウスから脊髄を巧みに抽出することができることです。歩留まりは、いくつかのウェルをメッキすること、および様々な条件下でニューロンを試験する能力を可能にする。我々は、成熟後にニューロンを処理し、ウェスタンブロット分析を用いてタンパク質発現を確実に評価することができた。さらに、ニューロン付着のためにウェル内部のガラススライドを使用することにより、ニューロンのさらなる染色分析が可能になる。
この手順は、胚組織および関連する労働強度を必要としない点で有利である。さらに、成人の脊髄を使用して、十分な組織を収集する必要はありませんeニューロンの分離。これは、成体マウスで見られるように、ニューロン生理学における年齢の複合的な行動の要因を防止する。しかしながら、この技術は制限がないわけではない。以前に述べたように、老化ニューロンは新生児マウスを使用する.......
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開示事項
著者には開示がない。
謝辞
著者には謝辞はありません。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Hibernate A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A マイナスカルシウム - 500 mL | Brainbits | HA-Ca | |
| http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ Glutamax 100X - 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27サプリメント50X - 10 mL | モフィッシャー | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| パパイン、凍結乾燥 - 100 mg | ワージントン | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| 神経基礎Aミディアム - 500 mL | モフィッシャー | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U / mL) | サーモフィッシャー | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| ポリ-D-リジン(PDL)臭化水素酸塩-5 mg | シグマ-アルドリッチ | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US マウス |
| ラミニン-1 mg | モフィッシャー | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| トリパンブルー - 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep 密度グラジエント メディウム - 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| ジクロロジメチルシラン (DMDCS、シグマシリコート) | シグマ-アルドリッチ | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| クロロホルム | シグマアルドリッチ | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| ガラスピペット-9インチ | シグマ-アルドリッチ | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| ピペットバルブ - 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® ペトリ皿、ガラス - 60 x 15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | |
| http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US 滅菌済み 24 ウェル細胞培養プレート | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| ハウザー血球計算盤 (ガラス計数室) | フィッシャー・サイエンティフィック | 02-671-6 | スライド https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| ガラス - 12 mm 滅菌カバーガラス - コーティングされていない | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit モノクローナル抗体 - 100 µL | Abcam | ab177487 | パラホルムアルデヒド(PFA)に固定し、5% BSAでブロッキングした後、12 mmカバーガラス上の細胞を1:200に希釈した抗体で4°Cで18時間インキュベートしました。C |
| MAP-2 マウスモノクローナル抗体 - 50 µL | Abcam | ab11267 | パラホルムアルデヒドに固定し、5% BSA でブロッキングした後、12 mm カバーガラス上の細胞を 1:500 希釈した抗体で 4 °C で 18 時間インキュベートしました。ハ |
参考文献
- Qayumi, A. K., et al. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).
- Fang, B., et al. Ische....
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