方法論記事

リン酸化と大腸癌細胞におけるタウ蛋白の局在と微小管結合の試金

DOI：

10.3791/55932

⸱

2017年10月10日

 ,  , 
1Systems Biotechnology Research Center, KIST Gangneung Institute of Natural Products, 2Division of Bio-Medical Science & Technology, KIST School, Korea University of Science and Technology

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本稿では、測定、微小管と薬物治療に続く細胞内のタウのローカリゼーションのタウ結合タウ タウを測定するための標準プロトコルについて説明します。これらのプロトコルは、薬やタウ タウや微小管結合を対象とする他の化合物をスクリーニングするため繰り返し使用できます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微小管関連タンパク質 tau 主軸索に局在する神経蛋白質であります。一般的にタウの微小管重合と安定化になっているので正常な神経機能に不可欠です。ニューロンのほかにタウはひと乳癌、前立腺、胃、大腸、膵癌それはほぼ同じような構造を示していて、神経のタウとして同様の機能を発揮で表されます。タウとそのリン酸化の量は、微小管の安定剤としてその機能を変更でき、別の神経変性疾患、アルツハイマー病などのペアのヘリカル フィラメントの開発に 。タウとその微小管結合特性のリン酸化状態の判断が重要です。また、タウの細胞内の局在を調べることは、さまざまな病気で重要です。この原稿詳細標準プロトコル リン酸化タウとクルクミンと LiCl 治療の有無、大腸癌細胞の微小管のタウ バインディングを測定するため。これらの治療法は、癌細胞の増殖と開発を停止する使用ことができます。低量の抗体を使用している間免疫組織化学と共焦点顕微鏡を用いたタウの細胞内局在性を調べたこれらのアッセイは、タウ タウや微小管結合に影響を与える化合物をスクリーニングするため繰り返し使用できます。関連抗癌剤は可能性のあるこれらのプロトコルを使用して特徴付けられるまたは異なるタウオパチーの治療薬が使用されます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

タウはもともと共同チューブリン1で精製した熱安定性微小管関連タンパク質として同定されました。タウは、高等真核生物2,3,4でのみ表されます。タウの主な機能は、微小管アセンブリ1,5,6を制御することです。また、微小管7、軸索輸送8、9軸索直径の変化、神経変性疾患10神経極性の形成の重合化に貢献します。タウは、いくつかのシグナル伝達経路を制御するタンパク質の足場としても機能します。ラット脳研究は、タウを提案するニューロン固有でありそれが主に軸索11に局在すること。中枢神経の軸索の開発で主要な役割を果たすタウ タウが微小管重合と神経の開発に不可欠な仮説この仮説は後の in vitroとin vivoの実験により確認します。ニューロンに加えタウは異な....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 試薬調製

プロテアーゼ阻害剤カクテル溶液の
  • (1 mM) 特異フッ化物溶液、10 の追加の 10 μ
      μ l (100 x の在庫から 1 x) とホスファターゼの 10 μ l (100 x の在庫から 1 x)。完全な RIPA 溶解バッファーを準備する 1 x radioimmunoprecipitation 検定法 (RIPA) バッファーの 1 mL に阻害剤カクテル ソリューションです。
    1. 一般的なチューブリン バッファー (PEM) x 10 の準備。
      1. 追加 800 mM (6.0474 g) ピペラジンの N ' - ビス - 2-ethanesulfonic 酸, 10 mM (95.1 mg) エチレング リコール-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N '、N '-四酸、10 mM (51 mg) MgCl 2、および 50 mL のチューブで 1.25 M (10 m 3 mL) NaOH、15 mL の蒸留水水とミックスし、渦を使うことで溶かします。(6.9 はず) pH を確認してください。場合 pH > 6.9, バッファーを破棄し、新鮮な多くのリメイクします
        。 注: 水酸化ナトリウムは pH に 6.9 がオーバー シュートしないように 1.25 メートル以下でなければなりません。HCl を使用して pH を調整....

    • アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

    結果

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    クルクミンの LiCl (図 1) 濃度の異なるセルを扱う後総タウとリン酸化タウの発現を調べた。クルクミンの濃度の異なる 3 つのセルの治療減少タウ発現;しかし、リン酸化タウ式低濃度クルクミンの投与により増加、クルクミン濃度が高いとセルを扱う時に減少しました。アンチ-リン-タウ (Ser396) は、リン酸化タウの検出に使われました。合計 tau のリン酸化タウのレベルを減らした LiCl (図 1) の 3 つの異なる濃度の細胞を処理。前の研究は、異なるがんの種類で、同じがんの種類の異なるサイトでタウの表現のレベルが異なることを示していた。大腸癌の以前のデータを示したそのタウ セルの 2 行で (HCT 116 および SW480) 大腸癌もリン酸化19が発現していた。5 μ M のクルクミンと細胞内リン酸化タウ レベルは未処理の細胞でより高かった。クルクミンの濃度が同じ細胞で総タウよりリン酸化タウのレベ.......

    アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

    ディスカッション

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    この原稿は、総タウを検出するためさまざまな手続き型条件を確立し、クルクミンと LiCl 大腸癌細胞で tau のリン酸化します。Tau 蛋白質のサンプルの全体のリン酸化状態を評価するために脱燐酸化酵素試金は記述されていた。この試金は、任意のタンパク質のリン酸化状態を調べる可能性があります使用できます。

    この試金は非リン酸化状態より遅いタンパク質の動きをリン酸化の原則に基づいています。アルカリ性ホスファターゼ ・ アルカリ性ホスファターゼのバッファーは、このプロトコルで使用されます。セル lysates をアッセイ コンポーネントを追加したらサンプル培養特定の温度に特定の最適な期間にする必要があります。インキュベーション後、反応を停止する SDS サンプルバッファーでサンプルを煮沸する必要があります。以前は、さまざまな実験的プロトコルがタウの微小管への結合を評価するために使用されている可能性があります。ここで紹介する微小管結合の試金は実行しながら、清とペレットの分数を使用して品質保証を提供するために正と負の両方のコントロールを含む簡単です。MT だけ否定的な制御は、MT に任意のバイ.......

    アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

    開示事項

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    著者は、開示するものがあることを宣言します。

    謝辞

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    この研究を行ったプロジェクトの一部タイトルの 『 開発と価値の高い化粧品原料海洋微細藻類からの工業化 』、省の海洋と水産、韓国、によって資金を供給、学内グラント (2Z04930) によって支えられました。天然物の KIST 陵所。

    ....

    アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

    材料

    この記事で使用された材料の一覧
    名前会社カタログ番号コメント
    HCT 116 cellATCCCCL-247
    MEM (EBSS)HycloneSH30024.01
    Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher (Gibco)16000044-20°Cで保存。C
    ペニシリン-ストレプトマイシンHycloneSV30010
    Trypsin-EDTA solutionWelGeneLS 015-01
    100 mm ディッシュCorning430161
    6 well plateCorningCoster 3516
    Anti-Tau 13 antibodyabcamab19030
    Dithiothreitol (DTT)Roche10 708 984 001保管温度2–8度;C
    マイクロリットル遠心分離機Hettich ZentrifugenMIKRO 200 R
    パクリタキセルSigma-AldrichT1912保管温度 2–8度;C
    クルクミンシグマ-アルドリッチ(フルカ)78246保存温度2–8度;C
    微小管 (MT)CytoskeletonMT001は 4 °C で保存します。C(乾燥)
    DAPI封入剤Vector LaboratoriesH-12004°C;C 暗闇の中の水
    酸化ナトリウムSigma72068
    塩化マグネシウムSigma-AldrichM2670
    GTPSigma-AldrichG8877-20 °C
    DPBSWelGeneLB 001-02
    音波記憶装置フィッシャー サイエンティフィックモデル 500
    超遠心分離機ベックマン・コールターオプティマ L-100 XP
    パイプス シグマP1851
    ウシ血清アルブミン (BSA)シグマA7906
    分子イメージャーバイオ・ラッドケミドック XRS+4°Cで保管します。C
    Protein assay dye reagentBio-Rad500-0006
    α-tubulin (11H10) Rabbit mAb細胞シグナル伝達2125
    GAPDH (14C10) Rabbit mAb細胞シグナル伝達2118
    Anti-Tau (phospho S396) antibodyabcamab109390
    EGTASigmaE3889で保存
    FastAP感温性アルカリホスファターゼThermo ScientificEF0651-20°Cで保存。C
    PMSFSigmaP7626室温で保存
    ホスファターゼ阻害剤細胞シグナル伝達58704°Cで保存。C
    Protease Inhibitor CocktailCell Signalling58714°Cで保存。C
    RIPA バッファーΣR 0278保管温度 2–8度;C
    Tau-352 ヒトSigmaT 9950-20 °C;C
    トリトン X-100 Sigma-AldrichX-100約25°Cで保管。C
    PVDF メンブレンBio-Rad162-0177
    ヤギ抗マウス IgG 二次抗体ThermoFisherA-110054 °C で保存;C in the dark
    共焦点顕微鏡Leica MicrosystemLeica TCS SP5
    Dodecyl Sulfate (SDS)Affymetrix75819
    Protein AssayBio-Rad500-00064°Cで保存;ハ
    室温カクテル

    参考文献

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1858-1862 (1975).
    2. Cambiazo, V., Gonzalez, M., Maccioni, R. B. DMAP-85: a tau-like protein from Drosophila melanogaster larvae. J Neuro....

    アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

    再版と許可

    このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

    許可をリクエスト

    タグ

    関連記事