このプロトコルでは、顕微鏡下で胚パターン形成の検査続く胚珠クリアランスを介してシロイヌナズナの胚発生を観察するためのメソッドについて説明します。
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この記事について
サマリー
要約
彼らの開発の高い予測可能な性質を与えられて、シロイヌナズナ胚として使用されている、モデル植物の形態形成の研究。ただし、早い段階の植物の胚は小さく、観察・分析が困難、ほとんどの細胞を含みません。モデル生物のシロイヌナズナを用いた顕微鏡下で植物胚におけるパターン形成の手法が記載されています。ホイヤーのソリューションを使用して新鮮な胚珠のクリアランス、胚の形態と細胞数の観察、発達段階には、微分干渉顕微鏡倍油浸漬レンズ 100 を使用してによって決められるかもしれません。また、タグ付きの緑色蛍光タンパク質 (GFP) と特定のマーカー蛋白質の表現は、共焦点レーザ走査型顕微鏡により胚形成の間にセル identity の指定に注釈を付ける監視だった。したがって、細胞・分子レベルでは、野生型植物胚におけるパターン形成を観察して野生型植物胚致死突然変異胚におけるパターン形成を比較することによって胚パターン形成における特定遺伝子の役割を特徴付けるには、このメソッドを使用できます。したがって、メソッドは、シロイヌナズナの胚発生の特性評価に使用できます。
概要
胚より高い植物の開発の最も早いイベントです。細胞分裂と分化厳格な遺伝子管理1,2の下で受精卵から胚形態。シロイヌナズナの胚は、胚発生の間に細胞分裂の順序が予想されるパターンは3,4あるため形態形成の制御の研究に有用なモデルです。ただし、複数のセルを 1 つを含むシロイヌナズナ胚は観察して分析するのには小さすぎます。さらに、ある特定の遺伝子の突然変異は胚致死5胚のそれらの遺伝子の重要な役割を示す可能性があります。胚致死突然変異体におけるパターン形成の解析という必須遺伝子は胚発生を調節する分子機構を理解するための基礎を提供します。
詳細な方法は、直接顕微鏡観察によってモデル植物シロイヌナズナの胚パターン形成の特性評価のためここで記述されます。メソッドには、胎児の観察に続いて胚珠クリアランスが含まれます。胚致死突然変異体の特性評価についても述べる.
さまざまな発達段階で胚の形態は、ホイヤーのソリューション6,
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プロトコル
注: このプロトコルは 3 つの部分: 1) DIC 顕微鏡を用いた野生型シロイヌナズナ胚のパターン形成の観察2)、胚パターン形成を介して共焦点レーザー走査顕微鏡を用いたマーカー蛋白質発現の観察評価・ 3) (例としてnaa10変異体を使用して) 胚発生における特定遺伝子の役割を決定します。
1. 胚珠クリア
- 植物材料の準備
注: ここで説明されているプロトコルは健康な植物を育てる方法の例健康な植物を育てるための他の方法はまた働きます。- 1.5 mL チューブに 100 種を追加し、消毒 5 分反転種子チューブ数回種子とソリューションが十分に混合された表面の種子を完全に殺菌することを確保するために 1.5% ナトリウム次亜塩素酸 (ミックス 85 mL の水で 10% 塩素 15 mL) の 1 つの mL を追加します。
- チューブの下に 30 の遠心分離によって種子を強制的に 1,200 x g で s が、上澄みを除去し、残留ナトリウム次亜塩素酸を削除するベンチで 4 回滅菌水で種を洗います。
- 4.4 g 培地、培 (MS) 基底塩の混合物とショ糖の 10 g を純水 1 L に追加します。塩とスクロースを分解する混合物をかき混ぜなさい。MS のショ糖にゲル化剤、Phytagel などの 3 ....
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結果
直接顕微鏡下で胚を観察し胚発生の間に細胞の identity の指定特定のマーカーにコメントを付ける、胚形成の間に特定の遺伝子の役割を特徴付けるこのペーパーで説明する方法を使用できます。
胚 (成熟した棒を歩いてステージに細長い受精段階) から野生型シロイヌナズナにおけるパターン形成の解析から代表の結果は、図 2のとおりです。胚珠クリアランス後 DIC 顕微鏡 (図 2) によりさまざまな発達段階で胚を識別できること。DR5 GFPの発現パターンは、共焦点レーザ走査型顕微鏡胚におけるオーキシンの分布を調べるし、シロイヌナズナの胚発生におけるオーキシンの潜在的な役割を確認する (図 3) の下で胚発生中に記録されました。
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ディスカッション
胚珠のクリアランスは、細胞分裂を検出およびシロイヌナズナの胚の形態を評価するための便利なメソッドこの手法を使用して、胚が DIC 顕微鏡5,12の下で直接観察できます。胚珠のクリアランスのための重要なステップは、1.3.4 のステップです。1.3.4 の手順で胚珠クリアランスに必要な時間変数です。2/4 細胞期胚はホイヤーのソリューションで 2 時間後 12 時間後不明瞭な見た目に対し明確に観察できます。したがってより成熟した胚珠は、通関に必要な時間が長くなります。
2.2.5 ステップで胚珠、胚を特定のスライドに適用されるフォースの量は重要です。あまりにも多くの力を適用しない場合の胚の粉砕が可能ただし、胚については、胚珠から押し出されますことはできませんあまりにも少し力を使用する場合。私たちの経験より成熟した胚珠が、以下の力が必要です。魚雷段階および成熟胚は、オープンの注射針を使用して胚珠を剥離によって直接分離できます。授粉の細胞の一部は、分離プ.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
博士ジェシカ Habashi は、批判的に読む原稿を感謝いたします。私たちはDR5 GFPの試金のローカリゼーションを実行するイメージング センター、ライフ サイエンス、首都師範大学 (中国北京) の大学の博士 Xianyong 盛を感謝します。この作品は北京市政府科学財団からの助成金によって支えられた (CIT & TCD20150102)、中国の国家自然科学基金 (31600248) から。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| クロラール水和 | 物 | Σ 15307 | |
| Murashige and Skoog 基礎培地 | Σ | M5519 | |
| フィタゲル | Σ P8169 | ||
| ハイグロマイシン | ロシュ | 10843555001 | |
| 成長チャンバー | パーシバル | CU36L5 | |
| 蛍光顕微鏡 | ツァイス オーバーコッヘン | ツァイス 画像 M2 | カメラ:AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495 - 555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| 栄養豊富な土壌 | KLASMANN, Germany | ||
| 50-mL tube | Corning Inc. | ||
| 1.5mLチューブ | コーニング社 | ||
| 10%次亜塩素酸ナトリウム溶液 | 国産分析試薬 | ||
| スクロース | 国産分析試薬 | ||
| KOH | 国産分析試薬 | ||
| グリセリン | 国産分析試薬 | ||
| 培養皿 | 国産 | ||
| 供給 バーミキュライト | 国産品 | ||
| スライド | 国産品 | ||
| シリンジ針 | 国産品 | ||
| 先端細ピンセット | 国産品 | ||
| スーパークリーンベンチ | 国産機器 |
参考文献
- Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).
- Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern. Annu Rev P....
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再版と許可
