ヒト筋芽細胞の単離、筋分化の評価、および貯蔵操作カルシウムエントリー測定

サマリー

ここでは、成人の筋肉組織からのヒト筋芽細胞の純粋な集団を得るための方法を説明する。これらの細胞は、in vitro骨格筋分化を研究するため、特にCa ²⁺シグナル伝達に関与するタンパク質を研究するために使用される。

要約

衛星細胞（SC）は、筋線維の原形質膜と周囲の基底層との間に位置する筋幹細胞である。彼らは筋肉の再生に不可欠です。骨格筋において頻繁に起こる傷害の際に、SCが活性化される。それらは筋芽細胞として増殖し、筋肉病変を修復するために分化する。筋肉分化の間に起こる多くの事象の中で、サイトゾルCa ²⁺シグナルは非常に重要である。これらのCa ²⁺シグナルは、細胞内空間、特に貯蔵操作Ca ²⁺エントリー（SOCE）からのCa ²⁺流入と同様に、内部Ca ²⁺貯蔵からのCa ²⁺放出から生じる。この論文では、整形外科手術後に収集された筋肉サンプルからヒト筋芽細胞の純粋な集団を得るために使用される方法論について説明する。組織を機械的および酵素的に消化し、細胞を増幅させ、次いで、細胞の特異的存在に基づいてフローサイトメトリーによって選別するfic膜マーカー。得られた後、ヒト筋芽細胞を増殖させ、培地から増殖因子を除去することによって分化することを約束する。特異的転写因子の発現レベルおよびin vitro免疫蛍光を用いて、対照条件下で、およびCa ²⁺シグナル伝達に関与するタンパク質をサイレンシングした後の筋形成分化プロセスを評価する。最後に、信頼できる再現性のあるSOCEの測定値を提供するレシオメトリックなCa ²⁺プローブとしてのFura-2の使用について詳しく説明します。

概要

ヒト骨格筋は、筋原性前駆細胞の融合から生じる収縮性多核筋繊維の群からなる。骨格筋は、筋繊維（筋帯）の原形質膜と基底板との間に位置する骨格筋幹細胞であるSCの存在により、損傷後に再生する能力を有する。損傷を受けていない筋肉では、SCはほとんどが静止状態にある。機械的ストレスまたは損傷に応答して、SCが活性化（筋芽細胞）となって増殖し、SCプール^1、2を補充する新しい筋線維または自己複製を形成するために、どちらかの分化を受けます。長年にわたり、SCおよびその子孫、筋芽細胞を骨格筋生検から単離するためのいくつかの技術が開発された。これらの細胞上で発現される細胞表面マーカーおよび蛍光活性化細胞選別（FACS） ^3の方法論のより深い理解により^、4、5、筋肉サンプルからヒト筋芽細胞の純粋な集団を単離することが可能です。

カルシウムシグナリングは、骨格筋の発達、ホメオスタシス、および再生を調節する。特に、SOCEと呼ばれる細胞内貯蔵枯渇後に活性化されるCa ²⁺流入は、これらのプロセスにとって非常に重要である⁶ 。細胞刺....

プロトコル

健康な患者の整形外科手術中に、手術用の廃棄物としてヒトの筋肉サンプル（半腱腱筋から採取した組織）を採取した。ヒト研究に関連するすべての方法は、スイスの規制当局のガイドラインと規制に従って実施され、スイスのジュネーブ条約当局（CER番号12-259プロトコル）からの欧州委員会Cantonale d'Ethique de la Recherche 。インフォームドコンセントと書面による同意は、研究に関わるすべての成人被験者から得られた。

ヒト骨格筋からの筋芽細胞の単離

1. すべての手順の間、レベルII組織培養フードの下で作業し、滅菌培地および滅菌緩衝液を使用して滅菌状態を維持する。
   注：この手順は、多くの人間の骨格筋に適用することができます。

2.解離プロトコル

1. 筋肉サンプル（2〜3g）を滅菌6cmプレート。
2. 5~10mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で筋肉サンプルを洗浄する。洗濯を繰り返します。
3. 湾曲したはさみとクランプを使用して結合組織と脂肪組織を除去する。
4. 筋肉サンプルを計量し（ステップ2.13参照）、新しい無菌6cmプレートに移す。
5. 5mLの0.05％トリプシン-EDTAを添加する。
6. はさみを使用して、筋肉組織を切断して小さな断片（2mm未満）にします。 <....

結果

ヒト筋肉試料の酵素的解離の後、細胞はGMで増幅された。 CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-細胞と定義されるヒト筋芽細胞は、FACS後に得られた。筋芽細胞は分析された集団の60％以上を占めていた（ 図1 ）。初代ヒト筋芽細胞を再播種し、コンフルエントになるまで増殖させ、DM中で48時間培養した。転写因子MEF2および筋肉特異的タンパク質ミオシン重鎖（MyHC）の発現のための免疫染色の後、我々は、大部分の細胞がインビトロで筋管を形成し （MyHC陽性細胞）、融解指数値が60.9±1.3％ （n = 5; 図2 ）。予備細胞と呼ばれるヒト筋芽細胞の約40％がこの最終分化を免れ、未分化単核細胞のままであることも観察した。機能的研究のために、本発明者らは、開始の48時間後の筋芽細胞または筋管のCa ²⁺応答を分析した差別化。 図3は、SOCEを誘導.......

ディスカッション

成体骨格筋由来のヒト筋芽細胞の単離および培養は、筋肉分化および筋肉再生を研究するインビトロモデルを提供する。この論文では、高収量のヒト筋芽細胞の精製を簡単かつ低コストな方法で可能にするプロトコールを提供する。さらに、この技術は、単離された筋芽細胞の割合および筋原性分化効率に関して、信頼性の高い再現性のある結果を提供する。実際、細胞選別後に約60％のヒト筋芽細胞を得た。これらの細胞は、最大6継代（約30回の倍加）の培養で維持することができ、その能力を分化させる。さらに、DMにおいて2〜3日後、筋芽細胞融合が最大であるように、筋原性分化は、培地をGMからDMに変化させた後に急速に生じる。このモデルでは、筋芽細胞の約60％がDMで2日後に筋管に融合する。別の利点は、これらの初代ヒト細胞l培養物はsiRNAで簡単にトランスフェクションされます。私たちの研究室で使用されているGMとDM培地は自家製です。あるいは、市販の培地を使用してもよいが、ヒトの初代培養においてその効率を試みたことはない。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ハムs F10	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31550-023
FCS	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10270-106	ロット 41G5532K
BSA	シグマ	O5482
フェチュイン	シグマ	F3385
EGF	コーニング	354001
デキサメタゾン	シグマ	D1756
インスリン	シグマ	I9278
クレアチン	Σ	27900
ピルビン酸	Σ	P4562
ウリジン	Σ	U3003
ゲンタマイシン	サーモフィッシャー サイエンティフィック	15710-049
トリプシン-EDTA 0.05%	サーモフィッシャー サイエンティフィ	25300-062
70 μm細胞ス	トレーナーFalcon	352350
40 μmセルストレーナー	Falcon	352340
Falcon 50 mLチューブ	Falcon	352070
Falcon 15 mLチューブ	ファルコン	352096
ファルコン 5 mLチューブ(FACS)	Falcon	352058
培地:OPTI-MEM	ThermoFisher Scientific	31985-047
トランスフェクタント試薬:RNAiMax	ThermoFisher Scientific	1756064
PBS	ThermoFisher Scientific	14190-094
封入剤	Fluka	10981
マウス抗MyHC *	DSHB	MF20	凝らす
マウス抗ミオゲニン	BD Pharmigen 556358
ウサギ 抗 MEF2	Santa Cruz Biotech	C-21
ヤギ 抗マウス Alexa488	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A11029
ヤギ 抗ウサギ Alexa 546	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A11035
マウス 抗ヒト CD56-Alexa488	BD Pharmingen	557699
マウス抗ヒトCD146-PECy7	BDファーミンゲン	562135
マウス抗ヒトCD45-PE-CF594	BDファーミンゲン562279
マウス抗ヒトCD34-APC	BDファーミンゲン345804
マウス抗ヒトCD144-PE	BDファーミンゲン	560410
レクサ蛍光488マウスIgG1kBD	ファーミンゲン557702
PECy7マウスIgG1k	BD Pharmingen	557872
PE-CF594 マウス IgG1k	BD Pharmingen	562292
APC マウス IgG1k	BD Pharmingen	550854
PE マウス IgG1k	BD Pharmingen	556650
DAPI	Sigma	D9542	注意:  有毒化合物
パラホルムアルデヒド	フルーカ	762400
フラ-2 AM	サーモフィッシャーサイエンティフィック	F1201
プルロニック F-127	サーモフィッシャーサイエンティフィック	P3000MP
タプシガルギン		Σ T9033	注意 : 有毒化合物
レシオイメージング取得ソフトウェア:Metafluor 6.3	Molecular Device
* :MF 20は、Fischman, D.A.によってDSHBに寄託されました。