A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;栄養状態ベースの銅回避アッセイ

サマリー

ここでは、有機体がよく摂食された状態から飢えた栄養状態に進行するにつれて、銅回避行動の変化および共通の食物源を見つける能力を評価するために設計されたCaenorhabditis elegans特異的アッセイを提示する。

要約

生き残りを確実にするために、生物は、不安定な生息地を避け、一貫した食物源を確保することができなければならない。 Caenorhabditis elegansは、多様な環境刺激の検出時に彼らの歩行パターンを変更し、飢餓状態に応じて行動反応のスイートを調整することができます。線虫は、典型的には、食物源から30分を超えて除去されると、嫌悪反応が減少する。変化する栄養状態に応答する行動変化の観察は、十分に栄養を与えられた状態から飢餓状態への移行を調節する機構に洞察を与えることができる。

本発明者らは、嫌悪な障壁（ すなわち、銅）を横切って長時間にわたり食物源に到達する線虫の能力を測定するアッセイを開発した。このプロトコルは、以前の研究を基にしています。有機体がますます飢えている状態。さらに、このアッセイは、より大きい線虫の集団を同時に評価することができるように、増加したサンプルサイズを可能にする。

銅を検出または応答する能力に欠陥がある生物は、化学バリアを直ちに横切り、一方、野生型線虫は最初に忌避される。野生型ワームはますます飢えているので、障壁を越えて食物源に到達し始めます。我々は、食品感覚または嫌悪な化学物質の検出を含む、多様な環境的合図に応答することができない変異体を評価するためにこのアッセイを設計した。このプロトコルで評価したところ、欠陥のある生物はすぐに障壁を越えたが、食物源を検出することもできなかった。したがって、これらの突然変異体は一時的に食物源に達するにもかかわらず、化学的バリアを繰り返し交差する。このアッセイは、嫌悪と飢餓に関連する可能性のある経路の欠陥を評価するために、ワームの集団を直接的に試験することができる。

概要

Caenorhabditis elegansは、わずか302個のニューロンのみからなる神経系の回路分析の比較的容易さのために、数十年間の神経生物学の研究のモデルとして用いられてきた¹ 。有機体が環境の合図に反応することに頼っているならば、神経系の多くは環境信号の統合を規制することに専念している² 。その神経系の単純さにもかかわらず、 C.エレガンスは、忌避剤³ 、誘引物質⁴ 、温度⁵ 、さらには湿度⁶を含む多様な環境シグナルを検出し、応答することができる。適切に環境シグナルを統合するための失敗は、哺乳動物モデル系^{の7- 9}における行動障害および神経変性条件の数にリンクされています。様々な利用可能な神経疾患モデル C. elegansの ¹⁰ 株および線虫医薬スクリーン^11の開発により、この生物は神経生物学の研究に有用なシステムであることが証明されています。ほぼすべての線虫ゲノム¹²中の遺伝子、線虫の神経系の我々の理解、ひいては私たち自身にマッピングされた線虫のコネクトーム¹および変異の利用可能性を考えると、部分的に創造適切なアッセイの設計によって制限されています。

走化性アッセイの数は、多様な嫌悪刺激^{3、4、13、14、15}に線虫応答性を評価するために、過去40年にわたって開発されてきました。最初の実験では、急速な環境刺激の導入が関与していたが、単一のワームが寒天プレート= "XREF"> ^{3、14、16。}歩行応答に対する即時の変化が記録された。例えば、揮発性臭気物質オクタノールは、毛髪に適用され、野生型ワーム¹⁷における後方移動の開始を刺激するために、線虫の鼻の前で漂流され得る。行動選択の評価手段として複数の変数を組み込むために、より複雑なアッセイも開発されている¹⁸ 。このアッセイのバリエーションには、銅溶液を使用して嫌気性中線バリアを作成することが必要です⁴ 。誘引物質、すなわちジアセチルは、ジアセチル源から離れて移動した虫の化学的障壁の一方の側に置かれた。銅の嫌悪反応に欠陥のあるワームは直ちに障壁を越えてジアセチルに達し、野生型ワームは最初に障壁によって反発した。ワームが最初に銅の障壁に近づいたときの応答が採点された長期間の観察なしに。

ワームが飢餓状態を経て評価されると、環境刺激に対する感受性は低下する¹⁹ 。忌み嫌う化学オクタノールが線虫の鼻の前で漂流されると、野生型生物は食べ物の上に3〜5秒以内に後退運動を刺激する。これらの生物は10分間食品から除去された後、8〜10秒の遅れた応答を示す²⁰ 。したがって、飢餓が増加すると、食物の探索が生存にとってより重要になるので、線虫は有害な環境シグナルに対する嫌悪反応を減少させる。逆に、その過剰発現神経ペプチド受容体9（NPR-9）線虫、食品オンまたはオフオクタノールに応答し、嫌悪刺激²¹の数に対応することができないことを示しません。これらのnpr-9（GF）生物はまた、食物の存在下でそれらの逆転頻度を調節しないが、過酷なタッチ刺激に反応して逆方向に動き、後方への移動²¹が可能であることを示す。我々はまた、彼らはまだ食べ物オフ異常な低下反転周波数を示すことが与えられたNPR-9（LF）の変異体は、食品²¹の存在下で、彼らの行動を調節することができる評価しました。急性外部刺激の導入により、ワームの栄養状態を結合することは食品関連の経路が広く感覚シグナル伝達が^22、23の経路を調節することができますするメカニズムの解明に支援しています。線虫環境における食物の存在はまた、エタノール離脱反応を評価するために使用されている²⁴ 。この実験では、ワームを様々な濃度のエタノール中でインキュベートし、次いで「飼料競合アッセイ」として知られている寒天プレート上に置いた。食物パッチをプレートの一端に置き、線虫をw食品源から離れて置かれている。エタノール離脱は、ワームが食物のパッチに到達するのに必要な時間を測定することによって評価した。

この栄養ベースの銅回避アッセイは、時間経過に伴う行動変化を評価しながら、追加の環境変数、すなわち食物および銅を統合するための食品競争アッセイに基づいている。これはC. elegansコミュニティー全体で一般的に使用されるプロトコルの適応です⁴ 。このプロトコールは、嫌悪反応および4時間にわたる食物の検出を評価するために使用されている²¹ 。ワームの展示飢餓行動ので、絶食²⁵の30分後、我々はまた、栄養状態への変更は、環境対応に影響を与えることができるかを評価することができます。このアッセイの条件は、実験生物が時間の経過とともに嫌悪感の刺激に反応する反応をどのように変化させるかを測定するため、行動変化を生物は飢えた状態に向かって進行する（そして継続的な飢餓の継続的な測定）。 npr-9（GF）動物は、食べ物や多くの嫌悪的な手がかりに反応して行動を変えないので、これらの行動障害が飢餓の状況で持続するかどうかを特定しようとした。最終的に、このアッセイ設計は、 npr-9（GF）突然変異体を特異的に評価するように処方されているが、新規な菌株を特徴付けるためにさらに適合させることができる。

プロトコル

1.実験生物の調製

1. 生物が試験の際に若年成人であることを確認するために、アッセイを開始する24時間前に10株あたり10 L4段階の線虫を選ぶ。試験したそれぞれの突然変異体または対照線虫について、10匹のL4s（対照については10、アッセイについては10）を選択する。
   1. 標準的な方法^26、OP50 大腸菌を播種し、標準的な寒天プレート上で²⁷ 24時間を使用して、L4生物を維持します。その後の洗浄ステップ中に生物が失われた場合は、開始サンプルサイズを増やして補正します（ つまり 、10個ではなく20個のワームを選ぶ）。
      注：行動は本来変わる表現型です。 3つの別々の日に各株について3通りずつ方法を実施する。議論のセクションで強調したように、新規株のための追加の対照株および条件を含める。
2. アッセイの直前に、実験用のorga細菌を含まない寒天プレートに接種し、線虫が1分間自由に動いて余分な細菌を除去することを可能にする。
   1. 実験生物がアッセイの24時間前に汚染条件を経験した場合は、それらを捨てる。
3. 細菌を含まないプレートに1 mLのM9をピペットで入れ、ワームをマイクロ遠心チューブに洗います。
4. 3,000 xgで1分間遠心する。虫は、チューブの底にペレットを形成するはずです。ワームペレットを破壊することなくM9溶液を吸引する。ワームペレットに1 mLのM9を加え、チューブを反転させてワームを溶液と混合する。
5. ステップ1.4をさらに3回繰り返します。
   1. 余分な細菌が最初にワームで移された場合は、合計5回繰り返します。銅フードレースプレートに細菌を移すべきではありません。食品がアッセイプレートに移されると、正確なデータ収集が妨げられます。
6. 最終洗浄後、100まで上清を吸引する81; M9のLおよびワームペレットが残る。
   注意：飢餓関連の行動は30分後に明らかになります。その結果、ワームはすぐに洗い流しが完了したら解決から移すべきです。

2.アッセイプレートの調製

1. 標準NGM寒天プレートをアッセイの2日前に調製する。
   1. プレートを湿気の多い環境に置く場合は、アッセイの3日前に寒天プレートを作製する。あるいは、プレートのふたを3〜6時間はがしてください（滅菌環境の場合）。
2. 太い恒久的なマーカーを使用して、プレートの外面に沿って下側に線を作り、中線のバリアを形成するようにもう一方の線を作ってください（ 図1 ）。ミッドラインバリアは、プレートの各エッジから等距離にある必要があります。正確な測定を保証するためにルーラーを使用してください。これらの系統は、バクテリアと銅溶液を移すときの目安となります。それを提供する大腸菌は銅溶液の前に移され、これらの系統は指標となる。
3. シードプレートに50μLのOP50 E. coliを銅障壁の片側にのみ塗布し、均一な芝生を作製した（ 図2 ）。細菌濃度は、アッセイ全体にわたって一定でなければならない。しかしながら、濃度の穏やかな差異に応答して、ほとんど変化しないことが観察された。
   1. プレートの下側​​にあるマーク付きの線を使用して、細菌が銅溶液と接触しないようにします。銅溶液がプレートの縁に沿って中間線バリアを形成するならば、銅溶液が食物源と接触しないように細菌を移す。
4. 第2セットのプレートに印を付け、OP50 E.coliをそれらに移さない（ 図2 ）。これらのプレートは、ネガティブコントロールを評価するのに役立つ。これらのプレートにはまた、最初の転写起点を示すためにプレートの半分にマーキングする。
5. 細菌を乾燥させ、プレートを37℃で一晩インキュベートする。 37℃のインキュベーターまたは室内に移す際に細菌のパッチが乱されないように注意してください。過度の妨害は、食品パッチの位置または形状を変える可能性がある。

3.走化性アッセイ

1. アッセイ開始時間の前に、0.5M硫酸銅（II）溶液を新鮮に調製する。プレートあたり125μLの溶液が使用される場合、使用されるアッセイプレートの数（ 例えば、 5つのアッセイプレート、625μL）に依存して、この体積をスケールアップする。
2. 100μLの硫酸銅（II）溶液を寒天の端にピペットで入れ、外側の銅バリアを作ります。マークされたプレートの下面が目安になります。
3. 25μLの硫酸銅（II）溶液をピペットで入れ、中線バリアを作成する。
   1. 銅（II）硫酸塩溶液が細菌パッチとは接触しません。ストリークは寒天上のくぼみ/傷に起因する運動に影響を与える可能性があるため、点検技術を使用してください。
4. 銅溶液をプレート上に乾燥させる。時間は、プレートとラボの条件によって異なります。移動後5分ごとに目視で乾燥状態をチェックする。
   注：銅溶液は青色の色合いを示し、容易に識別できます。実験室のティッシュを使用して、プレートの端近くの溶液を軽く拭き取って乾燥を確認します。
5. チューブの底からアッセイプレートの無菌半分上にウォームペレット20μLをピペットで加える。
   1. 10個のワームがアッセイプレートに移されていることを確認します。追加のワームが誤って含まれていた場合は、ハロカーボンオイルで拭いて除去し、プレートに細菌が追加されていないことを確認します。各アッセイは、アッセイ中に一貫した数の線虫を有するべきである。
      注：あまりにも少ない数のワームが感染している場合初期サンプルサイズを増加させることは、洗浄および移動の間の潜在的な損失を軽減する。
6. 実験室の組織でプレートから過剰のM9を除去する。 M9は硫酸銅（II）溶液と接触してはならない。
   注意：この手順を実行中は、ワームや寒天表面に影響を与えないように注意してください。あまりにも過酷に使用された場合、実験室組織はプレートの寒天表面にくぼみを形成し、ワームを除去することができます。 KimWipe 経由で誤って削除されたワームは破棄する必要があります。
7. M9溶液を取り除き、すべてのワームが非液体歩行パターンを開始したら、アッセイストップウォッチを開始します。
   1. 最適には、分以内にM9溶液を除去する。本質的なパラメータは、正弦波運動の同定である。ワームは、時に液体で、異なっlocomote 例えばスラッシングではなく、正弦波。実験用の器官ごとに1回、アッセイ停止時計を開始するismsはスラッシングを止める。
8. 30分ごとにアッセイプレートをチェックする。
   1. 細菌パッチを含むアッセイプレートの場合、4時間にわたって食品パッチに到達すると、生物を正に評価する。ネガティブコントロールプレートについては、障壁を越えた場合には、生物にプラスのスコアを付けます。

結果

野生型（N2）、 npr-9（tm1652）およびnpr-9過剰発現株、 すなわち npr-9（GF） （IC836- npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr -1 :: rfp）、飢餓と銅嫌悪に対する応答を評価する。野生型生物は、 嫌気的銅障壁を検出し応答することができるが、 npr-9（GF）突然変異体は、4時間のアッセイ^21で銅に対して嫌悪反応を開始しない。飢餓の30分後、野生型（N2）生物のおよそ50〜60％が銅障壁を横切って食物パッチに到達する。 2時間の時点で、野生型線虫の75％が食物源に到達する。アッセイの終わりまでに、100％のN 2生物が食物源に移動した。対照的に、大部分のnpr-9（GF）生物は、食物に応答して運動パターンを調節せず、食物と接触した後でも嫌悪感の障壁を横断し続けるであろうソース。 npr-9（GF）ワー...

ディスカッション

このアッセイ設計は、食品レースアッセイ²⁴を変更して、嫌気性正中線バリアを作成し、線虫の損失を防ぐためにプレートの縁の周りに銅溶液を含むようにする。生物は、嫌悪の障壁を横切り、4時間にわたって食物パッチに達する能力について試験される。 npr-9（GF）との関連で 、我々は飢餓状態が嫌悪反応および食物の検出にどのように影響するかを評価するためにこのアッセイを利用した。以前はnpr-9（GF）を食物および嫌がらせの応答性に欠陥があると判断した場合、飢餓がnpr-9（GF）の欠陥行動を調節できるかどうかを評価するために、このアッセイは、検出し、化学的刺激や食品手がかり^3、4に対応するワームの能力に依存しています。様々な変数を分析すると、ex混乱の要因を排除するためには、周囲の生物を注意深く制御しなければならない。未特徴の突然変異体、 すなわち未知の退行性...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
M9 溶液 [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O を1リットルまで。使用前にオートクレーブで滅菌する。]			研究室で製造
硫酸銅	シグマ	C-1297	水を使用して0.5Mの濃度まで適切に懸濁させる