ここでは、成人の筋肉組織からのヒト筋芽細胞の純粋な集団を得るための方法を説明する。これらの細胞は、in vitro骨格筋分化を研究するため、特にCa 2+シグナル伝達に関与するタンパク質を研究するために使用される。
方法論記事
* These authors contributed equally
ここでは、成人の筋肉組織からのヒト筋芽細胞の純粋な集団を得るための方法を説明する。これらの細胞は、in vitro骨格筋分化を研究するため、特にCa 2+シグナル伝達に関与するタンパク質を研究するために使用される。
衛星細胞(SC)は、筋線維の原形質膜と周囲の基底層との間に位置する筋幹細胞である。彼らは筋肉の再生に不可欠です。骨格筋において頻繁に起こる傷害の際に、SCが活性化される。それらは筋芽細胞として増殖し、筋肉病変を修復するために分化する。筋肉分化の間に起こる多くの事象の中で、サイトゾルCa 2+シグナルは非常に重要である。これらのCa 2+シグナルは、細胞内空間、特に貯蔵操作Ca 2+エントリー(SOCE)からのCa 2+流入と同様に、内部Ca 2+貯蔵からのCa 2+放出から生じる。この論文では、整形外科手術後に収集された筋肉サンプルからヒト筋芽細胞の純粋な集団を得るために使用される方法論について説明する。組織を機械的および酵素的に消化し、細胞を増幅させ、次いで、細胞の特異的存在に基づいてフローサイトメトリーによって選別するfic膜マーカー。得られた後、ヒト筋芽細胞を増殖させ、培地から増殖因子を除去することによって分化することを約束する。特異的転写因子の発現レベルおよびin vitro免疫蛍光を用いて、対照条件下で、およびCa 2+シグナル伝達に関与するタンパク質をサイレンシングした後の筋形成分化プロセスを評価する。最後に、信頼できる再現性のあるSOCEの測定値を提供するレシオメトリックなCa 2+プローブとしてのFura-2の使用について詳しく説明します。
ヒト骨格筋は、筋原性前駆細胞の融合から生じる収縮性多核筋繊維の群からなる。骨格筋は、筋繊維(筋帯)の原形質膜と基底板との間に位置する骨格筋幹細胞であるSCの存在により、損傷後に再生する能力を有する。損傷を受けていない筋肉では、SCはほとんどが静止状態にある。機械的ストレスまたは損傷に応答して、SCが活性化(筋芽細胞)となって増殖し、SCプール1、2を補充する新しい筋線維または自己複製を形成するために、どちらかの分化を受けます。長年にわたり、SCおよびその子孫、筋芽細胞を骨格筋生検から単離するためのいくつかの技術が開発された。これらの細胞上で発現される細胞表面マーカーおよび蛍光活性化細胞選別(FACS) 3の方法論のより深い理解により、4、5、筋肉サンプルからヒト筋芽細胞の純粋な集団を単離することが可能です。
カルシウムシグナリングは、骨格筋の発達、ホメオスタシス、および再生を調節する。特に、SOCEと呼ばれる細胞内貯蔵枯渇後に活性化されるCa 2+流入は、これらのプロセスにとって非常に重要である6 。細胞刺激により、エンドソー/筋小胞体(ER / SR)におけるCa 2+レベルが減少し、それにより、ER / SR 7を補充するためにCa 2+流入を可能にする原形質膜Ca 2+チャネルが活性化される。 SOCEに関与する2つの主なタンパク質は、ER / SR Ca 2+感知間質相互作用分子1(STIM1)タンパク質および原形質膜Ca 2+チャネルOrai1である。骨格筋は、これらの2つのタンパク質ならびに同じファミリーの他のタンパク質を豊富に発現する(STIM2 aND Orai2-ORAI3)8,9及び一過性受容体電位カノニカル(TRPC)ファミリー10、11、12、13のいくつかのCa 2+チャネル-permeable。 SOCE経路を通じたCa 2+流入は、筋形成/再生14にとって非常に重要である。 STIM1またはOrai1タンパク質の変異は、筋機能に有害な影響を与え、主に筋緊張低下につながる15 。 SOCE障害を有する動物モデルはまた、強化された疲労性6、16、17と一緒に、減少した筋肉量と力を表示します。前述したように、他のSTIMタンパク質およびOraiタンパク質ならびに多くのTRPCチャネルは、骨格筋において発現され、それらのそれぞれの役割はこれまで決定されていない。ノックすることでdそれらの発現レベルを所有しているので、ヒトの骨格筋分化中のSOCEおよびそれらの役割におけるそれらの影響を調べることが可能である。
SOCE測定は、電気生理学的電流記録およびCa 2+測定の2つの異なるアプローチを用いて行うことができる。電気生理学は、関心のある電流およびそれに関連する電気生理学的特徴を測定するので、確かに直接的な方法である。しかしながら、この技術は、主に筋肉細胞のサイズが大きく、内因性SOCE電流が小さいため、筋肉細胞に適用することは非常に困難である。サイトゾルCa 2+イメージングは技術的に非常にアクセス可能ですが、サイトゾルで測定されたCa 2+レベルはCa 2+の流入と細胞または内部貯蔵庫からの再ポンピングの両方を反映するので、測定はより間接的です。
ヒト骨格の小片から筋芽細胞を単離することを含む方法論この論文では、酵素消化、増幅、およびFACS後の筋肉を説明します。時間の経過に伴う分化マーカーの発現に続く筋肉分化および免疫蛍光プロトコールのプロセスが記載されている18 。最後に、SOCEの測定およびCa 2+シグナル伝達および骨格筋分化における異なるイオンチャネルの役割について説明する。
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健康な患者の整形外科手術中に、手術用の廃棄物としてヒトの筋肉サンプル(半腱腱筋から採取した組織)を採取した。ヒト研究に関連するすべての方法は、スイスの規制当局のガイドラインと規制に従って実施され、スイスのジュネーブ条約当局(CER番号12-259プロトコル)からの欧州委員会Cantonale d'Ethique de la Recherche 。インフォームドコンセントと書面による同意は、研究に関わるすべての成人被験者から得られた。
ヒト骨格筋からの筋芽細胞の単離
2.解離プロトコル
3.抗体染色および細胞選別
セルのメンテナンス
siRNAによるヒト筋芽細胞のトランスフェクション
注:分化誘導の2日前に市販のトランスフェクション試薬を用いて筋芽細胞をトランスフェクションします。遺伝子に対する特定のsiRNAの効果は、対照siRNAの効果と常に比較されます。 siRNAは二本鎖RNAであり、氷上に保管し、手袋で操作する必要があります。
6.イム分化マーカーの非蛍光染色
注:免疫蛍光染色は、DM中で48時間後に行うが、他の分化時間で行うこともできる。ミオゲニンおよびMEF2は、(筋管への融合前の)分化した細胞においてのみ発現される核タンパク質であり、それらの染色は分化プロセスの評価を可能にする。ミオシン重鎖(MyHC)は、筋管でのみ発現され、筋管のサイズおよび融合指数(筋管における核の数/核の総数)を推定するために使用される。
7.カルシウムイメージング
8. Ca 2+測定分析
注:収集ソフトウェアを使用して分析を実行します。
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ヒト筋肉試料の酵素的解離の後、細胞はGMで増幅された。 CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-細胞と定義されるヒト筋芽細胞は、FACS後に得られた。筋芽細胞は分析された集団の60%以上を占めていた( 図1 )。初代ヒト筋芽細胞を再播種し、コンフルエントになるまで増殖させ、DM中で48時間培養した。転写因子MEF2および筋肉特異的タンパク質ミオシン重鎖(MyHC)の発現のための免疫染色の後、我々は、大部分の細胞がインビトロで筋管を形成し (MyHC陽性細胞)、融解指数値が60.9±1.3% (n = 5; 図2 )。予備細胞と呼ばれるヒト筋芽細胞の約40%がこの最終分化を免れ、未分化単核細胞のままであることも観察した。機能的研究のために、本発明者らは、開始の48時間後の筋芽細胞または筋管のCa 2+応答を分析した差別化。 図3は、SOCEを誘導...
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成体骨格筋由来のヒト筋芽細胞の単離および培養は、筋肉分化および筋肉再生を研究するインビトロモデルを提供する。この論文では、高収量のヒト筋芽細胞の精製を簡単かつ低コストな方法で可能にするプロトコールを提供する。さらに、この技術は、単離された筋芽細胞の割合および筋原性分化効率に関して、信頼性の高い再現性のある結果を提供する。実際、細胞選別後に約60%のヒト筋芽細胞を得た。これらの細胞は、最大6継代(約30回の倍加)の培養で維持することができ、その能力を分化させる。さらに、DMにおいて2〜3日後、筋芽細胞融合が最大であるように、筋原性分化は、培地をGMからDMに変化させた後に急速に生じる。このモデルでは、筋芽細胞の約60%がDMで2日後に筋管に融合する。別の利点は、これらの初代ヒト細胞l培養物はsiRNAで簡単にトランスフェクションされます。私たちの研究室で使用されているGMとDM培地は自家製です。あるいは、市販の培地を使用してもよいが、ヒトの初代培養においてその効率を試みたことはない。
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著者には競合する金銭的利益はない。
この作品は、スイス国立科学財団(助成金番号310030-166313)、「ファンデーションスイスの病気を治癒させる」、「Foundation Marcel Levaillant」、「Fondation pour la rechercheostéo-articulaire」のサポートを受けました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ハムs F10 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 31550-023 | |
| FCS | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 10270-106 | ロット 41G5532K |
| BSA | シグマ | O5482 | |
| フェチュイン | シグマ | F3385 | |
| EGF | コーニング | 354001 | |
| デキサメタゾン | シグマ | D1756 | |
| インスリン | シグマ | I9278 | |
| クレアチン | Σ | 27900 | |
| ピルビン酸 | Σ | P4562 | |
| ウリジン | Σ | U3003 | |
| ゲンタマイシン | サーモフィッシャー サイエンティフィック | 15710-049 | |
| トリプシン-EDTA 0.05% | サーモフィッシャー サイエンティフィ | 25300-062 | |
| 70 μm細胞ス | トレーナーFalcon | 352350 | |
| 40 μmセルストレーナー | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 mLチューブ | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 mLチューブ | ファルコン | 352096 | |
| ファルコン 5 mLチューブ(FACS) | Falcon | 352058 | |
| 培地:OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| トランスフェクタント試薬:RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| 封入剤 | Fluka | 10981 | |
| マウス抗MyHC * | DSHB | MF20 | 凝らす |
| マウス抗ミオゲニン | BD Pharmigen 556358 | ||
| ウサギ 抗 MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| ヤギ 抗マウス Alexa488 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A11029 | |
| ヤギ 抗ウサギ Alexa 546 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A11035 | |
| マウス 抗ヒト CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| マウス抗ヒトCD146-PECy7 | BDファーミンゲン | 562135 | |
| マウス抗ヒトCD45-PE-CF594 | BDファーミンゲン562279 | ||
| マウス抗ヒトCD34-APC | BDファーミンゲン345804 | ||
| マウス抗ヒトCD144-PE | BDファーミンゲン | 560410 | |
| レクサ蛍光488マウスIgG1kBD | ファーミンゲン557702 | ||
| PECy7マウスIgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 マウス IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC マウス IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE マウス IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 注意: 有毒化合物 |
| パラホルムアルデヒド | フルーカ | 762400 | |
| フラ-2 AM | サーモフィッシャーサイエンティフィック | F1201 | |
| プルロニック F-127 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | P3000MP | |
| タプシガルギン | Σ T9033 | 注意 : 有毒化合物 | |
| レシオイメージング取得ソフトウェア:Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * :MF 20は、Fischman, D.A.によってDSHBに寄託されました。 |
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