アクアリアにおける魚類の生殖生態に関する基礎的研究

サマリー

水槽で飼育された魚の生殖生態学の研究を可能にする一連の基本的方法が記載されている。これらは、SCUBAを使用して魚を採集し、生きた魚を輸送し、水棲生物に飼われた野生の魚の生殖行動を観察するための有用なプロトコルである。

要約

捕獲飼育観察は、継続的な現場調査が不可能な場合に、魚の行動や生態学の側面を明らかにするために重要である。ここでは、水族館に保管された野生の捕獲されたゴビードルのモデルの生殖行動を観察するための一連の基本的な技術が説明されています。この方法は、収集、輸送、および基板スポイナーの生殖生態系の観察の3つのステップに焦点を当てています。生きている魚の収集と運搬の重要な側面は、（1）魚の怪我を防ぐこと、（2）水槽に慎重に慣れさせることです。生きている魚を集めるときは、引っかき傷や水圧の急激な変化などの傷害による害を防ぐことが不可欠です。肉体的な損傷が魚の生存やその後の行動に悪影響を与える可能性があります。水槽への慎重な順応は、死亡率を減少させ、輸送のショックを緩和する。捕獲飼育中の観察には、（1）indiviの同定（2）魚や卵に悪影響を及ぼすことなく産卵した卵を監視することにより、調査種の生殖生態系の詳細な調査を可能にする。可視インプラントエラストマー（VIE）タグの皮下注射は、その後の個々の魚の同定のための正確な方法であり、生存および行動に与える影響を最小限に抑えながら、幅広い範囲の魚と共に使用することができる。研究種が付着卵を堆積させる基質スポイナーである場合、ポリ塩化ビニル（PVC）パイプから構築された人工巣場に脱着可能な防水シートを追加すると、卵の計数とモニタリングが容易になり、研究者の巣の保持魚の卵を保護する行動などが挙げられる。この基本的な方法では、研究論文ではあまり詳しく述べられていない技術が必要ですが、野生の魚を捕獲する実験が必要です。

概要

壮大な適応進化は、魚の形態学、生態学および行動において明らかである¹ 。特に、生殖に関連する生態学的特徴は多様であり、これらのほとんどは個々の適応度²によって直接的に影響され得る。異なる魚種の独特の特徴の進化をもたらした選択圧についての洞察を得るためには、生きた魚を用いた生殖行動および社会行動を直接観察することが、理論的仮説を立証するためにしばしば有益である。

しかし、魚の継続的な野外観察には、保守が困難な特殊な水中設備や施設が必要になる場合があります。これらのケースでは、野生キャッチ水族館飼育魚の観察は^3、4、5人がすることができます。さらに、そうでなければまれであるか奇異である魚の行動の効率的な観察自然条件の下で観察するULTは水槽^6、7、8で実験を操作することで可能になることができます。人工的なストレスや物理的な損傷を最小限に抑えて良好な条件下で魚を飼育することは、正確な生態学的調査のためには不可欠です。

ピグミーハゼTrimma marinaeは 23〜25ミリメートル全長に達し、9〜26メートル⁹の深さで、それは静かな、保護されたベイに見出される西太平洋に分布しています。この研究では、 T. marinaeは、自給式水中呼吸装置（SCUBA）、魚の輸送、および直接観察のための水槽への魚の最終的な順応を使用して魚を収集するための一連の基本的技術を記述するモデルとして使用される研究種の生殖行動と生態学の

プロトコル

1.生きた魚の収集と運搬

注：このプロトコールは、15m以上の深さからガス膀胱を持つ魚を採取する方法を記述しています。表面への迅速な運搬は、魚に重大な損害を与えたり殺したりする圧力の変化によって気体膀胱の膨張を誘発する。この最初のステップの間に魚に与えられた損傷は、それらの生存および後の行動に悪影響を与えるので、注意が必要である。

1. SCUBAでダイビングする前に、以下の材料を集めてください。水中の標的種を捕獲するのに適したハンドネット。魚のために十分な大きさの二重ポリエチレン袋;ゴムバンド（ø80mm×6mm）。収集袋を表面に膨張させる酸素シリンダーと、抗菌剤であるElbaginは、10％ニフルスチレンナトリウムを含む。収集バッグを置くためのポリスチレンフォームボックス;ピペット;必要であれば（ステップ1.4参照）、長さのロープ最大潜水深度に相当するだけでなく、少なくとも2kgの重量が必要です。
2. ダイビング中にハンドネットを使用して標的魚種を収集する。まだ水中で、捕獲された魚をポリエチレンバッグに入れ、ゴムバンドでバッグの口を結ぶ。魚を水槽に運ぶために1日以上かかる場合は、他の袋の自然の生息地から水を守り、魚の水を更新するために使用してください。
   注：安全のために、水中タスクは少なくとも2人で作業する必要があります。
3. 収集地点から魚の袋を1m /分以下の速度で地面：10m以上の深さでは、2mごとに1〜5分上昇します。 10 mの深さから1 mごとに1〜5分の表面停止まで。捕獲された魚がバッグ内で浮力を維持することができない場合（ すなわち 、膨張したガス袋で浮遊しながら底部に向かって泳動しようとする場合）、同じ深さを1〜5分間維持するか、1〜2 mほど深く走査する。魚が浮力を回復したように見えると、表面への上昇を再開します。
   注：SCUBAタンク内の空気が上昇している間に枯渇する可能性がある場合は、ロープをポリエチレンバッグに固定し、2kg以上の重りを取り付けます。水中オペレーターが安全に上昇した後、これを上記の同じ速度で表面に引き上げる。
4. ビーチやボートでは、表面処理後に各ポリエチレン袋の水に10ppmのElbaginを溶かします。
   注：一部の魚は表面に持ち込まれた直後に浮力を維持できない場合がありますが、ほとんどの場合、1日以内に回復が見込まれます。
5. 収集袋の中の魚の密度が高い場合は、魚をより多くの袋の中に分け、輸送中にお互いを擦ってお互いを傷つけないようにします。魚が攻撃的な種である場合、それらを袋の間で個別に分割する。
6. 収集バッグを酸素で膨らませ、再びrubberbands。バッグに酸素を導入するときは、ノズルをバッグの水に入れて溶存酸素量を増やします。完全に膨張したバッグは1/4の水で満たされるべきである。
7. 収集袋をポリスチレン発泡箱に入れ、安定した水温を維持し、暗い条件下で魚のストレスを減らします。
8. 魚を水槽に運ぶのに1日以上かかる場合は、1日に1回、各飼育袋の水の1/4〜1/3を交換します。生息場所から守った水にElbagin 、それぞれ酸素で再パックする。毎日、死んだ魚や排泄物を手のネットやピペットで底に取り除く。
   注：飛行機の輸送が含まれている場合、短時間で2つのステップの圧力変化（水面から表面、表面から上部の空気へ）が悪影響を及ぼす可能性があるため、魚を空気の圧力に慣らして輸送する前に少なくとも1日待ってください魚の生存。 i>

2.水槽に魚を釣り上げる

1. 魚を入れた袋を水槽に30分間置いて、水温を均等にします。
2. 10分間に渡って、水の化学（ 例えば 、pH、塩分）の突然の違いによって引き起こされるショックを避けるために、袋の水を水槽の水と徐々に交換する。
   注：水の化学の差が大きすぎるとショックを受ける魚は、体色や行動に異常な変化を示すことがあります。順化中にこれを注意深く監視する。
3. 10ppmのElbaginを水槽の水に溶かします。
4. その後、1日1回、3日間、1/3の水槽水を交換し、10ppmのElbaginを補充水に加えた。
5. 最後に、1日1回、水色の水が半分になるまで、色が消えるまでElbaginを取り除きます。

3.個々の魚を識別するための可視インプラントエラストマー（VIE）タグの注入

この研究では、個々の魚はVIEタグを用いて同定されており、例えばFrederick ¹⁰ 、Olsen and Vorllestad ¹¹ 、Leblanc and Noakes ^12を参照してください。ステップ3.2で使用される外科用テーブルは必要ありません。

1. 各個体の注入位置とタグの色を決定する。最も安全な選択肢は、身体の厚い筋肉の背側または尾側部分の注入点を選択し、それを内部器官が穿孔され得る腹部に注入することを避けることである。
   注：ナンバリングシステムは図1に記載されています 。研究種が8つの可能な位置に注入するのに十分な大きさであれば、このシステムは単一の色を使用して154人の識別を可能にします。 VIEタグの10色は市販されている。魚の体色に基づいて識別可能な色を選択します。
2. <強い>手に入れることができるよりも小さい魚については、以下のように手術台を準備する（Kinkel ら ¹³参照）（ 図2 ）。
   1. ペトリ皿の高さより少なくとも5〜10mm低い5cm L x 5cm Wの柔らかいスポンジを切り取ってください。
   2. 約5〜10mmの深さのスポンジに溝を切って、その幅を魚のおおよその身体幅の幅に調整する。ポリ塩化ビニル（PVC）板（厚さ0.3 mm）を5 cm L x 5 cm Wに切断し、それを谷折り（またはM字形）に曲げます。
   3. 溝のあるスポンジの上に溝付きのPVCボードをセットし、スポンジをペトリ皿（φ160 mm、深さ30 mm）にセットします。 PVCボードが適切に浸されるまで、回収タンクの水を使用してペトリ皿を満たしてください。
3. VIEタグ付けマニュアルに従ってVIEタグを準備します。エラストマー材料を混合し、混合物を3mLのsyriキットに含まれているように、29ゲージのニードルを使用してください。
4. タグの注入を行う際に使用する2つの水タンクを用意します.1つは麻酔用、もう1つは回復用です。これらの温度と塩分の濃度を飼育水槽の水に合わせて調整します。エアーストーン付きのエアーポンプを使用して、回収タンク内の水を穏やかに循環させます。
5. 等体積の99.5％エタノールと2-メチルキノリンを混合することにより麻酔液を調製する;これを麻酔タンクに加えて18ppmの濃度にする。
   注：麻酔液の最適濃度は、個体の種およびボディサイズに依存する。したがって、事前に研究種の最適濃度を調べる。
6. 個々の魚を麻酔タンクに移し、それらが麻酔されるようにする：すなわち、タンクの外側が叩かれたときに魚が触れたり振動したりするのを待つ。麻酔で体の色が変わると多くの魚でzed、また慎重に体の色を監視し、魚がその変化から麻酔されているかどうかを判断する。魚が麻酔タンクから飛び出す可能性があるので、少なくとも魚がゆっくりと動き始めるまで、透明なアクリル板を使って魚を覆っておいてください。
   注：麻酔と麻酔液の濃度を調整するのに必要な時間を、試験種とその体格に応じて微調整します。麻酔によって術中の動きが止まると、魚は死亡リスクが高くなります。
7. 体が暖かくなると魚が弱くなるので、魚を麻酔しながら比較的冷たい水の中に指を置いてください。
8. 麻酔タンクから魚を持ち上げ、速やかに測定したり、必要なデータ（全長、性別など ）を記録する。魚が測定中に回復したように見える場合は、すぐに麻酔タンクに戻してください。
9. 魚を手術台に移す。魚の腹側をtにセットする彼はPVCの溝。体のサイズが非常に小さい場合は、注入を行う際に両眼顕微鏡を使用してください。研究種が手に入るほど大きい場合は、VIEタグを持ちながらそれを注入します。
10. 針の面取りされた側を外側に向け、魚の頭の方を向いてください。針を皮下に、多かれ少なかれ体に平行に、できるだけ皮膚のすぐ下に近づけて挿入します。魚の体の大きさと最終的にタグを見ることの容易さに応じて挿入深さを調整します。
11. 針を引っ込めながらVIEタグを注入し、針の斜角が針の進入点に達する前に注射を停止する（これは、比較的広い領域にタグを注入すると分かりやすい）。
12. タグ注入が完了したら、直ちに魚を回収タンクに移す。回復が遅すぎる場合は、水を手で静かに循環させます。
13. 回復後、飼育水槽に魚を戻し、10 ppmのEl3日間バニリンを水に加える。
    注：VIEタグの可視性が低い条件では、UVAでフィルタされたライトがタグの認識を容易にします。

4. Demersal Adhesive Eggsのカウント

1. 魚が接着卵を預けることができる人工産卵場所を作るには、不透明なPVCパイプ（直径5cm、長さ6cm）を直径に垂直に半分に切断します。
   注：上記パイプサイズは、比較的小さいゴビT. marinaeの産卵に適しています。したがって、試験種に適したPVCパイプのサイズと形状を調整してください。
2. 防水シートに5 mm x 5 mmのグリッドを印刷し、PVCパイプの内側にフィットするようにカットします。
3. ゴムバンドを使用して防水シートをPVCパイプの内側に固定します。
   注：女性が防水シート上に卵を付着させることが困難で、卵がシートから落ちる場合は、シートをサンドペーパーで織ります。
4. 水槽の底を砂の層で覆う、1- 厚さ2cm。シート固定側を下にして、PVCパイプの約1/3を斜めに砂の中に挿入します。
5. 魚がうまく産卵した後、PVCパイプから卵塊が入ったシートを取り出し、水槽水を入れたペトリ皿に入れます。 PVCパイプの内側に新しいシートを固定し、水槽の底に戻します。最後に、卵の数を撮影して卵を数えます。
   1. また、産卵後に親の卵のケアの観察を行う場合は、卵を水から出さないように注意してください。むしろ、ペトリ皿を使用して卵とシートを水槽の水と一緒に掬い上げ、卵塊を素早く写真撮影し、卵の塊を慎重に同じPVCパイプに再度貼り付けてから元の位置に戻します。水槽の底。最後に、画像を使用して卵を数えます。
6. ImageJを使用して卵を数える（ 図3 ）。これらの自動および手動細胞計数方法は、以下で詳細に説明される：基本的細胞計数（シカゴ大学、Integrated Light Microscopy Core Facility、http://digital.bsd.uchicago.edu/image_j.php）;パーティクル分析（http://imagej.net/Particle_Analysis）;セルカウンタ（https://imagej.net/Cell_Counter）。
   1. そうでなければ、卵が密に沈着している場合は、面積密度比を計算することによって卵の数を推定する：卵密度を計算するために印刷された5×5mm ²グリッド中の卵を数え、ImageJによって卵で覆われた表面積を測定し、単位と表面積あたりの密度より卵の総数を推定する。上記のImageJによる表面積測定方法は、以下のように説明されている：スケールの設定...（Research Services Branch、https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html）;画像の空間スケールを定義する方法を説明しています。 ImageJを使用して表面積を測定する（Keene State College、Academic）Technology、https://dept.keene.edu/at/2011/04/15/by-matthew-ragan/）。
      注：卵が透明の場合、ImageJは卵の輪郭を個別に認識できるため、黒の防水シートは自動カウント方法に適しています。

結果

上記の方法に従い、鹿児島県奄美大島沖合で、2014年4月、2015年および2016年4月にT. marinaeの41,15および96個体を収集した（ 表1 ）。いずれの場合も、水槽に卵を預けるまでは25人（61％）、14人（93％）、91人（95％）の人が住んでいました。 Fukuda et al 。 ^{図3に示すように} 、2014年の観測期間終了前に1匹の魚のみが死亡し、捕獲後7日目に魚の産卵が開始され、良好な条件下で飼育されていることが示された。

VIEタグは、この小型の魚であっても、目に見え、個体の同定を可能にした（ 図4A 、 4B ）。防水シート上に堆積した卵の写真を図4Cに...

ディスカッション

多数の魚の生殖生態学は実験的飼育を通じて明らかにされている。特に、性別変更^{6、8、14、}チームメイトの選択^15、16、種内競争^{7は 、17水槽} -ままの魚を使用して詳細な調査を頻繁に話題となっています。さらに、水槽で観察されたいくつかの結果は、後にフィールド^8、18で確認されています。これらの成果は、野生の捕獲された魚を水棲魚で飼育実験することの有用性と信頼性を裏付けている。さらに、大規模な現場調査の予備段階として、自然に発生する可能性のある状況をシミュレートする飼育実験による操作は、野生条件ではごく稀で...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ハンドネット	ニッソ	AQ-17	対象種サイズに合わせてお選びください。
ポリ袋	San-U Fish Farm	8194
ラバーバンド	株)	78-0420-64	ø 80 mm x 6 mm
酸素ボンベ	N/A	/A	ダイビング器材スーツ用の酸素ボンベ。
エルバジン	ジャパンペットデザイン株式会社	75950	パフラジンF(同じ会社から提供)はエルバギンと同等の薬です。
発泡スチロールボックス	N/A	N/A
ピペット	AS ONE	1-8625-04
ロープ	水上金属株式会社
ウェイト	N/A	N/A	ダイビング器材スーツ用のウェイト。
水タンク	N/A	N/A
エアーポンプ	コトブキ	4972814 062115
エアストーン	コトブキ	4972814 232204
2-メチルキノリン	ワコー	170-00376
エタノール (99.5)	ワコー	057-00456
目に見えるインプラントエラストマータグキット	ノースウエストマリンテクノロジー	N/A	http://www.nmt.us/products/vie/vie.shtml
ソフトスポンジ	N/A	N/A
PVCボード	N/A	N/A	厚さ0.3mm
ペトリ皿	N/A	N/A	160 mmや30 mmの深さを持つペトリ皿は、VIEタグの注入に便利です。
透明アクリル板	N/A	N/A
UVA フィルターライト	N/A	N/A
PVCパイプ	N/A	N/A	ø 5cm
防水シート	SOMAR Corp.	3EKW03	プレーンコピー機用フィルムです。
砂	N/A	N/A
実体顕微鏡	N/A	N/A
カメラ	N/A	N/A

( N95301601の使いやすいです。