ラマンイメージングと多変量解析を組み合わせて、植物細胞壁のリグニン、セルロース、およびヘミセルロースを視覚化する

Summary

このプロトコルは、ラマンイメージングおよび多変量解析を用いて、植物細胞壁のリグニン、セルロースおよびヘミセルロースを視覚化するための一般的な方法を提示することを目的とする。

Abstract

プラントバイオマスへのラマンイメージングの適用は、水溶液について空間的および組成的情報を提供することができるので、増加している。分析には通常、大量の試料調製は必要ありません。ラベルを付けることなく構造的および化学的情報を得ることができる。しかしながら、各ラマン像は数千のスペクトルを含む。これは、特に類似の化学構造を有する構成要素について、隠された情報を抽出する際に困難を生じさせる。この研究では、この問題に対処するために多変量解析を導入しています。このプロトコルは、植物細胞壁内のリグニン、セルロースおよびヘミセルロースを含む主成分を視覚化するための一般的な方法を確立する。このプロトコールでは、試料調製、スペクトル取得、およびデータ処理のための手順が記載されている。これは、試料調製およびデータ分析における操作者の技能に大きく依存する。このアプローチを使用することにより、非専門家によるラマン調査を行い、HIを得ることができる植物細胞壁分析のための高品質データおよび有意な結果を提供する。

Introduction

植物バイオマスは地球上で最も豊富な再生可能資源であり、主にリグニン、セルロース、ヘミセルロースで構成されており、バイオエネルギーとバイオベースの化学物質の魅力的な供給源と考えられています¹。残念ながら、それは劣化に抵抗し、植物細胞壁に加水分解安定性または構造的堅牢性を与えることができます。このような耐性は、アクセス可能な表面積、バイオマスの粒子サイズ、重合度、セルロースの結晶化度、および保護リグニン^2に起因します。したがって、植物細胞壁の構造的および化学的性質を包括的に理解することは、植物生物学および化学の観点からも、また商業的利用の観点からも重要です。クロマトグラフィー、質量分析、核磁気共鳴分光法など、一般的に使用される湿式化学分析では、測定されたサンプルの平均的な組成データのみが得られます。さらに、これらの方法は侵襲的であり、植物組織の元の構造を破壊します³。

ラマンイメージング技術は、空間的に分解された化学情報を非破壊的に視覚化するための強力なツールです⁴。レーザー光を使用して光子による非弾性散乱を引き起こし、分子の振動から生じる偏光率の変化に依存します。この場合、水は弱いラマン散乱を引き起こすため、このアプローチは生物学的サンプルのin situ調査に適しています⁵。ラマンイメージング技術を植物細胞壁に適用することで、単一細胞のスケールや細胞壁の層^{6の解像度で、植物細胞壁の構造と組成を本来の状態で解明することができます}。植物細胞壁の一般的なラマンイメージング解析は、一般に、1)サンプル調製、2)スペクトル取得、3)データ処理の3つのステップで構成されます。

ラマンイメージングの主な利点の1つは、最小限のサンプル調製でラベルフリーで非破壊的なスペクトルを実現できることですが、対象の表面を露出させるためには、物理的なサンプルセクショニングが必要です。このプロセスは、光学的focus^{7を維持することに依存するため、平らな表面を得るために慎重に実行する必要があります}。スペクトル取得には、画質と長時間の取得とのバランスが必要です⁸。データ処理は、特にセルロースやヘミセルロースなどの類似した化学構造を持つ成分について、画像データから化学情報を効果的に抽出することを目的としています。スペクトルの重なりが強いため、正確なスペクトルを識別することは困難です。この場合、多変量解析は、隠れている構造情報と化学情報を効果的に明らかにするための直接的なアプローチです⁹。この研究では、リグニン、セルロース、ヘミセルロースなどの植物細胞壁の主要成分を視覚化するためのラマンイメージングの使用を説明する一般的なプロトコルを提示します。

Protocol

サンプル調製

1. 植物サンプル（ 例えば、ポプラステム）から小さな組織ブロック（約3mm×3mm×5mm）を切断する。
2. 組織を沸騰している脱イオン水に30分間浸します。直ちに室温（RT）で30分間脱イオン水に移す。組織が容器の底に沈み、組織の空気が除去され、組織が軟化したことを示すまで、このステップを繰り返します。
   注：このステップの前に下に沈むサンプルについては、このサイクルを一般に3〜5回繰り返す。
3. 純粋なPEGと同様に、脱イオン水中のポリエチレングリコール（PEG）の20,50,70,90％（v / v）アリコートを調製し、溶液を65℃に保つ。
4. 組織を一連の勾配付きPEG浴中でインキュベートして、水を置換し、PEGが浸潤するのを可能にする。
   注：典型的には、分子量2000（PEG2000）を有するPEGが包埋に使用される。
   1. 組織をgで処理する（a）20％PEGを1時間、（b）50％PEGを1.5時間、（c）70％PEGを2時間、（d）90％PEGを2時間、および（e）10時間100％PEG。
5. カセットをオーブンで65℃に予熱します。ブロックを含むPEGをカセットに注ぎ、予め温めたピンセットまたは針を用いて組織ブロックを所望の位置に配置する。
6. ゆっくりとカセットを冷却し、使用するまでRTで組織を保存する。
7. シャープなカミソリの刃を使用して、標的組織を含むPEGブロックを小さなブロック（約1cm×1cm×2cm）に解剖し、ミクロトームにマウントする。
8. PEGブロックから薄い切片を切り取ります（通常3〜10μm）。
9. 組織からPEGを除去するために、切片を10倍の時計ガラス中の脱イオン水ですすぐ。
10. セクションをトルエン/エタノール（2：1、v / v）で6時間浸して抽出物を除去する。 65mLの脱イオン水、0.5mLの酢酸、および0.6gのナトリウム塩を混合することによって反応液を調製するビーカーで儀式する。 1mLの反応液と3mLの反応液を5mLバイアルに加えます。バイアルの上にネジ止めします。
11. バイアルを75℃の水浴中で2時間加熱し、組織のリグニンを除去する。ウォッシャーグラスで脱イオン水で10回洗浄します。
12. 未処理/脱リグニンされた切片をガラス顕微鏡スライドに移す。ブラシや針で注意深くセクションを展開します。ティッシュペーパーで余分な脱イオン水を除去する。
13. セクションをD ₂ Oに浸します。ガラスカバースリップでサンプルを覆います。カバースリップをマニキュアでシールして、D ₂ Oの蒸発を防ぎます。

2.スペクトル取得

1. 共焦点ラマン顕微鏡の機器操作ソフトウェアを開く。レーザー（波長= 532nm）をオンにし、100倍の顕微鏡対物レンズで結晶シリコンの表面に焦点を合わせ、較正ボタンをクリックして機器を較正します。
2. 楽器を切り替える光学顕微鏡モードに切り替え、顕微鏡ランプを点灯させる。ステージ上に顕微鏡スライドをマウントし、カバースリップを対物レンズに向けます。
3. サンプルを20倍の顕微鏡対物レンズで見て、関心領域を探します。カバーガラスに浸漬オイルを塗布し、液浸顕微鏡の対物レンズ（60X、開口数NA = 1.35）に切り替えます。サンプルの表面に焦点を合わせます。
4. 装置をラマン試験モードに切り替え、顕微鏡のランプをオフにします。
5. 長方形のツールを使用してマッピング領域を選択します。ステップサイズを変更して、得られたスペクトルの数を決定する。
   注：ステップサイズに注意してください（通常、対物レンズの開口数で計算されるスポット直径よりも大きく、理論上は1.22λ/ NAです）。これを下回るとオーバサンプリングが発生します。
6. 最適なスペクトルパラメータを設定して、最適な信号対雑音比（SNR）とスペクトル品質を適切な取得時間（通常8時間未満）サンプルの適合性に注意してください。一般に、レーザー（532nm）、フィルター（100％）、穴（300）、スリット（100）、分光計（1,840cm ^-1 ）、溝（1200t）、対物レンズ60Xオイル）、および獲得時間（2秒）。
7. データ処理の前にスペクトルデータを保存し、ユニバーサルフォーマット（ 例えば、 TXTファイル）に変換する。

3.データ分析

1. スペクトル解析データ（TXTファイル）をデータ解析ソフトウェア（Matlabなど）にロードします。データセットにノイズ低減技術を適用してSNRを改善する（Savitzsky-Golayアルゴリズムやウェーブレットアルゴリズムなど）
2. 未処理サンプルを使用して、リグニンおよび多糖の画像を生成する。リグニンイメージングでは、芳香環の対称伸縮振動に起因する^{1600cm -1}付近のスペクトルピークを考慮する。多糖イメージング（セルロースおよびヘミセルロースを含む）については、スペクトルピークaCHおよびCH _2の伸張のために2,889cm -1に丸まった。
3. 脱リグニンされたサンプルを使用して、セルロースおよびヘミセルロースの画像を生成する。得られたスペクトルに対してセルフモデリングカーブ分解能（SMCR）を実行して、セルロースおよびヘミセルロースのスペクトルを識別し、それらの分布を画像化する。
4. 得られたデータに対して主成分分析（PCA）およびクラスタリング分析を行い、異なる細胞壁層からラマンスペクトルを区別する。

Results

図1は、植物細胞壁のラマンイメージングのための典型的なマイクロラマンシステムの概要を示す。一例として、ポプラ（ Populus nigra L.）の元のラマンスペクトルは、有意なベースラインドリフトおよびスパイクを有する（ 図2a ）。ラマンイメージングデータセット（APRI）の自動前処理方法を実行した後、これら2つのスペクトル汚染物質は首尾よく除去される（ 図2b ）。ポプラの典型的なラマンスペクトルを図3に示し、そのバンド割り当てを表1に示す 。リグニンのラマン像は、芳香環構造（ 図4a ）に起因する1550-1,650cm ^-1のスペクトル領域の積分によって生成される。

Discussion

植物細胞壁は、細胞コーナー（CC）、二次壁（S1、S2、およびS3層を有するSW）および化合物中間薄層（CML、中間薄層および隣接する一次層）を含むいくつかの層に組織化された複合体である壁面）であり、試料調製中に平坦な表面を得ることが困難になる。したがって、木材より複雑な構造を有する植物サンプル、特に草は、しばしば細かい切片化を可能にするために凝固する必要がある。 PEGは、水に可溶であるため、切断およびラマン検査のための理想的な硬質マトリックスである。これは、脱イオン水ですすぐことによって容易に除去することができる。包埋に使用されるPEGは、1,000~20,000の異なる分子量を有する。 PEGの分子量が高いほど浸透能力は低い¹⁰ 。 D ₂ Oは、リグニンの蛍光を減少させるのに役立ち、2,490cm ^-1に顕著なピークを有するが、蛍光干渉を排除しない。二1）サンプルとバックグラウンドの蛍光とCCDの熱変動がベースラインドリフトを引き起こす可能性があり、2）宇宙線が感度の高い検出器に著しい影響を与える可能性があります。狭帯域幅のスパイクとして...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ミクロトーム	Thermo Scientific	Microm HM430
共焦点ラマン顕微鏡	堀場 Jobin Yvon	Xplora
オーブン	上海 ZHICHENG	ZXFD-A5040