Method Article

生理活性タンパク質や生物学的応用の光化学ハイドロゲルのペプチドをパターニング

DOI:

10.3791/55873

⸱

September 15th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute, 2Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies, Rensselaer Polytechnic Institute, 3Department of Bioengineering, Northeastern University, 4Department of Bioengineering, University of Texas at Arlington

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この方法は、光重合を用いてクリック化学の手法を提供するポリエチレング リコール (PEG) ゲルの表面にタンパク質やペプチドのパターンを作成する生体外での細胞の研究のため生体信号を固定化、.

Abstract

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細胞の挙動と細胞分化に影響を与えることができる多くの生物学的刺激があります。一般的な細胞培養方法は、セルの動作を制御する媒体内の可溶性因子に依存します。ただし、特定のマトリックス バインド成長因子などのモチーフをシグナル伝達、細胞間シグナリング、や細胞への一般的な影響は、空間的生化学的な手がかり可溶性追加を模倣することはできません。さらに、基板剛性など、行列の生物物理プロパティは細胞の運命は、簡単操作ではない従来セル培養のプラクティスを使用しての重要な役割を果たします。このメソッドは、光化学を使用して合成ポリエチレング リコール (PEG) ゲル上パターンの生理活性タンパク質を提供する簡単なプロトコルについて述べる。このプラットフォームにより基板の剛性と空間的生化学的な手がかりの独立制御。これらのゲルは、広い範囲の生理学的関連性の高い剛性値を実現できます。さらに、これらのゲルの表面は生理活性ペプチドで photopatterned をすることができます。 またはチオール-エンでタンパク質は、化学反応をクリックします。これらのメソッドは、表面固定化後のタンパク質の機能を保持するために最適化されています。さまざまなパターンを作成する興味のペプチッドか蛋白質に適用できる汎用性の高いプロトコルです。最後に、空間的特定の信号に対応する、これらの生理活性ハイドロゲルの表面に播種された細胞を時間の経過と共に監視できます。

Introduction

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セルの動作に影響を与える多くの刺激があります。一般的に、典型的な細胞培養技術は、細胞の反応を引き出すために水溶性の要因に頼るただし、この方法には制限があります。これらのメソッドは一般的に見られるすべてのシグナリング モチーフを正確に表示することができる体内。そのようなシグナル伝達のメカニズムには、人里離れた成長因子、細胞間シグナリング、固有空間的生化学的手がかりが含まれます。また、基板剛性細胞の挙動と細胞分化の重要な役割を再生することができます、簡単に一般的な細胞培養プラクティス1,2を使用して操作できません。生体材料のアプローチは、これらのシグナル伝達メカニズムを探索を開始する新しいプラットフォームを提供します。特に、ゲル基板剛性3,4、固定化タンパク質とペプチド5,6のチューニングと空間的特定のパターン7,を作成するため優秀な候補者であります。8。

ヒドロゲルは細胞外マトリックス (ECM)....

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Protocol

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1 ハイドロゲル合成のための材料の準備

PEGDA, リチウム (LAP) フェニル-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate, フィブロネクチン無菌条件下での
  1. 準備在庫ソリューションに基づいて、。(表 1 a) の計算。
    1. 重量を量り、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 中の化合物を溶解します。通常、作業液濃度が 50 と 200 mg/mL (5-20% の重量/容積) の PEGDA を維持します。殺菌のため 0.22 μ m シリンジ フィルターを介して PEGDA ソリューションをピペットします
      。 注意: 光からそれらを保護するためにラップ箔で覆われて PEGDA ソリューション。PEGDA (推奨) 各実験のための新鮮なソリューションを準備します
      2. 。
    2. 西川フィブロネクチン蛋白質粉末は、製造元に基づく ' s 推薦。1 mg/mL、分注でフィブロネクチン原液を維持 60 に 100 μ L の因数にし使用するまで-20 ° C で保存します。いくつかの時間のための 4 ° C で因数を解凍または一晩前に使用します。タンパク質株式が無菌状態で用意されていない場合は殺菌のため 0.22 μ m シリンジ フィルターを使用します
      。 注: フィブロネクチンは細胞接着に使用されます。その他の ECM 蛋白質を置き換えることができます
      3. 。
    3. 原液のラップを量り、....

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Results

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ペグ ハイドロゲルの表面の生理活性パターンを作成するプロトコルを図 1に示します。ボリュームと各原液 (表 1 a) の濃度を計算するスプレッドシートが開発されました。ハイドロゲルの表面に固定化されるタンパク質は、2 iminothiolane (図 1B) に変更されます。この反応は、表 1 bからボリュームを使用して実行されます。前駆体ゲル溶液を調製して、ラップ (図 1A) と PEGDA の 10% 重量/体積を持つ。様々 な前駆体 PEGDA 濃度は、必要な基板剛性 (図 2A) を生成するため使用できます。フィブロネクチンは細胞添付ファイル用この前駆体溶液内.......

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Discussion

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このプロトコルは、生物学的応用のための生理活性タンパク質パターンを作成するためのメソッドを提供します。さまざまな実験のこのプロトコルを適応させることができますいくつかの変更があります。最初に、異なる種類の細胞の細胞添付要件は異なります。ゲルに悪い細胞接着が最初に観測される場合は ECM タンパク質前駆体溶液中の濃度が増加することをお勧めします。その他の ECM 蛋白質は、ファイブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、またはそれらの組み合わせの種類を含むの代わりに使用できます。各セル新型細胞接着はハイドロゲル形成前に最適化してください。このプロトコルは、ユーザーが設計したフォトマスクもできます。目的のアプリケーションに基づいて、そのマスクと作り出すことができる様々 な機能のサイズ、形状、および全体的なパターン。制服の固定は、フォトマスクの不在で実現できます。

このプロトコルには、特定の制限があります。代表結果で強調表示されている、このメソッドは、各ステップで紫外線の量に敏感です。ハイドロゲル形成段階露出オーバー以降表面化反応に使用可能なアクリル グループ.......

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Disclosures

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著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

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この調査は、アメリカ心臓協会の科学者開発補助金からの助成金によってサポートされた主に (g. d. に 12SDG12050083)、国立衛生研究所 (R21HL102773、g. d. に R01HL118245)、全米科学財団 (あわせて 1263455 とG. d. に CBET-1350240)。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PEG-ジアクリレート(PEGDA)Laysan BioACRL-PEG-ACRL-3400他のベンダーを通じて合成または購入することもできます。異なる分子量を使用することができます。
実験室で合成リチウムフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸(LAP)
フィブロネクチンコーニング356008ラミニン、マトリゲル
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)シグマD8537-500ML
フォトマスクFineLine イメージングn/a高解像度DPIの透明シートにカスタム印刷します。
バインダークリップ各種ベンダー
コンパクトUV光源(365nm)UVPUVP-21その他にもUV光源が使用可能で、電力のキャリブレーションが必要です。
2-イミノチオラン(ピアストラウト試薬)Thermo Sci.26101
エルマン'試薬:DTNB;5,5-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)Thermo Sci.22582
ヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVECs)6-10
実験で使用しました。完全なEGM-2媒体は細胞の維持のために使用された
0.25% トリプシン EDTA生命技術25200-056
トリプシン中和剤生命技術R-002-100
遠心分離機さまざまなベンダー
血球計算盤ハウザー科学 明るい線
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)シグマ アルドリッチE6758
0.22µmフィルターCell Treat229743
1mLシリンジ
ガラス顕微鏡スライドFisher Sci.12-550C
プラスチックスペーサーさまざまなベンダー0.5mm
70%エタノールBICCA2546.70-1
バイオシールドシールド19-150-0010
ブラッドフォード試薬 BIO-RAD
脱塩樹脂 - Sephadex G-25GE Healthcare95016-754
Microspin ColumnsThermo Sci.
AR-G2 リホーメータTAインスツルメンツ
されたなどの他の細胞付着タンパク質を使用することができます EGM-2 Media Lonza CC31-56, CC-3162 EGM-2 without growth factors の lonza 継代番号を厚さバイオPI69725

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yao, S., et al. Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth. Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).
  2. Evans, N. D., et al.

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Hydrogel PatterningPhotochemistry TechniqueBioactive ProteinsPEG HydrogelsThiol ene ChemistrySubstrate StiffnessSpatial CuesProtein ImmobilizationCell MigrationVEGF Patterning

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