トレースのラットにおける視床皮質投射のビオチン標識デキストランの高分子量アミンの運用の改善

Summary

ここでは、効果的に相互神経経路を通じて染色蛍光ラベリング ビオチン標識デキストラン アミン (BDA) を明らかにする洗練されたプロトコルを提案します。微細構造の解析に適しています bda ラベル付けおよび共焦点レーザー走査型顕微鏡の下で他の神経要素からそれを区別します。

Abstract

ビオチン標識デキストランの高分子量アミン (BDA) は多くの長年に渡って非常に敏感な神経解剖学的トレーサーとして使用されています。ラベルの記載事項の品質が、ここでは、さまざまな要因によって影響を受けるので、中枢神経系における最適なニューラル ラベリングを勉強するため高分子量 BDA のアプリケーション我々 には、洗練されたプロトコルが提供します。繊細なガラス製ピペットによるラット視床の後内側腹側核 (VPM) に BDA の定位注射後 BDA 蛍光ストレプトアビジン-Alexa (AF) 594 で染色、蛍光ニッスル染色 AF500/525 counterstained。ニッスル染色緑の背景には、体性感覚野における赤 BDA ラベル付け、神経細胞の細胞体や軸索の端末を含むは示されたよりはっきりと。さらに、BDA の蛍光染色を倍増し、BDA のラベリングと皮質のターゲットでは、ローカルの神経を研究する機会を提供する太陽光発電肯定的な介在との相関を観察するカルシウム結合蛋白質パルブアルブミン (PV) を行った回路とその化学特性。したがって、この洗練されたメソッドだけは適していませんが高品質高分子量 BDA 視床と大脳皮質の間の相互の神経経路を介して標識神経を可視化するための同時デモを許可するも蛍光組織化学や免疫と他の神経マーカー。

Introduction

高分子量 BDA (10,000 の分子量)、高感度トレーサーは、20 年以上¹中枢神経系の神経の経路をトレースするために使用されています。BDA の使用は一般的な神経路追跡法が、BDA のラベリングの品質を受けます動物の様々 な要因^1,2,3。私たちの最近の研究では、BDA のラベルの最適な構造は、適切な投与後の生存時間に関連付けられているだけでなく、染色方法⁴とも相関を示されています。今、従来のアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体 (ABC)、ストレプトアビジンかに、ストレプトアビジン AF594 まで染色法は以前研究^{2,3、BDA のラベル付けを明らかにするため使用されました。 4,5}。比較では、BDA の蛍光染色を簡単に実行できます。

高分子量 BDA のアプリケーションを拡張するために洗練されたプロトコルは本研究で導入されました....

Protocol

本研究は倫理委員会で、中国中国医学科学院 (参照番号 20160014) によって承認されました。すべてのプロシージャは、ケアおよび実験動物の使用 (国立アカデミー出版、ワシントン d. c.、1996) 国立の機関健康ガイドにしたがって運営しました。4 成熟雄ラット (重量 250 280 g) は、この研究で使用されました。すべての動物は制御温度と湿度、12 h 明暗サイクルで収容され、食料や水への無料アクセスを許可しました。楽器と本研究で使用される材料は、図 1に示しただった。 手術前に脳定位固定装置フレーム、ガラス ピペットなど、すべての楽器は、70% エタノールを使用してクリーニングされました。

1. 手術

1. VPM 定位アトラス⁹ (図 2 a) を使用して対象の座標エリアを決定します。
2. ガラス マイクロ ピペット (約 10-20 μ m の先端径) と装備 1 μ L マイクロ シリンジを準備 (図 1) と流動パラフィンをテストします。
3. 7% 抱水クロラール (0.7 mL/100 g) をラットの腹腔内投与による麻酔します。
4. 深い麻酔が確認されればピンチの....

Results

VPM に BDA の 10 日間のポスト注入の生存は強烈なニューラル ラベル対応する皮質領域に注入側 (図 2) に同側の生産のために十分だった。従来の ABC、蛍光染色し、BDA の手順同様 anterogradely を含む、S1 の神経ラベリングの視床皮質軸索をラベルし、逆行性標識視床細胞 (図 2、D を明らかにしました。).

軸索をラベル付け anterogradely、レイヤー 4、高密度層 6 層 2 から観察され、視床皮質軸索の典型的なタイプは樽地域 (図 2D) で観察されました。高い拡大で軸索のトランク、枝、販促物、小さな下肢 (図 3 a

Discussion

成功した神経トレース実験のための重要なステップは、適切なトレースを選択します。BDA、高分子量 BDA の家族で (分子量 10,000) は、低分子量 BDA (分子量 3,000)^2,3と対照をなして前向性神経経路を介して運ばれる優先的に推奨されました。^,11,12,13。 ただし、多くの研究はまた前向性トレース^1,2,3と並行して逆行性経路トレースの BDA かもしれない潜在的使用もその高分子量を示唆。VPM と S1 の間相互の神経経路を介して高分子量 BDA は双方向管トレース⁴

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ビオチン化デキストランアミン(BDA)	分子プローブ	D1956	分子量10,000
ストレプトアビジン-アレクサ 蛍光 594	分子プローブ	S32356	光から保護
500/525 緑色蛍光ニッスル染色	分子プローブ	N21480	光から保護
脳定位固定装置	ナリシゲ	SR-50
凍結ミクロトーム	Thermo	Microm International GmbH
共焦点イメージング	Olympus	FV1200
system
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Sprague Dawley	Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences	SCKX (JUN) 2012-004
VectastainABCキット	、ベクターラボ、	PK-4000
、スーパーフロスト、顕微鏡スライド、	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm
、Photoshop、イラスト	、Adobe	CS5