急性<em&gt;インビボ</em&gt;麻酔ラットにおけるHyperdirect経路からの局所場ポテンシャルとマルチユニット活性の電気生理学的記録

サマリー

この研究では、方法論は、ウレタン麻酔下での超指向経路からのマルチサイトインビボ電気生理学的記録をどのように行うかについて提示されている。

要約

収斂する証拠は、多くの神経精神病が大規模なニューロンネットワークの障害として理解されるべきであることを示している。これらの疾患の病態生理学的基礎をよりよく理解するためには、回路の異なる神経部分の間で情報の処理がどのように妨害されるかを正確に特徴付けることが必要である。細胞外in vivo電気生理学的記録を用いて、ニューロンネットワーク内のニューロン活動を正確に描写することが可能である。この方法の応用は、機能的磁気共鳴イメージングおよびカルシウムイメージングなどの代替技術に比べて、固有の時間的および空間的分解能を可能にし、遺伝子操作された生物に依存しないため、いくつかの利点を有する。しかし、細胞外インビボ記録の使用は、普遍的に適用することができない侵襲的技術であるため、限られている。この記事では、シンプルで使いやすいメソッドが紹介されています。ネットワークの複数の部位で、局所的な場電位およびマルチユニット活動のような細胞外電位を同時に記録することが可能である。定位手術とマルチユニット記録のオンライン分析を組み合わせて、どのようにして皮質核の正確な標的設定を達成することができるかについて詳述しています。従って、ハイパーダイレクトコルチコ - 基底核節のような完全なネットワークがインビボで麻酔された動物においてどのように研究され得るかが実証される 。

概要

パーキンソン病（PD）および統合失調症などの異なる神経精神障害に関する最近の累積的証拠は、それらの病態生理が、しばしば皮質および皮質下構造^1,2,3を含む拡張された神経回路の重大な機能不全に基づくことを強く示唆する。この理論によれば、疾患の臨床症状は、単一細胞または特定の神経細胞要素^1,2,3の代わりに、細胞のネットワークの情報処理能力の障害の結果として生じる。神経精神医学的疾患のこの複雑な群の理解を高め、新しい治療法を見つけるためには、ヒト患者および動物モデルにおけるこれらの無秩序なネットワークの神経動態を詳細に特徴づけることが必須である。優れた生存者の大規模ネットワークを研究するための方法は、細胞外電位のマルチサイト電気生理学的記録である⁴ 。この方法を使用すると、シナプス電位⁵によって生成される、興奮性および抑制性のシナプス後電流およびマルチユニット活性（MUA）の時間的総和を主に表す局所電場電位（LFP）を同時に評価することが可能である⁵ 。細胞外ポテンシャルの記録は、機能的磁気共鳴イメージングやカルシウムイメージングなどのネットワークを研究する代替方法に比べて時間的および空間的分解能が高く、遺伝子操作された生物に依存しないためいくつかの利点があります⁵ 。しかし、細胞外インビボ記録の使用は、普遍的に適用することができない侵襲的技術であるため、限られている。

インビボ電気生理学的記録麻酔した動物だけでなく、目を覚ましても発作を行うことができる⁶ 。どちらの方法も特定の賛否両論を伴います。目覚めた動物の研究は、定義された行動課題の実行中に脳信号を記録することを可能にするが、運動関連および他の人工物に罹りやすい^7,8 。一方、麻酔動物での記録は、高度に定義された皮質の同期状態で最小限のアーチファクトを伴うLFPおよびMUAを評価する機会を提供するが、結果はまた、覚醒した被験者^{9,10,11 において}見いだされるものとある程度異なる。

近年、LFPのサンプリングは、ネットワーク活動の病理学的変化を描写するために特に有用であることが実証されている。その顕著な例は、ヒト患者におけるPDの病態生理学に関する研究である皮質基底核節におけるβ振動の増強がパーキンソン病運動症状に関連していることが示された12,13）。この研究の結果、ベータ振動が閉ループ深部脳刺激のためのオンラインフィードバックバイオマーカーとして使用できるかどうかが現在研究されている^14,15 。

本研究では、ウレタンで麻酔したラットのLFPおよびMUAの急性多部位インビボ電気生理学的記録の詳細な説明を提供する。ハイパーダイレクトの皮質 - 基底核節経路などの完全なネットワークが、標準およびカスタマイズされた電極を使用して電気生理学的に特徴付けられる方法、およびそれらの電極を構築する方法を実証する。基底核核の正確な標的化がどのようにして共役によって達成され得るかが特に強調されるMUAのオンライン登録と一緒に定位手術を行う。

プロトコル

実験手順は、ドイツの動物福祉法（2014年に最後に改訂された）および欧州の規制（2010/63 / EU）に従って実施された。実験は、地方の動物福祉当局（LaGeSo、Berlin）によって承認され、地方の部門および国際ガイドラインに準拠した。

注：提示された方法では、一次運動皮質（M1）と視床核（STN）および網膜黒質（SNr）を連結するハイパーダイレクト皮質 - 基底核線経路から2つの電極モデルを記録する。硬膜外の電気コルチコグラム（ECoG）には、M1特注の低インピーダンスAg / AgCl電極からの記録が使用される。 STNおよびSNrからの記録は、市販の高インピーダンスタングステン電極を用いて行われる。

1.硬膜外Ag / AgCl硬膜外電極の構築

1. 約を取る。直径99.99％の真ちゅう製の銀線を5cm長さのストリップrを200μmとし、必要に応じてコーティングを除去する。
2. チップが融解し始めるまで、チップを軽くまたはろうそくの炎の中に下ろします。先端がボール状で直径が約1 mmになるまで待ちます。ボール状の先端の始めからワイヤの端まで15mmの全長に予備成形された電極を切断する。
3. 使用された電気生理学的記録システムに適合するワイヤ端部に精密コネクタを半田付けする。はんだ付けポイントを電線の端からコネクターまで導電性銀ワニスで覆う。これは導電性を助け、より良い信号品質をもたらします。
4. 導電性ワニスが乾燥した後、3 mm〜1 mmの熱収縮チューブでハンダ付けポイントを覆います。ウォッチメーカーのハンマーを使用して、ボールの先端を厚さの半分に平らにします。
5. 試験手袋を着用し、糸くずの出ない清潔な布を100％エタノールで拭いて汚れや油分を取り除きます。
6. 電極を15 mLの遠心チューブまたは細胞培養チューブに入れ、球形の先端が完全に覆われるまで家庭用塩素漂白剤（注意：溶媒100 gあたり2.8 gの次亜塩素酸ナトリウムを含む）で満たしてください。
   注意：塩素系漂白剤は腐食性があります。必ずメーカーの安全指示に従ってください。
7. 23分後に電極を取り出し、蒸留水で十分に洗い流す。塩化銀層をうまく適用すると、均質な紫色の変化が現れる。
8. 空気中で乾燥させる。完全に乾燥させた後、細かいピンセットで電極を取る。細かい絵筆で液状の電気絶縁を施してください。電極先端のすぐ後ろのワイヤーからスタートし、熱収縮チューブまでのすべてをカバーします。断熱材を少なくとも2時間乾燥させる。
9. 品質管理のために、マルチメーターで導電率のチェックを行います。可能であれば、適切なインピーダンスメーターを使用して1 kHzでインピーダンステストを行い、電極とテストプローブを互いに接触することなくH ₂ O溶液を含む0.9％NaCl中に一緒に入れる。 1kHzでのインピーダンス値は約8kΩです。

2.電極を定位固定ホルダーに固定する

注：MUAとLFPを同時に記録するには、インピーダンスが1.5MΩのタングステン製マイクロワイヤ電極を使用してください。録音の焦点が単一ユニットの高音質記録にある場合は、より高いインピーダンス（> 5MΩ）のマイクロワイヤ電極を選択します。研究の目的がLFPのみに向けられている場合は、低インピーダンスの電極を使用することができます。 dorsoventral stereotaxic調整がしばしば必要な小さな構造の場合、適切な背側先端の分離（この場合は250μm）の電極対を使用する。さらに、これは、必要に応じて、より局所的な参照電極の利点を提供する。定位座標は常に最下位電極から測定され、ブレグマに関連して計算される。

1. アクリル製ブロックとクランプを備えた標準的な定位電極ホルダーを使用し、外科用顕微鏡の視界の平坦な表面にしっかりと寝かせます。
2. 細いピンセットを使用して粘着テープ（3mm×8mm）でホルダーのアクリルブロックに第1の電極対を緩く固定する。電極はアクリルブロックを突き出す必要があります。 12mm。
3. 第2のバイポーラ電極を第1の電極の隣に慎重に固定する。超指向性経路の構造を標的とするために、距離は2mmでなければならない（ 図1 ）。ほとんどの標準的な定位電極ホルダでは、これは隣接する凹部である。確認するには、キャリパーゲージを使用します。異なるネットワークにも同じ方法でアプローチできます。このために、アクリルブロックをある程度回転させてもよい。
4. 第2の電極対を、腹側の先端が約200である位置に注意深くスライドさせて調整する（ 図1 ）と比較して窪んでいる。顕微鏡視野でこれを行う。このためには、30Gのカニューレ（外径300μm）を使用して距離をより正確に推定します。
5. 接着テープを押し、ホルダの金属クランプで固定します。

3.手術

1. 電気生理学的記録には、麻酔のためにウレタン（CAUTION）を使用する。
   注意：ウレタンは有毒で発癌性があります。したがって、物質の製造者が指定した安全規則およびデータシートに常に従ってください。
2. 0.9％NaCl生理食塩水中に200mg / mLウレタンの溶液を調製する。
3. 1.3 g / kg体重のウレタンを腹腔内（IP）投与する。ラット系統によっては、麻酔の安全性を高めるために、注射の間に15分の間隔をおいて用量を2回に分けて投与することが妥当であろう。
4. pを使って麻酔の深さを確認するエダム撤退反射および他の適切な反射が含まれる。麻酔が手術を行うのに十分な深さでない場合は、0.15g / kg体重のウレタンIPを注入し、さらに15分間待つ。
5. 角膜脱水を防ぐために眼軟膏を塗布する。
6. 麻酔中の呼吸数とペダルの逃避反射を常に監視します。手術中に生理的な体温が維持されるように温度コントロール付きの小さな動物の加熱パッドを使用してください。電気生理学的記録を開始する前に、非電気的代替物（ 例えば 、酢酸ナトリウムヘッドパッド）に変更する。
7. 清潔な手術野を達成するために、頭の背側に沿って毛皮を剃ってください。適切な外科用消毒剤で切開部位周辺を消毒する。定位枠で動物を固定する。
8. メスで頭皮の矢状方向に2cmの長さの切開を行う。メスを使用して、頭蓋骨髄膜炎をわずかに掻き取り、頭蓋骨を消毒する。共同使用トントンの芽は、残りの組織を除去するために3％H ₂ O ₂に浸した。
9. 必要に応じて、電気か赤外線サーモスタットを使用して出血を制御してください。出血が1-2分後に自発的に止まり、頭蓋骨を見つけられない場合は、頭蓋骨および皮下脂肪からの出血を止める。
10. 頭が平らな頭蓋骨の位置になるまで切歯棒を調整します。これは、定位基準点としてのブレグマとラムダが同じ平面にあることを意味します。これは、高い外科手術精度を達成するために最も重要である。標準的な定位固定ラットアライメントツールを使用し、指定された先端を微視的視力下でブレグマに較正し、ツール上のブレグマおよびラムダの指定点が同時に頭蓋骨に接触するまで切頭を調節する。
    注：一方の側からの光が他の側からの光で照らされると、この状態を判断するのに役立ちます。あるいは、精密カニューレを用いて定位ホルダーを取り、ブレグマの背側座標を測定する。顕微鏡下でのラムダ。ブレグマとラムダの背側座標が同じになるまで、前歯バーを調整する。
11. カニューレ付きの定位固定ホルダーを使用し、ブレグマに較正し、頭蓋骨のすべてのドリル穴の位置を計算します。定位固定ホルダーを使用して、頭蓋骨を注意深く引っ掻くか、外科用カラーマーカーを使用して、穴あけする穴の位置をマークします。これに対する座標はターゲットに依存し、ブレグマを参照する座標は、小脳参照電極の示唆された座標を含む、 表1のハイパーダイレクト経路について与えられる。
12. マイクロドリルを使用して、すべての穴を慎重にドリルします。 STNとSNrについては、一般的な穴（約2 mm×3 mmのサイズ）を穿孔します。他のすべてのドリル穴は、約1 mmの直径を持つ必要があります。
13. 2つの微細なカニューレ（少なくとも27G）を持ち、硬い表面またはピンセットを使用して、その先端を曲げて鉤状の形状を形成します。これらを使用してdebriを削除しますsをドリル穴から取り出し、共通のSTN / SNr穴の硬膜を注意深く切断して取り除きます。
14. 生理食塩水でドリル穴を洗い流す。脳と硬膜が乾燥しないように、ドリルホールに生理食塩水を15分ごとに滴下します。
15. マイクロドリルと適合するステンレススチール製のマイクロスクリュー（ 例えば 、M 1.2 mm x 2 mmスクリュー）を取り、小脳の上の参照硬膜外電極のドリル穴の間のマイクロスクリューに穴とねじを穿孔し、 M1硬膜外電極。
16. 参照電極とM1電極のためのドリル穴に自己構築Ag / AgCl硬膜外電極をスライドさせる。細いピンセットで電極先端をガイドし、ドリル穴に頭蓋骨の真下にそれをスライドさせます。
17. 両方の硬膜外電極を2成分の歯科用アクリルで固定する。ブレグマ点を覆わず、共通のSTN / SNrの穴にも影響しないように注意してください。
18. タングステンマイクロワイヤ電極を備えた準備されたホルダーを挿入するesを定位フレームに挿入する。
19. STNを標的とするための最も腹側の電極をブレグマに較正する。一般的なSTN / SNrホールの上に計算された位置に調整し、顕微鏡視力下で脳に電極を下ろします。タングステンマイクロワイヤ電極が脳内をスムーズに通過することを確認してください。

4.電気生理学的マッピングと記録

注：このステップでは、ファラデーケージおよびオンラインフィルタリングおよびオンラインスパイクソートが可能な記録ソフトウェアを備えたマルチチャネル電気生理学的記録システムが必要です。好ましくは、動物の頭の近くに配置されたプリアンプと連動して、電気ノイズおよびアーチファクトを最小限に抑えるシステムを使用する。タングステンマイクロワイヤ電極の他に、少なくとも1つの硬膜外電極および1つの参照電極が、超指向性経路の記録を行うために必要である。硬膜外および参照系を挿入することが推奨される電極が互いに接触することなく対をなすようにすることにより、誤動作の場合に役立ち、データ解析において異なるタイプの参照を可能にする。

1. 定位フレームの上にモバイルファラデーケージを置く。固定式ファラデーケージのみが使用できる場合は、注意深く定位フレームをファラデーケージに移動し、脳の深部の電極が定位フレームが最終位置に来るまで脳内に落とさないように注意してください。
2. 電極を電気生理学的セットアップのヘッドステージに接続します。参照電極が適切な参照チャネルに接続されていることを確認します。
3. レコーディングソフトウェアを設定します：バンドパスフィルタ（0.05〜8,000 Hz）と生データ信号を増幅（1,500〜2,000倍のゲイン）します。適切な設定（LFPにはバンドパスフィルタ0.05〜250 Hz、MUAにはバンドパスフィルタ300-8,000 Hz）を使用して、オンラインLFPおよびスパイクフィルタを使用します。すべてのフィルターについては、バターワース型フィルターを使用してください。
4. 該当する場合は、onlinにスパイクしきい値を設定します電子スパイクソート。ほとんどのレコーディングソフトウェアは、信号がソフトウェアによってスパイクとしてマークされる振幅値であるスパイクしきい値の設定を可能にします。この閾値は、フィルタリングされたスパイク信号の平均振幅のファクタまたは標準偏差として数学的に決定することができ、または好ましくは、データセグメントを500ms未満の目視検査によって決定し、グラフィカルユーザーインターフェース。
   注記：スパイク閾値を設定する意図は、現在記録されているニューロンの数とそのスパイクがどのように形成されているかに関する情報を提供するために、スパイクとソート単位をカウントすることです。
5. タングステンマイクロワイヤ電極をターゲットの背部1mmまでゆっくりと下降させます。これはハイパーダイレクト経路のSTNです。必要に応じて信号が安定するのを待ちます。
6. 電気生理学的マッピングのために、100μmのステップで電極を腹側に前進させる。各ステップで、発射パターンを評価し、発射rスパイクの食べ物と形。 図2の典型的な例と比較してください。一般に、密度の高い核は、いくつかの背側ステップにわたって高速かつ連続的にスパイクするが、繊維に富む構造は、その後の腹側ステップでは、発火率が低く、均一なスパイク活動が少ない。
7. ハイパーダイレクト経路では、最も腹側の電極がSTNの内側にあることを確認してください。
   注：Zona incertaの腹側でMUAのかなりの増加が検出されると、STNに達します。 STNの腹側では、電極が内部カプセルに到達したためにスパイクがほぼ完全に止まります。最も腹側の電極がSTNにあるとき、タングステン微小電極の構成は、後方の第2の電極がSNr内にあることを保証する。 STNとSNrの典型的なMUAを同時に記録するには、少しずつ微調整する必要があります。 MUAの頻度は、実際に記録されたニューロンの数および脳のレベルに依存することに留意されたい活性化。
8. 電極が所望の構造になったら、オンラインフィルタリングとスパイクソートを設定し（ 図4参照）、データの記録を開始します。 LFP記録で識別できる異なる皮質同期状態の典型的な例を図3に示す。

5.実験の終了

1. 記録が終わったら、電極をゆっくりと脳から持ち上げ、生理食塩水で瞬時に洗い流します。電極は、徹底した洗浄および目視検査の後で再使用することができる。放電電極を曲げる。
2. 過量のウレタン（2.5g / kg体重）のIP注射によって動物を安楽死させる。
   注記：ウレタンは最終的な手順にのみ使用してください。
3. 電極の位置または他の組織学的染色手順の組織学的検証が必要な場合は、頭蓋骨から脳を取り出し、適切に組織。
   注：目的の染色方法によっては、経心筋灌流が必要な場合があります。電極位置の死後検証のために、標準的なNissl染色では、ほとんどの場合、 例えば冠状脳切片における電極軌道を視覚化するのに十分である。組織学的標的検証を容易にするさらなるアプローチには、記録電極を介して電流を印加することによって、または電極挿入の前に生体適合性染料を適用することによって、電気的に誘導された病変を脳組織に使用することが含まれる^16,17 。

結果

本明細書で使用される記録電極では、STNおよびSNrから一次運動皮質、視床下部核および黒質線維網およびMUAからLFPを採取することが可能である。最初に、LFPと複数ユニットのアクティビティは、広帯域信号で一緒に記録されます。その後、LFPとMUAは帯域通過フィルタ（LFPの場合は0.05〜250 Hz、MUAの場合は300〜4000 Hz）で分離されます。

皮質核、特にSTNのような小さな構造の正確な標的設定のためには、計画された定位座標をオンラインで記録されたMUA信号と整列させることが有利である。 STN特性をターゲットにした電極軌道に対して、MUAパターンを記録することができます（ 図2 ）9,20。

分析の後のステップについては、主成分分析（

ディスカッション

本研究では、この方法は、齧歯類のSTNおよびSNrとM1とを連結するハイパーダイレクト大脳基底核節経路の例を用いて、所定のネットワークの複数の部位から同時に細胞外電気生理学的シグナルを記録する方法を示す。

STNのような小さな皮質構造の記録における重要なステップは、記録電極をターゲットに正確に誘導して挿入することである。提示された方法では、2つの重要なステップを考慮して、高い精度のターゲティングを保証する。脳に電極が導入される前に定位装置で動物を準備するときは、頭蓋骨が「平らな頭蓋骨」位置^22に来ることを確認することが絶対に必須である。平らな頭蓋骨の位置を達成するために、定位フレームの前歯バーの位置は、ブレグマ及びラムダ参照点の高さo頭蓋骨は同じ背平面^21にある 。この位置を保証することによってのみ、定位アトラスに見られる座標は、平坦な頭蓋骨の位置^21に基づいているので、個々の実験動物に高精度で適用することができる。また、実験的な証拠は、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Ag/AgClカスタム硬膜外電極	Goodfellow GmbH D-61213 Bad Nauheim, Germany info@goodfellow.com	99.99%銀線	Ag/AgCl電極の製品ID AG005127は、より良い信号品質を可能にしますが、急性実験でのみ使用できます。交換可能なもの ステンレス製電極
アクリルブロック付き固定装置ホルダー	David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA	製品ID モデル1770 標準電極ホルダー	アクリルブロックには、目的のターゲットの電極設定に適したくぼみがあることを確認してください。アクリルブロックは、ファイルで簡単に変更して、目的の構成にすることができます。可能な交換: 自己構築電極ホルダー
タングステンマイクロワイヤー電極 1.5 MΩ インピーダンス	Microprobes.com 18247-D Flower Hill Way Gaithersburg, Maryland, 20879 USA	Product-ID WE3ST31.5A5-250um	1.5 MΩは、MUAとLFPを同時に記録するために必要です。交換可能:異なる材料の微小電極を使用することができます。電極は、まっすぐで、堅牢で、できるだけ薄くなければなりません。
ラットアライメントツール	David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA	製品ID モデル944 ラットアライメントツール	脳の正確な向きを定位固定アトラスに合わせることができます。交換可能なもの: カニューレ付き脳定位固定ホルダー
2成分歯科用アクリル	Associated Dental Products Ltd. Kemdent Works, Purton, Swindon Wiltshire, SN5 4HT, United Kingdom	Simplex Rapid Powder Clear 225g, 製品コード: ACR803;シンプレックス ラピッドリキッド 150ml、商品コード:ACR920	使用する電極によっては、電極が小さくて軽量であれば、瞬間接着剤が簡単な代替品となる場合があります。可能な交換: 瞬間接着剤(シアナクリレートベース)
ファラデーケージ	自己構造		適切なファラデーケージは、電磁アーティファクトからの最高の保護になりますが、箱の形に形成したり、フレームに適用したり、導電性材料で作られているすべてのものが役立つ場合があります。可能な交換:
記録ソフトウェアとオンラインスパイクソーティング機能を備えた	OmniPlex® Neural Data Acquisition System Plexon Inc 6500 Greenville Avenue, Suite 700 Dallas, Texas 75206 USA		オフラインソーティングソフトウェアは、オープンソースコミュニティで複数のスクリプトとソフトウェアを無料で見つけることができる潜在的な代替手段です。

アルミホイルまたは銅メッシュ電気生理学的セットアップ