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方法論記事

うなずくにおける肝切除後肝脾内移植。SCID マウス

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DOI:

10.3791/56018

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2018年2月10日

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1National Institute of Immunology

この記事について

サマリー

ノドの部分肝切除 (PHx) と脾臓を介して細胞移植を実行するためのプロトコルを説明しました。SCID (うなずく。CB17-Prkdcscid/J) マウス。このプロトコルを公開し、脾細胞移植のための別の切開に続いて肝臓の左葉を切除する切開します。

要約

肝切除は、肝再生と各種病態における細胞による治療の効果を研究する汎用性と再現性のある方法です。肝部分切除は加速新生血管と肝臓への細胞移行によってまた増加移植と移植細胞の増殖を促進します。ここでは、免疫不全のうなずきを組み合わせた非肥満糖尿病/重度の脾臓で 30% 肝切除や細胞移植を実行するための単純なプロトコルについて述べる.SCID (うなずく。CB17-Prkdcscid/J) マウス。

この手順では、2 つの小さな切開が作られています。最初の切開を公開し, 肝左葉を切除、脾内移植細胞の脾臓を公開するもう一つの小さな切開を行った。この手順は、すべての専門的な手術のスキルを必要はありません、少ないストレスと痛み、高速回復、生存率と 5-7 分で完了することができます。マウス (トランスジェニック C57BL/6-Tg (UBC GFP) 30Scha/J)、として部分的肝切除会釈で人間の起源 (NeoHep) の細胞のような肝細胞を表現する緑色蛍光タンパク質 (GFP) から分離された肝細胞の移植を行った。SCID マウス。

概要

現在、重度の肝障害を有する患者の治療のための全体の臓器移植に代わるものとして肝細胞移植を提案する.それが全臓器移植1患者を埋めることができるといわれています。同種肝2、に加えてまた異種肝3と4幹細胞由来肝細胞を動物モデルで検討されています。このコンテキスト、ホーミングと生着受信者に移植細胞の潜在性は急性肝不全 (AHF) で基づく細胞療法の重要な基準です。

肝細胞の肝細胞様細胞5移植を調査、AHF が手術6か細胞移植薬理7手続、動物モデルで作成されます。薬理学的試薬、コンカナバリン A12、リポ多糖13, チオアセトアミド11四塩化炭素10アセトアミノフェン9d-ガラクトサミン8など多くの hepatotoxins によって AHF 動物モデルを作成するには、等.、使用されています。このリストからすべての試薬、AHF のユニークな一連の機能を生成しますが、単一試薬を人間 AHF 模倣ない残念なことに。また、hepatotoxins による AHF 慢性的なストレス下での動物を置く、長い時間がかかる、再現性のある結果が得にくい。

その一方で、肝部分切除 (PHx) の手術はスキル依存と再現性のある結果が必要なスキルを開発したら、入手しやすい。単独で外科的介入によって AHF を誘導して、肝臓の 70% 以上の切除が必要です。ただし、70% 肝切除は生着、増殖研究にまだ利用することができます未満は肝臓障害14中治療能力の分析の肝細胞を移植しました。肝細胞の移植は、腹膜15、16尾静脈、肝静脈17、または脾臓18を介して実行されるポスト肝切除をされています。現在、肝静脈注入と脾内移植肝細胞の最寄りの手順では、簡単に再現しています。

本稿でうなずきで 30% 部分肝切除のための手順を説明しました。SCID (うなずく。CB17-Prkdcscid/J) マウス肝臓の左葉が切除されます。それは、人間の起源は、脾臓で NeoHep19と同様、20 万の GFP 発現マウス (C57BL/6-Tg (UBC GFP) 30Scha/J) 肝細胞の移植が続きます。この手順は、肝臓移植細胞の生着につながります。この手順は、少なくとも侵襲的な少なくとも痛みを伴う方法です。

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プロトコル

このプロトコルで説明されている手順は、ニューデリー国立免疫学研究所の機関の動物倫理委員会によって承認されています。承認のシリアル番号は IAEC #319/13.

注: 一般的な手術手順20と齧歯動物の外科21のための特定のプロトコルに優秀な資源があります。初めて動物の外科手術を行うため、勧め広範囲の練習にダミーに手術動物で動作する前に。

1. 準備

  1. 実験前に滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) または生理食塩水の準備をしてください。
  2. はさみ、鋸歯鉗子、組織鉗子、コットン、綿棒、ナイロン スレッド、および異なるマイクロ ニードル ホルダーを含む手術キットを組み立てます。オートクレーブ手術キット。NOD は、免疫の低下した場合に、特別な注意が必要があります。SCID マウスは、プロトコルに含まれます。
  3. 手術の最後に準備から実験手順を実行、バイオ安全クラス I 内閣。
  4. うなずきの重量を量る。6-8 週間手術前に古いの SCID マウス。14 18 g の間の重量を量るマウスは本研究で使用されます。
  5. 髪トリマーにマウスの上部中央と肋腹部領域を剃る。髪のトリミングした毛を完全に削除にヘラで地域全体に均等にクリームを削除するを適用します。2-5 分後濡れた滅菌綿の部分のヘルプで軽く毛を削除します。
  6. イソフルラン チャンバーにマウスを置き、酸素ボンベのバルブのロックを解除します。4 L/分の速度で酸素の流れとイソフルラン気化麻酔を誘導するために 4% を維持します。
    1. マウスは、穏やかなつま先をつまんで適切に麻酔されていることを確認します。
  7. キャビネット バイオセイフティ内手術ボードを配置します。マウスの腹側を向いているし、マウスの前方部分はイソフルランと酸素の供給に接続されている鼻の円錐形内に配置するように、動物を手術基板に配置します。
  8. イソフルラン気化の 2% を削減し、手術を通してそれを維持します。
  9. マウスの皮膚を消毒して、70% エタノールに浸した滅菌綿で拭くことによってそれを殺菌.

2. 手術

  1. 肝部分切除
    1. 剣状突起と直線動作はさみの助けを借りて、胸部に平行に垂直、胸骨のすぐ下に皮膚の約 1 cm の横切開を加えます。
    2. 鉗子や皮膚や腹部の筋肉の層を区別する湿らせた滅菌綿棒付け切開領域近傍の腹部の筋肉層で皮膚を優しきます。乾燥を避けるために滅菌綿棒を使用して PBS の皮地域を浸します。
    3. 左葉の領域を剣のすぐ下に腹膜の層を介して横切開することによってスムーズに公開します。肝臓の左葉を持ち上げてを公開する 2 つの湿らせた綿棒を使用します。
    4. カットの腹部側に綿のヒントの一つに、ダイヤフラムの側面の別の綿のヒントを置きます。優しく、横隔膜に向かって配置ヒントを押すし、肝臓の左葉を持ち上げることによる他の先端スライド プッシュを与えます。
    5. リフトの左葉をループのナイロン糸を滑り、マイクロ鉗子または綿のヒントの助けを借りて、肺門の近くに左葉の底部に向けてループをスライドさせます。左の葉のベースにナイロン糸ループの下を軽く押します。
    6. マイクロサージャリー針ホルダーとマイクロ鉗子を使用して左の葉の上にナイロン糸の両端を結ぶ。反対側に 2 つの追加の結び目を作る。
    7. はさみの助けを借りて、結ばれた葉を分析します。スレッドに近い非常にカットしようとしないでください。場合に手順は、5 分以上続く、潤いを保つ腹腔内や臓器体液の損失のための乾燥を避けるために滅菌 PBS の。
    8. 連続 4-0 腸線縫合糸を使用して縫合、腹膜を縫います。その後、できるだけ早く不連続縫合で皮膚を閉じます。
  2. 細胞移植
    注: GFP 発現肝細胞が GFP トランスジェニック マウスから分離された (C57BL/6-Tg (UBC GFP) 30 Scha/J)、李らによって記述された手順に従って。22と沈ら。23 24単球から分化したひと由来の肝細胞様細胞 (NeoHep) は、移植にも使用されました。ただし、他のソースから派生したセルは、プロトコルに使用もことがあります。
    1. 20 万約 50 μ L Iscove の変更ダルベッコ媒体 (IMDM) の細胞を中断し、30 G 針でキャップ 1 mL インスリン注射器で吸引します。氷の上に置くことで、シリンジの寒さを維持します。
    2. 手術を行う人に向かって左の外側部分が上を向くようにマウスを配置します。脾の領域を識別するそして横脾臓を公開する腹膜の層を介して短い切開に続けて、肋領域付近の皮膚を解剖します。
    3. 優しく、脾臓を持ち上げて、2 つ PBS の助けを借りて共振器外には綿棒を湿らせた。
    4. 片手で 2 つ綿棒で慎重に脾臓を押し、注射器の針を脾臓に正確に垂直に配置します。優しく脾臓に穴を開けるし、針を押して内部で非常にゆっくりと。針は、2 mm よりも深い取得しないでください。
    5. 注射器のピストンをゆっくりと脾臓に細胞を注入するプッシュします。移植後注射器の針を安定に保つため、出血を避けるために脾臓または細胞の損失からゆっくりと取り外します。
    6. 綿のヒントと腹腔内に脾臓を配置した後 4-0 腸線縫合糸で連続縫合により腹膜の層を閉じます。不連続同じ縫合と皮膚を縫います。皮膚を閉じるため傷クリップを使用しないでください。代わりに、4-0 縫合して閉じます。傷クリップがマウスの自然な動きを制限して多くの場合クリップが緩むし、すぐに出てくる。

3. 手術後のケア

  1. 皮膚を閉じると後に、、ヨード溶液 (betadine) 滅菌綿棒を使用して縫合サイトの両方の周りを拭いてください。
  2. 600 mg/kg 本体重量 (通常は、100 μ L の生理食塩水/マウスで 12 mg セフォタキシム) 腹腔内と抗生物質セフォタキシムの線量を注入 1 mL の注射器を使用しています。
  3. 鎮痛剤メロキシカムの毎日の用量として与える 1 mg/kg 体重 (通常 12 μ g メロキシカム生理食塩水/マウスの 100 μ L の) 動物に腹腔内、手術後は、3 日間。
  4. 手術の終了後、イソフルラン麻酔ガスの流れを止めるし、個別換気ケージに戻ってマウス カーソルを置きます。

4. euthanization とキャラクタリゼーション

  1. 実験的エンドポイント (1 日、手術後 10 日) 後に、、動物倫理ガイドラインに従ってマウスを安楽死させます。
  2. 末期眼ターミナル神経叢を穿刺、動物の出血によって血を収集します。
  3. 血液から血清を分離します。

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結果

30% 肝部分切除後の肝細胞増殖:細胞増殖マーカー、Ki 67 の染色 (IHC) を免疫組織化学によって 30% 肝切除後肝残りの肝細胞の増殖を調べた。1 日ポスト肝マウスを安楽死させ、残りの肝葉摘出、およびパラフィン切片が得られました。西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 共役二次抗体とラベリングに続いて、Ki 67 抗体染色しました。・ ディ ・ アミノ ベンジジン (軽打) は、染色の細胞を識別するために茶色の色の開発の HRP の基板として使用されました。核はヘマトキシリンで染色され、20 X 客観的顕微鏡下でカウンターだった肝部代表 IHC イメージを図 1に示します。約細胞 (13.66 ± 0.317、N = 3) の 13% が Ki 67 正、30% 肝切除マウスの肝臓で肝細胞の増殖が容易になることを確認します。

解剖学的研究:うなずくの肝臓の代表的なイメージ。SCID マウス、10 日ポスト肝切除は

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ディスカッション

肝部分切除は調査の肝再生に確立された技術と過剰な切除は AHF モデルを模倣に報告されました。AHF の動物モデルは、齧歯動物、特にマウスは最も研究のモデルがあります。70% 肝切除までのマウス肝障害モデルを取得するには、良い生存率25,26で報告されています。しかし裸や他の免疫不全マウスは、70% 肝切除を致命的なものとして報告された、24 時間27以内に動物が死亡しました。

ミッチェル ・ Willenbring28は、再現性と忍容性マウスの 2/3 切除法を示した。合図。SCID マウス肝切除された肝総量の 30% 近くが左の肝葉切除までは制限時 100% 生存率を得た。ヌードマウス27の観察、に沿っていずれかのうなずきで肝切除の割合の拡大を見ました。SCID マウスは生存率の劇的な低下につながります。また、増殖残りの...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、インド政府ニューデリー国立免疫学研究所生物資源科学部から受領したコアによって支えられました。博士バッタチャルジー現住所は消化器科、肝臓と栄養、子供のロサンゼルスの病院です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ガス麻酔システムUgo Basile;イタリア211000
計量機Goldtech;インド現地調達
生物学的安全キャビネット(クラスI)Kartosインターナショナル; インド現地調達
ヘアトリマーパナソニック; 日本 ER-GY10 
シャープ/シャープブレードメジャーサージカルズを備えたストレート操作ハサミ。鋸現地調達
鉗子。インド現地調達
マイクロニードルホルダー ストレート&カーブ メルシャン; イングランド BS-13-8
1mlインスリン注射器(30G付き) *5/16針 ディスポバン;インド
1mlシリンジ、26G * 1/2針BD;IT (英語)参照番号 303060
ナイロン糸  強大;インド(1-0) 現地調達
MERSUTURES 4-0 滅菌外科用針縫合Ethicon, Johnson &ジョンソン、インドNW 5047
TRUGUT 76 cm 4-0 吸収性外科用縫合インド Pvt. Ltd;インドSN 5048外科用針縫合糸Catgutクロミック
綿棒ピュアスワブPvt Ltd; インド現地調達
外科用テープ3Mインド;インド1530-1Micropore Surgical Tape
MicrotomeHisto-Line Laboratories, ItalyMRS3500
Shandon Cryotome E CryostatThermo Electron Corporation ;米国
共焦点レーザー走査型顕微鏡カールツァイス;ドイツ LSM 510 META
明視野顕微鏡オリンパス、日本LX51
自動分析装置チューリップ、アルト・サンタクルス、インドスクリーンマースター 3000肝臓機能検査用生化学分析装置
フローサイトメーターBD ;IT (英語)BD FACSverse移植後の細胞の存在の評価
Veet脱毛クリーム レキットベンキーザー、インド
FORANEアボット;米国イソフルランUSP 99.9% 
タクシーアルケム;インドセフォタキシムナトリウム注射
ポビドン-ヨウ素溶液 メディケアを勝ち取ります。 インドベタジン
パラホルムアルデヒドHimedia;インドGRM 3660
Iscoveの修正ダルベッコのミディアム(IMDM)Life技術、サーモフィッシャー科学;US12200-036
糖シグマ;USS0389
ティッシュテックサクラ;US25608-930OCTコンパウンドDAPI
ハイメディア;インドMB 097
抗アルブミンヤギポリクローナルサーモサイエンティフィック、ピアス、米国PA126081
抗コネキシン32 / GJB1ポリクローナルabcam、英国ab64609-500
抗GFPウサギポリクローナル サンタクルスのバイオテクノロジー;USSC 8334
Alexa Fluor 594ロバ対ヤギ 分子プローブ、サーモフィッシャーサイエンティフィック; USA11058
Alexa Fluor 488ロバアンチシープ 分子プローブ、サーモフィッシャーサイエンティフィック; 米国A11015
アレクサフルーア594チキンアンチウサギ 分子プローブ、サーモフィッシャーサイエンティフィック; USA21442
ヤギ抗ウサギIgG HRPInvitrogen、サーモフィッシャーサイエンティフィック;IT (英語)65-6120
抗 Ki67 抗体abcam、英国ab15580
抗原アンマスキング ソリューション、クエン酸塩基ベクター研究所、USH-3300
ProLong Diamond 退色防止封入剤Life 技術、サーモフィッシャー科学;USP36966
SGOT (ASAT) KITCoral Clinical System, India
SGPT (ALAT) KITCoral Clinical System, India
Alkaline Phosphatase Kit (DEA)Coral Clinical System, India
Hematoxylin Solution, Mayer'sSigma ;USMHS16
Eosin Y溶液、アルコールシグマ;米国HT110132
DPXマウンタント シグマ;US6522
メロネックス(鎮痛剤)Intas Pharmaceuticals Ltd;インドメロキシカム注射 
DAB強化液体基質システム四塩酸塩シグマ;米国D3939
歯状の主要な外科用鋸歯を持つインドの糸 滅菌ショ

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