生理活性タンパク質や生物学的応用の光化学ハイドロゲルのペプチドをパターニング

Summary

この方法は、光重合を用いてクリック化学の手法を提供するポリエチレング リコール (PEG) ゲルの表面にタンパク質やペプチドのパターンを作成する生体外での細胞の研究のため生体信号を固定化、.

Abstract

細胞の挙動と細胞分化に影響を与えることができる多くの生物学的刺激があります。一般的な細胞培養方法は、セルの動作を制御する媒体内の可溶性因子に依存します。ただし、特定のマトリックス バインド成長因子などのモチーフをシグナル伝達、細胞間シグナリング、や細胞への一般的な影響は、空間的生化学的な手がかり可溶性追加を模倣することはできません。さらに、基板剛性など、行列の生物物理プロパティは細胞の運命は、簡単操作ではない従来セル培養のプラクティスを使用しての重要な役割を果たします。このメソッドは、光化学を使用して合成ポリエチレング リコール (PEG) ゲル上パターンの生理活性タンパク質を提供する簡単なプロトコルについて述べる。このプラットフォームにより基板の剛性と空間的生化学的な手がかりの独立制御。これらのゲルは、広い範囲の生理学的関連性の高い剛性値を実現できます。さらに、これらのゲルの表面は生理活性ペプチドで photopatterned をすることができます。 またはチオール-エンでタンパク質は、化学反応をクリックします。これらのメソッドは、表面固定化後のタンパク質の機能を保持するために最適化されています。さまざまなパターンを作成する興味のペプチッドか蛋白質に適用できる汎用性の高いプロトコルです。最後に、空間的特定の信号に対応する、これらの生理活性ハイドロゲルの表面に播種された細胞を時間の経過と共に監視できます。

Introduction

セルの動作に影響を与える多くの刺激があります。一般的に、典型的な細胞培養技術は、細胞の反応を引き出すために水溶性の要因に頼るただし、この方法には制限があります。これらのメソッドは一般的に見られるすべてのシグナリング モチーフを正確に表示することができる体内。そのようなシグナル伝達のメカニズムには、人里離れた成長因子、細胞間シグナリング、固有空間的生化学的手がかりが含まれます。また、基板剛性細胞の挙動と細胞分化の重要な役割を再生することができます、簡単に一般的な細胞培養プラクティス^1,2を使用して操作できません。生体材料のアプローチは、これらのシグナル伝達メカニズムを探索を開始する新しいプラットフォームを提供します。特に、ゲル基板剛性^3,4、固定化タンパク質とペプチド^5,6のチューニングと空間的特定のパターン^7,を作成するため優秀な候補者であります。⁸。

ヒドロゲルは細胞外マトリックス (ECM)^9,10の生物物理学的・生化学的共通性による組織工学の足場として一般的に使用されます。自然ポリマーは、生体適合性、ボディの多くのティッシュで見つけたに足場のため、一般的な選択肢です。天然高分子の基質として使用制限は、化反応の化学簡単操作の部分を欠いていることです。その一方で、合成ハイドロゲルようペグ、ターゲットを絞った化学^11,12の優れたプラットフォーム。また、PEG ヒドロゲルは細胞応答を引き出すない、したがって不活性のバックボーンとして生理活性の足場を作成に使用されます。

生理活性のゲルを作成するには、光重合とチオール-エン化学反応の方をクリックします。これらの光反応、重合と UV 光源が必要です。光重合開始剤は、紫外線に導入されるとき、フォーム ラジカルへの債券を解除します。論文ラジカル反応を開始するために必要なタンパク質活性^12,13に悪影響を与えることができます。したがって、重合とタンパク質の生理活性を維持するために UV 露光時間を最適化することが重要です。

このメソッドのヒドロゲルはアクリル酸アクリル酸鎖成長重合によって合成されます。ペグ レート (PEGDA) のモノマーは、お互いヒドロゲルの構造に責任がある分岐高分子ネットワークを形成する反応します。ゲル前駆体溶液の PEGDA 単量体の濃度は、基板の剛性を制御します。毛穴のヒドロゲルのサイズを小型のため、フィブロネクチンなどの ECM 蛋白質は細胞接着を目的としてハイドロゲル内簡単に組み込むことができます。最後に、これらのゲルは生理活性ペプチドで表面パターニングすることができます。 またはチオール-エンでタンパク質は、化学反応をクリックします。ここでは、ハイドロゲル システム内で無料官能アクリレート未反応蛋白質またはペプチッド紫外線にさらされたときに位置する無料のチオールと反応します。タンパク質やペプチドはハイドロゲル表面に固定化後、ヒドロゲル格納できます 4 ° C で数週間の生理活性を失うことがなく。これは、利便性、柔軟な実験計画および研究所間の連携の可能性を提供しています。全体的にみて、このプラットフォームにより生体力学的・空間的生化学的制御、細胞挙動に影響を与える機会を互いの独立しました。

Protocol

1 ハイドロゲル合成のための材料の準備

PEGDA, リチウム (LAP) フェニル-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate, フィブロネクチン無菌条件下での

1. 準備在庫ソリューションに基づいて、。(表 1 a) の計算。
   1. 重量を量り、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 中の化合物を溶解します。通常、作業液濃度が 50 と 200 mg/mL (5-20% の重量/容積) の PEGDA を維持します。殺菌のため 0.22 μ m シリンジ フィルターを介して PEGDA ソリューションをピペットします
      。 注意: 光からそれらを保護するためにラップ箔で覆われて PEGDA ソリューション。PEGDA (推奨) 各実験のための新鮮なソリューションを準備します
   。
   2. 西川フィブロネクチン蛋白質粉末は、製造元に基づく ' s 推薦。1 mg/mL、分注でフィブロネクチン原液を維持 60 に 100 μ L の因数にし使用するまで-20 ° C で保存します。いくつかの時間のための 4 ° C で因数を解凍または一晩前に使用します。タンパク質株式が無菌状態で用意されていない場合は殺菌のため 0.22 μ m シリンジ フィルターを使用します
      。 注: フィブロネクチンは細胞接着に使用されます。その他の ECM 蛋白質を置き換えることができます
   。
   3. 原液のラップを量り、PBS を溶かす; 典型的なストック濃度は 25 mg/mL。超音波溶解に支障がある場合。ソリューションを殺菌のため 0.22 μ m フィルターを通過します。箔包装のラップをカバーし、4 ° c で数ヶ月まで維持します
      。 注意: ラップは光化学用重合します
   。
2. ハイドロゲル形成の滅菌ガラス スライド金型を準備します。
   1. オートクレーブ ポリエステル シート各ゲル型のいずれかが必要です。スライド ガラス 2 つおよび 3 つのプラスチック製のスペーサー (厚さ 0.5 mm) 各ゲル型のために少なくとも 2 時間の 70% エタノール漬が、一般的に一晩浸すことができます。70% のエタノールの使用する前に 10 分漬各ゲル型のための 5 つのバインダー クリップ
   。
   2. を許可するそれら空気乾燥数時間携帯文化フード スライド ガラス、スペーサー、および小型オートクレーブ養生シートにバインダー クリップを配置します
   。
   3. スライド ガラスの端の周りのプラスチック製のスペーサーを配置することによって準備ハイドロゲル型。上の 2 番目のガラス スライドを配置します。しっかり隣同士バインダー クリップを 2 つのそれぞれの長い側と上にスペーサーをセキュリティで保護します
      。 注: これが正しく組み立てられていない場合ゲル溶液漏れ出し
   。
   4. 表面殺菌細胞培養と金型フードを使用する前に 30 分の紫外線です。途中、フリップの両方の面を公開する型
   。

2。無料チオールが付いている蛋白質を変更する

1. スプレッドシートの計算を使用して蛋白質 (表 1 a) のチオールにアミンを変換するための貯蔵液の準備します。
   、反応バッファーをつくる
   1. は pH 8 に PBS を調整し、5 mM EDTA を追加します。0.22 μ m シリンジ フィルター滅菌ピペット反応バッファーします
      。 注: 二硫化物結束の形成からチオールを保護すると、EDTA は重要です。チオール グループは、発生する反作用のための減らされた形態おく必要があります
   。
   2. の 2 iminothiolane を重量を量る (トラウト ' s 試薬) 原液濃度 2 mg/mL (14 mM) の反応バッファー内で溶解します。殺菌のため 0.22 μ m シリンジ フィルターをソリューションを通過します。数ヶ月まで 4 ° C の原液を格納します
      。 注: 2 iminothiolane は分子タンパク質の溶媒露出遊離アミンと反応すると無料のチオールに変換します
   。
   3. は、0.1 から 1 mg/mL の濃度で反応バッファーにタンパク質を再構築します。場合を除き、以前滅菌、殺菌のため 0.22 μ m シリンジ フィルターを介してこのソリューションをピペットします
      。 注: この蛋白質はハイドロゲル表面に模様が生化学的な信号です。また、タンパク質の濃度が異なりますが、高い濃度は強いタンパク質パターンに最適です
   。
2. 2 iminothiolane とタンパク質を一緒に両方の原液を混合することによって反応する; 表 1 b を使用して、正しいボリューム比を計算します。通常は、タンパク質に 8:1 2 iminothiolane のモル比を使用します
   。 注: より大きい蛋白質またはそれ以上希釈濃度、2 iminothiolane の高いモル比を使用します。製造元を参照してください ' s プロトコル ¹⁵
。
3. では、室温で 1 時間反応を孵化させなさい。脱塩スピンのコラムを使用して残りの反応は、次の製造元からチオールの蛋白質の製品を削除する ' プロトコル ¹⁶.
   注: この樹脂の排除限界は 5 KDa
。
4. 使用・ イールマン ' s 法定量的測定を無料チオール タンパク質あたりの数。製造元に従う ' ¹⁷ 試金のためのプロトコル
。

3。ハイドロゲル形成

表 1 から計算される

1. 値に基づいてゲル前駆体溶液を作成します。ミックス一緒に PEGDA、フィブロネクチン、重ねボリューム。ピペットの同種のソリューションを確保するが、泡の作成を避けるために、積極的にソリューション。光から保護ソリューションを保持します
。
2. は、ゲル型の 2 枚のガラス スライド間慎重にゲル前駆体溶液をピペットします。通常、金型を 800 と 1000 μ L のボリュームを追加します。UV ライトに金型でゲル溶液を公開 (波長: 365 nm、電源: 3 4 mW/cm ²) に 1-2 分ヒドロゲルを形成する
   。 注: は、機能をパターニング表面蛋白質を制限が長期の紫外線ゲルを公開しないでください
。
3. バインダー クリップを脱いで、そっと両サイドのスペーサーに反対の圧力を適用して上部のガラス スライドを削除します
。
4. は、ハイドロゲル サンプルをカットする適切なサイズの生検パンチを使用します。複製として機能し、サンプルを制御するゲルの四角形から複数のヒドロゲルのパンチアウトします
。

4。ハイドロゲル剛性測定

8 mm 平行平板用いたレオメータの

1. パンチ 8 ヒドロゲルを mm 径生検パンチ。1 つのゲルのサンプルを読み込む、レオメータ (材料の表 を参照してください).
2. 下平行平板形状作りまでの直径は 8 mm のゲルの表面と接触。0.5 mm 厚のハイドロゲル サンプルの 0.5 mm の間隔を維持します
。
3. 0.1% のひずみ、0.1 Hz 周波数、および 37 で 5 分間実行時間スイープ ° c. の平均 G ' 値は各時間スイープをまたいで。各組成物の複製のための独立したゲルを実行します
   。 注: G ' 値は時間ポイント; 間安定する必要があります場合は、% のひずみ、周波数スイープを実行して、適切な選択値 ¹⁴.

5。蛋白質のパターニング

1. 準備コンピューター支援設計 (CAD) プログラムを使用してフォトマスク用所望のパターン。フォトマスクを透明なシートで、高解像度のプリンターを使用して印刷します。70% のエタノールの使用する前に 10 分で、フォトマスクを浸します。使用する前に細胞文化フード乾燥空気にフォトマスクを許可します
。
2. は、表面パターニングのために、ゲルの表面に手順 2 で準備チオール タンパク質溶液を追加します。1-2 μ L/cm ² ごとカットされたゲルの表面にチオール タンパク質溶液をピペットします
   。 注意: 蛋白質の量を最小限に抑えることが重要です。ハイドロゲル サンプルの表面全体を均等にカバーする十分のみ追加します
。
3. は、ハイドロゲルの表面にフォトマスクを慎重に配置します。フォトマスクとハイドロゲル表面の気泡ができないようにします。軽く下に押して任意の気泡を除去するマスクを形成する
。
4. 紫外光の第 2 ラウンドをハイドロゲルを公開 (波長。365 nm、電源: 3 4 mW/cm ²) 30 60 s. の
   注意: 蛋白質の機能の損失を引き起こすことがなく強力なパターンを作成する十分な紫外線への暴露パターンに重要です
。
5. は、未反応の種を削除し、各ハイドロゲル ウェル プレート内に PBS のヒドロゲルを洗います。各井戸にゲルを配置するときに注意してください。パターン付きのサーフェスが顔が動作していることを確認します。4 ° C で PBS でゲルを洗浄します。ゲルは、4 で少なくとも 2 週間安定した ° C

6。細胞播種のゲルを準備する

1. は、播種前に 37 ° C で 5 ~ 10 分の基礎培地でゲルを孵化させなさい。ひと臍帯静脈血管内皮細胞 (Huvec)、成長因子なし EGM 2 媒体を使用します。媒体それぞれに追加のボリュームを最小化ハイドロゲルの浮遊を防ぐためにも。48 ウェル プレートの中の 250 μ L のボリュームを使用します
。 300 x でプレートを
2. スピン g 3 分、ハイドロゲル、井戸の底に位置して、フローティングではないことを確認します。細胞の播種直前にこれを行うにします
。

7。セルのゲル上のシード

細胞播種のため

1. の使用標準的な滅菌哺乳類細胞培養プロシージャおよび実験プロシージャ。標準細胞剥離プロトコルを使用して培養フラスコから Huvec を削除します。滅菌 PBS の培養皿を洗浄し、トリプシン 37 で 3-5 分の間孵化させなさい ° C
2. 余分なセル培地またはトリプシン中和剤溶液でトリプシンの細胞懸濁液を急冷します
。
3. 5 分慎重に上澄みを除去し、細胞ペレットを保つため 300 × g で遠心分離機に細胞懸濁液をスピンダウンします
。
4. は、成長因子と基底 EGM 2 細胞ペレットを再懸濁しません。セルをカウントするため、検定を使用します
。 ゲルの邪魔をしないようにうまくいったのでそれぞれの中心にゆっくりとピペッティングによる各ハイドロゲルに
5. 追加 75,000 セル/cm ² 面。37 ° C で細胞文化のインキュベーターにウェル プレートを配置します。いくつかの日、定期的に観測用皿を削除します
。

8。生物活性の評価

1. 流体培養基 LB の 37 ° C、200 rpm で軌道懸濁液の懸濁液で一晩培養 大腸菌。大腸菌 文化スピンダウン、デカント、PBS の最小限の量で細胞ペレットを再構成します。リゾチームを量り、1 mg/ml の原液を再構成します
。
2. は、遠心チューブにリゾチーム原液の少量 (25 μ L) をピペットします。ラップ重合 (0-12 mM) のさまざまなレベルを追加し、紫外線の 1 分のサンプルを公開します。別のグループでリゾチームにラップ (2 mM) の同じ量を追加、さまざまな UV 光の時代にサンプルを公開 (0-4 分)。各治療のため複製が含まれます
。 最終リゾチーム蛋白質濃度 0.5 mg/mL の各リゾチーム サンプルを解決する
3. 追加集中 エシェリヒア属大腸菌 の等量。室温で 4 h の混合溶液をインキュベートします
   。 注: これにより、細菌の細胞壁を溶解し、溶液に蛋白質を解放する機能リゾチーム時間
。
4. 肯定的な制御の 大腸菌 を培養した未処理のリゾチームを使用これに 100% 活性測定を検討します。ネガティブ コントロールとして単独で PBS で培養したリゾチーム ソリューションを使用します
。
5. スピンのサンプルに細胞の残骸を削除し、上清を保持します。内細菌の lysate の量を測定する上清タンパク質の濃度を定量化するブラッドフォードの試金を実行します
。
6. 次のメーカー、ブラッドフォードの試金の実行 ' s プロトコル ¹⁸。倍は陰性対照と比較してタンパク質濃度の変化を計算します
。

Results

ペグ ハイドロゲルの表面の生理活性パターンを作成するプロトコルを図 1に示します。ボリュームと各原液 (表 1 a) の濃度を計算するスプレッドシートが開発されました。ハイドロゲルの表面に固定化されるタンパク質は、2 iminothiolane (図 1B) に変更されます。この反応は、表 1 bからボリュームを使用して実行されます。前駆体ゲル溶液を調製して、ラップ (図 1A) と PEGDA の 10% 重量/体積を持つ。様々 な前駆体 PEGDA 濃度は、必要な基板剛性 (図 2A) を生成するため使用できます。フィブロネクチンは細胞添付ファイル用この前駆体溶液内...

Discussion

このプロトコルは、生物学的応用のための生理活性タンパク質パターンを作成するためのメソッドを提供します。さまざまな実験のこのプロトコルを適応させることができますいくつかの変更があります。最初に、異なる種類の細胞の細胞添付要件は異なります。ゲルに悪い細胞接着が最初に観測される場合は ECM タンパク質前駆体溶液中の濃度が増加することをお勧めします。その他の ECM 蛋白質は、ファイブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、またはそれらの組み合わせの種類を含むの代わりに使用できます。各セル新型細胞接着はハイドロゲル形成前に最適化してください。このプロトコルは、ユーザーが設計したフォトマスクもできます。目的のアプリケーションに基づいて、そのマスクと作り出すことができる様々 な機能のサイズ、形状、および全体的なパターン。制服の固定は、フォトマスクの不在で実現できます。

このプロトコルには、特定の制限があります。代表結果で強調表示されている、このメソッドは、各ステップで紫外線の量に敏感です。ハイドロゲル形成段階露出オーバー以降表面化反応に使用可能なアクリル グループ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PEG-ジアクリレート(PEGDA)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-3400	他のベンダーを通じて合成または購入することもできます。異なる分子量を使用することができます。
実験室で合成	リチウムフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸(LAP)
フィブロネクチン	コーニング	356008	ラミニン、マトリゲル
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	シグマ	D8537-500ML
フォトマスク	FineLine イメージング	n/a	高解像度DPIの透明シートにカスタム印刷します。
バインダークリップ	各種ベンダー
コンパクトUV光源(365nm)	UVP	UVP-21	その他にもUV光源が使用可能で、電力のキャリブレーションが必要です。
2-イミノチオラン(ピアストラウト試薬)	Thermo Sci.	26101
エルマン'試薬:DTNB;5,5-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)	Thermo Sci.	22582
ヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVECs)	6-10
			実験で使用しました。完全なEGM-2媒体は細胞の維持のために使用された
0.25% トリプシン EDTA	生命技術	25200-056
トリプシン中和剤	生命技術	R-002-100
遠心分離機	さまざまなベンダー
血球計算盤	ハウザー科学 明るい線
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)	シグマ アルドリッチ	E6758
0.22µmフィルター	Cell Treat	229743
1mLシリンジ
ガラス顕微鏡スライド	Fisher Sci.	12-550C
プラスチックスペーサー	さまざまな	ベンダー0.5mm
70%エタノール	BICCA	2546.70-1
バイオシールド	シールド	19-150-0010
ブラッドフォード試薬	BIO-RAD
脱塩樹脂 - Sephadex G-25	GE Healthcare	95016-754
Microspin Columns	Thermo Sci.
AR-G2 リホーメータ	TAインスツルメンツ