ビオチン化を用いた初代星状細胞培養におけるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度の測定

Summary

この報告では、原形質膜で発現されるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度を決定するために設計された2つのビオチン化に基づく方法を提示する。

Abstract

細胞表面タンパク質は、幅広い機能を仲介します。多くの場合、それらの活性は細胞膜でのレベルを調節するエンドサイトーシスプロセスによって調節される。ここでは、細胞表面タンパク質のビオチン化の原理に基づくこのようなプロセスの研究を容易にする2つの方法の詳細なプロトコールを示す。第1は、細胞表面における特定のタンパク質の相対的レベルの半定量的測定を可能にするように設計されている。その中で、細胞の原形質膜タンパク質のリシン残基は、最初にビオチン部分で標識される。細胞が溶解すると、ビオチンに対する天然の親和性を利用してアガロース固定化ストレプトアビジンの使用によってこれらのタンパク質を特異的に沈降させることができる。このようにして単離されたタンパク質は、その後、標準的なウェスタンブロット法を介して分析され得る。第2の方法は、粒子のエンドサイトーシス速度を決定する手段を提供する細胞表面標的を一定期間にわたって標的化する。細胞表面タンパク質は、開裂可能なジスルフィド結合を含むビオチン誘導体で最初に修飾される。次に、細胞を通常の培養条件に戻し、ビオチン化タンパク質の割合をエンドサイトーシスで取り込む。次に、非内部ビオチン基のジスルフィド結合は、膜不透過性還元剤グルタチオンを用いて還元される。このアプローチにより、エンドサイトーシスタンパク質を高度に特異的に単離し定量することができる。

Introduction

細胞表面のタンパク質は、細胞機能を維持する中心的な役割を果たしています。多くの場合、それらの活性は、細胞内部位でそれらを一時的に隔離するか、またはそれらを分解経路1,2,3,4,5に向かわせるエンドサイトーシスプロセスに依存するか、または調節される。ここでは、2つのビオチン化に基づく手法を用いて、細胞膜で発現されたタンパク質と新たに内在化されたタンパク質を特異的にタグ付けして単離できるようにしました。これらの方法を介して、関心対象のタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度を定量化することができ、したがってその調節のより明確な評価を達成することができる。

ビオチン化による相対的細胞表面タンパク質発現の測定

以前はビタミンH ⁶として知られていたビオチンまたはビタミンB7は、生体分子の反応性アミン、スルフヒドリルおよびカルボキシル基を化学的に修飾するために使用できる小さな水溶性分子である。細胞表面ビオチン化試薬の現在の作物は、主として、ビオチンまたはその誘導体の膜不透過性スルホン化N-ヒドロキシスクシンイミド（スルホ-NHS）エステルからなり、ここで発現されるタンパク質のリジン残基の側鎖に存在するアミンと反応するように設計されているこれらが塩基性条件下で脱プロトン化され、ビオチン部分とアミド結合を形成することになる。このように改変された細胞表面タンパク質は、ビオチンに対して大きな親和性を有し、約10 ^-15の解離定数を有する後者に結合する66〜69kDaの四量体タンパク質であるアビジンの使用によって単離され得る。最も強い非共有結合相互作用^{8 、 9} 。

以前の研究では、細胞表面でタンパク質発現を定量化する多くの代替方法が用いられてきた。関心対象のタンパク質に特異的な蛍光標識された抗体を用いた不透過化細胞の標識は、例えば蛍光顕微鏡による視覚化が一般的に採用されているアプローチであるが、細胞外エピトープに結合する抗体の利用可能性に大きく依存する。より最近では、酸性培地に曝露することに反応するpH感受性フルオロフォアを有するキメラタンパク質の使用を含む方法も首尾よく用いられている¹⁰ 。しかしながら、このようなアッセイは、通常、目的のタンパク質がネイティブに見出されない細胞株におけるこれらの構築物の外因性発現を含む。それにもかかわらず、これらのアプローチは、細胞の局在化および細胞外経路に関する貴重な情報を提供することができるしたがって、ツールが利用可能である場合には、ここに記載されているビオチン化に基づくアプローチと併せて使用すべきである。

典型的なビオチン化アッセイでは、細胞をまず4℃のPBS中で完全に洗浄する。これにより、培地によって導入された微量の血清タンパク質が除去され、次のステップで過剰量のビオチンを消費しないことが保証されます。さらに重要なことに、温度の低下はエンドサイトーシスを著しく減速させる。次いで、ビオチン化試薬を添加する。次に、細胞を再び洗浄し、グリシンまたはNH ₄ Clのいずれかを含有するクエンチング緩衝液とインキュベートする。その目的は、未反応のビオチンのすべての痕跡を不活性化することである。次いで、細胞を溶解し、続いてアガロース固定化ストレプトアビジンを添加してビオチン化タンパク質を沈殿させる。分析は、ウェスタンブロッティングを介して一般的に行われ、様々なpr定量すべきoteins。

このアッセイの基礎のために、それは、細胞外環境に曝露された部分を有するタンパク質のみに用いるのに適している。シングルパスタンパク質はビオチン化されにくい傾向があるが、ループ領域内に多数の反応性リジンを有する可能性のあるマルチパス膜貫通タンパク質がこの方法に最も適している。これらの場合でさえも、構造変化または分子間相互作用が特定の反応部位を閉塞し、予想よりも低いビオチン化収率をもたらす可能性が残っている。

ビオチン化による細胞表面タンパク質の内在化速度の決定

このアッセイの原理は、細胞表面ビオチン化の原理に大いに類似しており、その中で最も重要なものは可逆的ビオチン化試薬の使用である。ビオチン基（これらの）は、還元剤の影響を受けやすい構造内の結合結合;これは、アッセイ期間中に細胞内部位に取り込まれた細胞表面タンパク質のみがビオチン化されたままであることを保証するために利用される。アッセイは、一般的に以下の方法で行われる。最初に細胞を洗浄し、冷たい試薬でビオチン化し、次いで37℃の細胞培地を再導入し、細胞をインキュベーターに戻す。これにより、標識された細胞表面タンパク質がエンドサイトーシスを受けるようになる。次いで、膜に浸透することができない還元剤であるグルタチオンを添加して、細胞表面上に残っているタンパク質に結合したビオチン部分のジスルフィド結合を破壊する。最後に、壊れたジスルフィド結合をヨードアセトアミドと反応させ、不安定なチオール基を消費し、結合が改質されないようにする。前と同様に、細胞を溶解し、標識タンパク質をストレプトアビジン - アガロースを用いて沈殿させる。

限界ディスク前のセクションでは、これらのメソッド間で共有されている類似性のためにここでも適用されます。さらに、このアッセイに伴う温度変化は、特に急速に内部移行したタンパク質または急速にリサイクルするタンパク質の場合に、各時間の増加につきどの程度の量のタンパク質がエンドサイトーシスされるかを正確に決定することを妨げるものである。従って、このアッセイは、エンドサイトーシス速度の半定量的な推定しか提供しない。全反射蛍光顕微鏡法を用いて、負荷された各小胞の取り込みを追跡し、エンドサイトーシスの動態のより正確な測定値を提供することができる。したがって、関心のあるタンパク質の蛍光標識されたキメラ構築物が利用可能であると仮定して、このアッセイに非常に有用な補完物を提供することができる。

Protocol

ビオチン化によるアストロサイトにおける相対的細胞表面タンパク質発現の測定

注：ここでは、水透過性チャネルアクアポリン-4（AQP4）の細胞表面局在に対する細胞外マトリックス分子ラミニンの効果の研究へのこのビオチン化技術の応用を示す。このアッセイに必要な特殊材料には、スルホ-NHS-LC-ビオチンとストレプトアビジン - アガロース樹脂が含まれます（ 表の表を参照）。

1. Noel et al。 ^図12に示すように、アッセイの約2週間前に皮質星状細胞の培養物を調製し、75cm ²通気培養フラスコ中でそれらを増殖させる。星状細胞が80〜90％コンフルエントである場合、0.05％トリプシンを用いてそれらを培養表面から分離し、次いでそれらを1：3で通過させる。
2. アッセイの48時間前に、細胞が再び80〜90％コンフルエントになると、通過星状細胞1：3（c培養形式でハンギング）を、60mm細胞培養皿上に置き、実験が行われる日に70％を超えるコンフルエントになるようにする。細胞が皿の間に均等に分配されるようにします。
3. アッセイの16時間前に、ラミニンを培地中にピペットで最終濃度24nMとし、37℃でインキュベートする。
4. CM-PBS（1X PBS中100mg / L MgCl ₂・6H ₂ Oおよび100mg / L CaCl ₂ 、pH7.4）、ビオチン緩衝液（0.5（pH7.4））中で、以下のように調製し、 CM-PBS中の50mM NH ₄ Cl）、消化緩衝液（25mM Tris、pH7.4,25mMグリシン、150mM NaClおよび5mM）中のスルホ-NHS-LC-ビオチン） 1％トリトンX-100,1Xプロテアーゼ阻害剤カクテル）、3Xローディングバッファー（150mMトリス、pH6.8,6％SDS、30％グリセロール、300mM DTTおよび0.01％ブロモフェノールブルー）および洗浄緩衝液（10mMトリス（pH7.4）、1.5mMのEDTA、150mMのNaCl、1％のTriton X-100,1×プロテアーゼ阻害剤カクテル）。
5. レムインキュベーターから星状細胞培養物を保持するオーブンの皿を取り出し、培地を捨てる。
6. 4 mLの冷たいCM-PBSで細胞を3回洗浄し、皿を砕いた氷上に置きます。
7. ピペット2mLのビオチン緩衝液を各ウェルに入れ、皿を前後に数回ゆっくりと数回傾けて、完全な被覆を確実にする。氷上に30分間放置する。
8. アスピレーターを用いてビオチンバッファーを除去し、4mLクエンチングバッファーと交換する。氷上に10分間放置する。
9. クエンチングバッファーを吸引し、同等の容量のものと交換してください。再度、氷上に10分間放置する。
10. クエンチングバッファーを捨て、4 mLの冷えたCM-PBSで細胞を3回洗浄する。
11. セルリフタを使用して1mLの冷却したCM-PBSに細胞をこすり、懸濁液をマイクロ遠心チューブに移す。
12. ペレット細胞を100×gで3分間遠心分離することによりペレット化した。上清を捨て、500μLの溶解緩衝液中で細胞を再懸濁する。
13. サンプルを氷上で30分間放置するか、5分ごとにボルテックスするか、またはpl4℃でエンドオーバー・ローテーターを使用してください。
14. ライセートを14,000 xgで10分間4℃で遠心分離して、界面活性剤不溶性物質を沈殿させます。上清を新しいマイクロ遠心チューブに移す。
    1. このライセートを50μL保存し、ローディングバッファーを追加します。次いで、それを乾燥浴中で95℃で加熱することによって変性させる;これは、ビオチン化細胞表面タンパク質および非ビオチン化細胞質タンパク質の両方を含有する「入力」画分である。
15. 一対の鋭いはさみを使用して、先端から約0.5 cmの材料を切断してピペットチップの開口部を広げます。このピペットチップを使用して、75μLのストレプトアビジン - アガロースビーズ（通常4℃で保存）をライセートに移し、4℃で3時間シェーカー/ロッカーでインキュベートします。
    1. ストレプトアビジン - アガロースは、50％のビーズを含有するスラリーとしてしばしば販売され、抗菌溶液中に懸濁されているので、スラリーを粉砕してビーズ150μLの懸濁液を各試料にピペットで移す。
16. ペレットストレプトアビジン - アガロースビーズを用いて、4℃、1500×gで30秒間遠心分離する。
    1. 上清50μLを保存する（ローディングバッファーを加え、水浴または加熱ブロックで95℃で変性させる）。これは「細胞内」画分を表し、主に非ビオチン化細胞質タンパク質からなる。
17. ペレット状のビーズを1 mLの洗浄バッファーに再懸濁し、4℃で3分間揺り動かします。ペレットビーズ（ステップ1.16のように）、上清を捨てる。非ビオチン化サイトゾルタンパク質の非特異的結合を最小限に抑えるために、このプロセスを4回繰り返す。
18. 遠心分離（4℃で30秒間1500×g）によってビーズをペレット化し、上にある洗浄バッファーを捨てる。 50μLの1Xローディングバッファー（溶解バッファーを使用して希釈）を添加する。これを95℃で変性させることによりビーズからビオチンおよびストレプトアビジンを遊離させる。この分数uldはビオチン化細胞表面タンパク質のみを含む（「細胞表面」画分）。
    1. 入力、細胞表面および細胞内画分をSDS-PAGE ¹³で分離し、ウェスタンブロッティングで分析します¹⁴ 。
       注：実験では4〜20％のプレキャスト勾配ゲルを使用しましたが、この研究で興味のあるタンパク質については、4％のスタッキング層（それぞれ0.1％SDSを含む）を含む12〜14％の分離ゲルで十分です。適切なサイズ範囲の分子量標準も使用すべきである。ビオチン化タンパク質の見かけ上の分子量に観察可能なアップシフトが存在することがあることに留意されたい。

ビオチン化によるアストロサイト内の細胞表面タンパク質の内在化率の測定

注：以下では、この例では、星状細胞におけるAQP4のエンドサイトーシスを追跡するために使用される典型的なパルスチェイスビオチン化実験を記載する。このメソッドは、マドリッドらが使用した方法に基づいています。 ¹⁵ 。必要な特殊材料には、スルホ-NHS-SS-ビオチン、ストレプトアビジン - アガロース樹脂、還元型グルタチオン、ヨードアセトアミドが含まれます（ 表の表を参照）。

1. 前のセクションで概説した方法を用いて、60mmディッシュ内のマウス大脳皮質の星状細胞の培養物を調製する。アッセイの日に細胞が約70％コンフルエントであること、および各ディッシュに同数の細胞が含まれていることを確認する。
2. CM-PBS（1X PBS中100mg / L MgCl ₂・6H ₂ Oおよび100mg / L CaCl ₂ 、pH7.4）、ビオチン緩衝液（0.5 （50mM還元グルタチオン、75mM NaClおよび75mM NaOH）、クエンチング緩衝液（50mMヨードアセトアミド、1％BSA、CM-PBS中）、溶解緩衝液（25mMトリス、pH7.4,25mMグリシン、150mM NaClおよび5mM EDTA、1％トリトンX-100,1（10mM Tris、pH7.4,1.5mM EDTA、10mMトリス-HCl、pH7.5）を含む3×ローディングバッファー（150mMトリス、pH6.8,6％SDS、30％グリセロール、300mM DTTおよび0.01％ブロモフェノールブルー） 150mM NaCl、1％トリトンX-100、1Xプロテアーゼ阻害剤カクテル）中で培養した。
3. 新鮮な細胞培養培地（10％ウシ胎仔血清（FBS）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、および1％L-グルタミンを補充したDMEM）を調製し、37℃の水浴中に置く。
4. インキュベーターから星状細胞培養物を除去し、アスピレーターを用いて培地を吸引する。
5. 4 mLの冷たいCM-PBSで細胞を3回洗浄し、皿を砕いた氷上に置きます。
6. 各ディッシュに3 mLのビオチン緩衝液をピペットで入れ、ディッシュを前後に数回傾けてバッファーがよく分散されていることを確認し、これを氷上に30分間放置する。
7. ビオチン緩衝液を吸引し、5 mLの暖かい培地と交換する。培養皿を37℃で15分間インキュベートし、第2の皿を同じ温度で30分間インキュベートする。 4時に別の料理を残す6; C：0分のサンプル。
8. インキュベーション期間の終わりに、培地を捨て、4mLの冷却CM-PBSで細胞を3回洗浄する。細胞上に6 mLの還元バッファーをピペットで入れ、氷上で15分間放置する。
9. 還元バッファーを取り除き、6 mLの新しい還元バッファーと交換してください。氷上にさらに15分間置く。
10. 還元液を取り除き、6 mLクエンチングバッファーと交換する。氷上で15分間放置する。
11. もう一度急冷ステップを繰り返します。
12. クエンチング緩衝液を捨て、4mLの冷PBSで細胞を3回洗浄する。
13. セルリフタを使用して1mLの冷却PBSに細胞を擦り、懸濁液をマイクロ遠心チューブに移す。
14. ペレット細胞を100×gで3分間遠心分離することによりペレット化した。上清を捨て、細胞を500μLの溶解緩衝液に再懸濁する。
15. これを氷上に30分間放置し、5分間ごとにボルテックスする。あるいは、サンプルを4℃の終端回転子にこの時間置いてください。
16. リットルを遠心する界面活性剤不溶性物質をペレット化するために14,000 xgで4℃で10分間インキュベートし、上清を新しい微量遠心管に移す。このライセート50μLを保存し、ローディングバッファーを添加し、乾燥浴中で95℃で変性させる;これはビオチン化エンドサイトーシスタンパク質と非ビオチン化タンパク質の両方を含む「インプット」画分である。
17. カットピペットチップを使用して、150μLのストレプトアビジン - アガローススラリーをライセートに添加し、4℃で3時間シェーカー/ロッカーでインキュベートする。このステップの詳細については、1.15を参照してください。
18. ペレットストレプトアビジン - アガロースビーズを4℃で30秒間1,500×gで遠心分離することによって単離した。
19. 1mLの洗浄バッファーにビーズを再懸濁し、4℃で3分間揺り動かします。ペレットビーズ（ステップ2.18）、上清を捨てる。非ビオチン化サイトゾルタンパク質の非特異的結合を最小限に抑えるために、このプロセスを4回繰り返す。
20. ペレットビーズを1,500 xgで30秒間、4℃で遠心分離し、ビーズを捨てる洗浄バッファー。 50μLの1Xローディングバッファー（溶解バッファーを使用して希釈）を添加する。ビオチンおよびストレプトアビジンをビーズから95℃で変性させることにより放出させる。この画分は内在化された細胞表面タンパク質のみを含む（「エンドサイトーシス」画分）。
21. SDS-PAGE ¹³で入力、細胞表面および非結合画分を分離し、ウエスタンブロッティングで分析します¹⁴ 。
    注：実験では4〜20％のプレキャスト勾配ゲルを使用しましたが、この研究で興味のあるタンパク質については、4％のスタッキング層（それぞれ0.1％SDSを含む）を含む12〜14％の分離ゲルで十分です。適切なサイズ範囲の分子量標準も使用すべきである。ビオチン化タンパク質の見かけ上の分子量に観察可能なアップシフトが存在することがあることに留意されたい。

Results

星状細胞におけるAQP4の原形質膜発現を評価するための細胞表面ビオチン化の使用
ラミニン処理した星状細胞培養物および未処理の対照細胞を、記載された方法を用いて細胞表面のビオチン化に供した。ビオチン化タンパク質をアガロース結合ストレプトアビジンで沈殿させ、次いでSDS-PAGEにより分離した。細胞表面画分をAQP4およびβ-ジストログリカン（β-DG）について細胞表面負荷対照としてプローブし、一方、入力および細胞内画分をローディング対照としてAQP4およびβ-アクチンについてブロットした（ 図 1A ）。細胞表面画分のバンド強度をデンシトメトリーにより定量し、各細胞セットのAQP4レベルを最初にβ-DG値に対して正規化し、次いでこれらの比を対照細胞のそれに対して正規化した。ヒストグラム（ 図1 B ）は、3回の独立した実験の平均値±SEMを表す。ラミニン処理は、平均して、細胞表面...

Discussion

変更：
これらの方法は接着細胞と共に使用するように設計されているので、100mg / LのMgCl ₂・6H ₂ Oを含有するPBSの使用を指定し、

細胞が培養表面に付着したままであり、細胞 - 細胞接合部が破壊されないようにするために、洗浄ステップのための100mg / LのCaCl ₂ （CM-PBS）および特定の緩衝液のベースとして使用する。しかしながら、プロトコールは、手順の各段階の間に細胞がペレット化される場合、非接着性細胞型に適用されてもよい。これらの場合、CM-PBSはPBSで置き換えてもよい。

さらに、ここで述べた各条件はこのプロトコルに固有であることに注意することが重要であり、この方法を他のアプリケーションに適用する場合には、大まかなガイドラインと見なすべきである。特に、洗剤の抽出手順が適切であることを確認する必要がありますr細胞タイプであり、遠心分離機の設定は細胞タイプに適しており、ストレプトア...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
塩化アンモニウム (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
ウシ血清アルブミン (BSA)	Sigma-Aldrich	A9647-50
ブロモフェノールブルー	Bio-Rad	#1610404
cOmplete プロテアーゼ阻害剤カクテル	Sigma-Aldrich	11697498001
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム (EDTA)	Bio-Rad	#1610729
Dithiothreitol (DTT)	Bio-Rad	#1610611
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	11960-044
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Fisher Scientific	#21335
EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin	Thermo Fisher Scientific	21331
ウシ胎児血清(FBS)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	16000-044
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
Iodoacetamide	Bio-Rad	#163-2109
Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫基底膜	Sigma-Aldrich	L2020	上で解凍します。
L-グルタミン	Gibco/Thermo Fisher Scientific	25030-081
マウスモノクローナル抗β;-アクチン抗体 (AC-15)	Sigma-Aldrich	A5441
マウスモノクローナル抗β;-ジストログリカン抗体 (43DAG1/8D5)	ライカバイオシステムズ	B-DG-CE
ペニシリン/ストレプトマイシン	Gibco/Thermo Fisher Scientific	15140-122
ペルオキシダーゼ アフィニピュア ドンキー 抗マウス IgG (H+L)	ジャクソン イムノリサーチ ラボラトリーズ	715-035-150
ペルオキシダーゼ アフィニピュア ヤギ 抗ウサギ IgG (H+L)	ジャクソン イムノ リサーチ ラボラトリーズ	111-035-045
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	10010-023
還元型グルタチオン	Sigma-Aldrich	G6529
塩化ナトリウム(NaCl)	Fisher Scientific	S271-500
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)	Sigma-Aldrich	862010
水酸化ナトリウム(NaOH)	フィッシャー・サイエンティフィ	S318-100
ストレプトアビジンアガロース樹脂	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	#20347
ウサギポリクローナル抗AQP4抗体	アロモン	AQP-004
トリス塩基(トリズマ塩基)	フィッシャー・サイエンティフィ	BP152-1
トリスHCl	フィッシャー・サイエンティフィック	BP153-1
トリトン X-100	フィッシャーサイエンティフィック	BP151-500