方法論記事

アフリカツメガエルのリープフロッギング CRISPR/Cas9 ベースの始原生殖細胞の移植

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DOI：

10.3791/56035

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2018年2月1日

1Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

この記事について

サマリー

生存に不可欠な遺伝子突然変異系統を作成するための技術的なハードルをもたらします。リープフロッギング ゲノムの生殖細胞系突然変異を運ぶ野生型動物を作成する始原生殖細胞移植と編集を組み合わせることにより致死性を回避できます。リープフロッギング F1世代でホモの null 変異体の効率的な生成ができます。ここでは、移植の手順が示されています。

要約

ゲノム編集による突然変異系統の作成は多くの有機体の遺伝解析を加速しています。CRISPR/Cas9 方法は、アフリカツメガエル、アフリカツメガエル、生物医学研究のための長年のモデル有機体の使用のために適応されています。CRISPR/Cas9 標的突然変異のホモ接合体の突然変異系統を作成するための伝統的な育種方式があるいくつかの時間がかかり、骨の折れる手順。特に、胚形成に不可欠な遺伝子をノックアウトに関連付けられている障害を克服するために突然変異体の胚の作成を容易にするには、リープフロッギングと呼ばれる新しい方法を開発しました。この手法は「カットアンド ペースト「アフリカツメガエル胚の堅牢性を活用して胎生学的方法。リープフロッギング PGC アブレーション野生型兄弟に効率的に突然変異誘発ドナー胚から始原生殖細胞 (PGCs) の伝達を利用します。このメソッドは、必須遺伝子の効率的な変異の変異の生殖細胞を運ぶ野生型細胞とキメラ動物を作成することによってできます。ときを運ぶ 2 つの F0動物」を抜いて移植」(すなわち、突然変異体生殖細胞) を intercrossed、彼ら胚を作り出すホモ、または複合ヘテロ接合体、null F1 、そのため表現型データを取得する完全な生成時間節約します。F0表現型解析 CRISPR/Cas9 変異を次に不応性である母性効果遺伝子を解析するための新しいアプローチを示しますもリープフロッギングします。この原稿は、リープフロッギング、PGC 移植を正常に実行する方法に特別な重点を置いての方法を詳しく説明します。

概要

遺伝子型が表現型にエンコードし、メンデルの法則の再発見から生物学の主要な質問がされています。発掘の新しい生物学および従って, これらの疾患状態のツールを提供するためにエンコードされた製品約束の機能と遺伝子、その調節と遺伝子ネットワークの相互作用の役割の理解。半分以上世紀1アフリカツメガエル、アフリカツメガエルは、基礎生物学、生物医学、開発の遺伝制御を含むさまざまなトピックに関する研究の主要なモデルをされています。歴史的に、アフリカツメガエルのほとんどの研究は、allotetraploid カエル、 X. laevisを使用しているが、最近では、その二倍体遺伝のために、 X. tropicalisを両生類遺伝モデルとして開発されています。全ゲノム配列は、両方アフリカツメガエル種2,3から組み立てされています。「カエルのコミュニティ」は基礎ゲノム改質技術が許可されている遺伝子機能の研究事実上はターニング ポイントで今です。プログラマブル CRISPR/Cas9 酵素からの遺伝子の突然変異を誘発した非常に効率的に、シュミレーション可能な大部分の細胞の変異動物4,5,6,7、 8,9,10,11。バッタチャリヤらによって強調したこれらの研究12重田ら13F0モザイク動物の突然変異誘発による多くの遺伝子の機能を学ぶことができることが示されています。このアプローチは多くの利点;ただし、Cas9 sgRNA microinjected 胚はしばしば関数 (LOF) の不完全な損失のため変数表現型を表示します。大きくなり、突然変異系統の生成は、いくつかのアプリケーションのため、非常に有利、特に母性 mRNA 貢献をしている遺伝子の研究の際に。母性 Mrna とタンパク質とエピジェネティクス、胚発生14,15,16、多くの遺伝子の早期発達貢献をレンダリング長時間にわたって永続化します。F0解析する耐火物。したがって、他の LOF のアプローチが必要です。

突然変異系統を作成しようとすると、ホモの LOF の胚を取得するパスはいくつかの障害には。必須な遺伝子機能の損失結果として生き残るために性的に成熟、現実的なラインの生産と干渉する障害シュミレーションの突然変異を生成する最初、効率的な変異が不利なるです。一般的なソリューションは、Cas9 sgRNA の配信量の慎重な滴定です。ここでは、目的はまた生殖細胞系突然変異誘発効率を最大化しながら致死率を減らすことの間のバランスを達成するためにです。2 番目の問題は、表現型解析が F2世代まで遅延される標準的な育種方式から発生します。標準的なアプローチを使用すると、性的成熟する F0動物生殖細胞を通じて対立遺伝子が F1ヘテロ「キャリア」が、性的な成熟に成長して生成する outcrossed 変異体を送信します。2 F1ヘテロ接合体は、25% の期待されるメンデル頻度で F2変異胚を作り出すため、intercrossed します。したがって、繁殖の二世代が突然変異体の表現型解析のため必要です。変異動物は、急性または複合ヘテロ接合体 (すなわち、子孫含む 2 つの異なる変異対立遺伝子、F1エムアンドエー インター クロスにおける親動物の遺伝子型に依存する) 可能性があります。

これらの障害は、プログラマブル ヌクレアーゼを介した突然変異誘発による生殖細胞、馬跳び17と呼ばれる新しいメソッドの基礎となる拘束で克服できます。2 つの主要コンポーネントがありますリープフロッギング: (1) 一緒に sgRNA、またはヌクレアーゼ sgRNA 錯体 (または原則、TALENs または亜鉛指核酸) Cas mRNA マイクロインジェクション (2) 続いて胚性ゲノムを効率的に mutagenize に単一細胞の段階でPGCs の内因性の PGCs が削除された、野生型の兄弟の胚への移植。両方の手順が突然変異体の生殖細胞を効率的で、完全な生殖系列の置換を取得できます。Blackler は、後半 neurula で胚と早く尾段階18,19アフリカツメガエル始原生殖を移植できれば、1960 年代初頭に示した。リープフロッギングの Blackler のアプローチは、胞胚のステージ17で移植胚20,21の植物極の PGCs がローカライズされる場合を実行することによって変更されました。原腸陥入前に移植には 2 つの主な利点。まず、移植とそれに続く正常な発達の生着は (未発表観察) 胞胚の段階で移植するときより効率的なことが判明しました。第二に、ココヤシの転写の開始後まもなく、胞胚期移植を実行する、不正な後半 neurulae に導いてくれる原腸陥入を混乱させる変異進化の遺伝子から生じる致死避けることが 1 つ。PGC 移植軸受 (「アベンテイル」) 胚が性的に成熟、成長、これら F0動物間の intercrosses は、F1子孫の 100% は多くのケースで、LOF 表現型 (ほとんどされている化合物も表示を示しています。ヘテロ接合体)、対象となる遺伝子変異を有する完全な生殖系列の置換を示します。

リープフロッギングアフリカツメガエルの遺伝的アプローチを加速する予定です。22 「ホスト転送」メソッドに代わるは母性効果遺伝子 (未発表観測) の LOF の分析も、飛び越えて.現在の文書では、PGC 移植中心メソッドの詳細な説明はX. tropicalisで (、 X. laevisに変更を加える) されます。PGCs の移植は、アフリカツメガエルの使用他の所により迅速な技術移転を容易にする紹介です。この方法の原理は他の両生類 (例えば有尾) に成功したする必要があり、効率的な変異を実現する他の多くの動物への応用方法論で生物固有の変更を許可し、PGCs が容易に移植できます。

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プロトコル

ここで説明するすべての方法は、制度的動物のケアとカリフォルニア大学アーバイン校の利用委員会によって承認されています。

1. PGC 移植の準備

  1. 前述23として解剖ツールを事前に準備します。
    注: 眉髪のナイフは、切開手術を実行しているとき、胎児を安定させるために毛のループの支援に使用されます。眉毛と髪のループを炎で描かれた最初パスツール ピペット ホウケイ酸ガラスに接着し、薄くなった部分に壊れた (図 1 aを参照してください矢印) 手先の器用さより短くより狭いヒント (図 1 b) を作成するには手術の際に。
  2. 手順説明した24を使用して sgRNAs を生成します。
    注: 簡潔に、短い DNA テンプレート sgRNAs のためのコーディングが作成されます、エラー無料、耐熱性 DNA ポリメラーゼを焼鈍が 5' バクテリオファージ T7 プロモーターと「入力」を含む重複する deoxyoligonucleotides を使用しています。SgRNA 合成反応の in vitro (キット使用) によって一夜にして数時間孵化します。反応は、DNAse 処理テンプレートを削除します。SgRNAs は24キットの製造元の指示に従ってフェノール/クロロホルム抽出とアンモニウム酢酸/イソプロパノール沈殿の標準的な方法で精製しました。
  3. 直前に薬剤を実行すると、最初の変化 〜 250 で Cas9 sgRNA 錯体を準備 RNAse フリー (ジエチルピロカーボネート処理) H2O 60 から 65 ° c 5 分の総量が 3 μ L sgRNA の ng は、5 分間氷の上迅速な冷却が続きます。数秒間、sgRNA を遠心 1 μ g/μ L Cas9 蛋白質の 1 μ L を追加して、複雑な形成を促進する 37 ° C で 10 分間インキュベートします。
    注: このインキュベーション後チューブを維持する氷上一方マイクロインジェクションの胚を準備します。
  4. 前述の25として標準的な方法を使用して体外受精によってX. tropicalis胚を取得します。25,26を解除ゼリー 10 分後受精で胚。
    注: 受精の時間時間後に卵に精子懸濁液を追加し、料理は 1/9thX が殺到である Marc の着信音の変更 (MMR)26。X. tropicalis25、 X. laevisとは異なり実行 1/9 で解除ゼリー x MMR システインの遊離の塩基の 3% (ない塩酸塩) を含む pH 7.8 8.0 に調整は 1/9 で複数の洗浄が続く x MMR。(1%)、アガロースに胚を転送-1/9 を含むコーティング皿室温で x MMR。
  5. すぐの 1 を含んでいる 1% アガロースゲル コーティング皿注入胚を転送パスツール ピペットを使用して x MMR。
  6. 1 細胞の段階で投入します。参照26,27 アフリカツメガエルマイクロインジェクション メソッドの詳細についてを参照してください。
    1. 4 動物極で 1 つのサイトでそれぞれの胚に注入 Cas9 sgRNA 複合体の nL (最終的な金額 = 1 Cas9 と sgRNA の ~ 250 pg の ng; 見なさい議論)24。インジェクション サイト癒しの 10-20 分後 1/9 を含む agarose コーティングの皿に胚を転送 x MMR 25 ° c. で孵化させなさいと胚移植の受信者として使用される uninjected の兄弟の皿を作成もできます。
  7. 〜 5 mm を含むペトリネット プレート (60 mm) を準備-0.3、1% の agarose の厚い層 x MMR、 X. tropicalis、または 1 の移植を行う場合X. laevisの x MMR。
    1. 3 ~ 4 のくぼみを作成 mm、3 を挿入することによって深い-4 ウェル金型 (96 ウェル PCR プレートを切断することによって作成された) x 溶融 agarose プレートを注ぐときに (図 1を参照してくださいとD)。Agarose が固まるまで、リング スタンドに接続されているクランプを使用してシャーレの底の上の数ミリの金型を保持します。
    2. さらに、1/9、1% の agarose の薄層で井戸をコーティングすることにより家個々 の胚に 24 ウェル プレートを作る x MMR。
      注: これらの井戸に追加培養培地はゲンタマイシン硫酸塩/mL の 50 μ g を添加した MMR 1/9 x。

2. PGCs の移植

  1. とき胚だけ Nieuwkoop とフェーバー28胞胚の段階に達する 9 (図 2 a) ~4.5 h X. tropicalisのためのポスト受精 (hpf) 25 の ° C の定温器から削除し、さらに室温に釣り合うように0.5 h。
  2. 5 に移植を開始する hpf (図 2 b)、0.3 のくぼみ (1.7 のステップで作成した) を含む 60 mm agarose の皿に (Cas9 sgRNA と挿入された) 1 つの PGC ドナー胚を転送するパスツール ピペットを使用して、x MMR (または 1 x MMR X. laevisを使用している場合)。また、1 つ uninjected 兄弟の胚移植の受信者は、この皿に転送します。
    注: これらの胚のそれぞれのアイデンティティが混同されていないことが重要です。
  3. 手動で鉗子を使用してそれぞれの胚から卵黄の封筒を削除し、植物極がビューで、手術のためアクセス両方の胎児を回転させます。
    注: 胚のマニュアル ・ デ ・ vitellination の説明に記載されている26がきた。
  4. 髪、眉のナイフの鋭い先端を使用して、マーク、原口将来ボトル細胞が形成されますゾーン中、受信者の胚の植物極に正方形の形をした 4 つの浅い切開を作る。胚は、毛のループを持つ胚の安定が上向きの動きをスライスして、表面のすぐ下に眉髪のナイフの先端を挿入して切開を行います。
    注:図 2 4.5 7.0 hpf セル サイズを表示してボトル細胞が (白の破線円) を形成を推定するためのガイドを提供するから half-hourly 間隔で胚の植物性のビューを示します。目的は、ように切開し、破線のブラック ボックスが示されているです。
  5. 正方形の 4 つの側面は、切開で区切られる、一度眉髪のナイフが類似の切断動作を使用して深さの約 1/3、1/2 胞胚腔の床までの距離に到達すると各切開を深めます。
  6. 無料の受信者の胚からの植物組織植 (図 3 a とB) (植物の表面に平行) 水平することによって深い植物地域で cut(s)。
    注: PGC 含む植物性外植体のサイズは約 0.4-0.45 mm 面ごと mm で深さ 0.25 0.3。受信者の胚からこの植物の植が不要し、破棄される脇したがって設定する必要があります。
  7. すぐに働いて、この手順 (手順 2.4 2.6) PGC ドナー胚移植のための同様に大きさで分類された植物組織片を作成するを繰り返します。
    注: その傷口を癒すために受信者の胚のための時間を最小限に抑えるため遅延の少ないこの第二の郭清を行うことが重要です。
  8. ドナー胚始原生殖を含む組織を削除すると、受信者の胚は、開口部の位置にこの植を移動するのに眉髪のナイフと髪のループを使用します。
    注: ドナー移植片の内部の表面は受信者の胚の内部に直面する必要があります。受信者の胚で移植の背腹軸、左右の軸の向きを揃える必要はありません。
  9. 受信者の胚の植物の表面の開口部に移植をそっと押して、移植片の表面に平行に開催眉髪のナイフの軸の長いエッジを使用します。
  10. 一度移植を配置すると、ドナー胚の「死体」をアガロースうつ病優しく agarose 表面にスライドするのに、hairloop または、眉髪のナイフのシャフトを使用します。死体の傷口で大量の液体が直面していることを確認します。該当しない場合は、この方向性を達成するために胚を回転させる眉髪のナイフを使用します。
  11. 癒しの場所に隣接するうつ病に移植の受信者の胚をスライドし、同様に接木された植物極組織が大量の液体を直面していることを確認してください。
  12. ドナーと受信者の胚の別のペアを使用して移植/死体の別のペアを作成するこの手順 (手順 2.1 2.11) を繰り返します空のくぼみに、これらを転送します。
    注: 死体と胚移植軸受のペアを追跡する表記をするとが重要です。ドナー死体移植軸受け動物性的成熟に達するまで簡単に測定できない移植の PGCs の Cas9 sgRNA 誘発突然変異の効率のプロキシとして使用されます (以下、3.3、手順を参照してください、ディスカッション).
  13. 胚までは約 6.5 約初期原腸胚ステージ 10、移植を作り続けるX. tropicalisで hpf (図 2 eを参照してください)。

3. 胚世話治癒後

注: 移植を癒す ~ 30 分以内の場所に、通常セル換散 (図 3) 胚から染み出すからいくつかの卵黄の残骸を観察します。

  1. 癒される、アガロース コーティング 24 ウェルのプレートの個々 の井戸にくぼみから非常に優しく移植胚にパスツール ピペットを使用します。液になります流体転送中に混合によって (図 3 D) を削除します。
    1. 一括ソリューションを直面する植物性極配置されますので、胚を回転します。また、ドナーの死体を置き移植胚のペアを追跡するのに支援するために隣接する井戸の受信者この情報を記録します。
  2. 一晩文化の 25 ° C の定温器に胚を含む 24 ウェル プレートに転送します。
    注: 次の日、胚が持っている尾の段階に達した。
  3. ゲンタマイシン硫酸塩/mL、ウェルあたり 1 胚での 50 μ g を添加した MMR 1/9 x を含む agarose コーティング 6 ウェル プレートをきれいにする移植の受信者を移動します。これらに一致するドナー死体の明確な記録の受信者を移植します。
  4. シーケンス PCR 産物5,17,24または PCR 産物 (ディスカッションを参照) に依存する他のメソッドを使用して突然変異誘発効率を評価するために個々 の死体を 0.2 mL PCR ストリップ管に移動します。媒体のほとんどを削除し、100 μ L 換散バッファー24プロテイナーゼ K (PK) によって繰り返し上下ピペッティング P200 ピペットを使用してを含む均質化します。
  5. 胚換散24 PK 消化を許可するように一晩に 6 h 56 ° C でを実行します。クイック 4 ° C に冷却後、10 分の 90-95 ° C に加熱することによって PK を不活性化します。直接サンガー DNA シーケンス24の短い産物を取得するのに PCR の反作用をシードするのにさらにクリーンアップ手順を実行することがなく溶解液を使用します。-20 ° C の溶解液を保存します。
    注: いくつかの日以内オタマジャクシ栄養段階 (約ステージ 45 46) になるし、浮遊性粉末 (血清ミクロン) の懸濁液を供給することができます。
  6. 培地に清潔を維持し、微生物の増殖を最小限に抑えるための日変化との 〜 1 週間後点滴の流れと循環水生システムの小型タンクにオタマジャクシを移動します。シーケンス データを使用すると、突然変異誘発に低い効率とオタマジャクシから高効率人為 PGCs のオタマジャクシを分離します。変身が完了したら、一度、froglet をラボで大人の水生システムに移動します。
    注: 国立アフリカツメガエルリソース (MA、ウッズホール海洋生物学研究所) が開発した療法は29と大人カエル メンテナンス30餌オタマジャクシのガイドを提供します。

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結果

次の移植、CRISPR/Cas9 の突然変異の効果の定性定量は、成長し、性成熟に動物を維持し畜産の努力を費やす前に行わなければなりません。リープフロッグ移植を運ぶ動物アデノーマ野生型、生殖細胞は直接測定のアクセスも困難ですのでドナー胚の死体の保存が重要になります。死体から DNA 解析は、移植生殖17で発生する突然変異の程度のためのプロキシとして機能します。

突然変異の成功を評価する 1 つの方法は、対象となっているゲノムの領域にまたがる PCR 産物を直接シーケンスすることです。多くの動物から多数個別に複製する DNA のフラグメントのシーケンスに特にコストと非効率な 1 つの願いになります。モザイク胚遺伝子から派生するいるとターゲット ・ サイトで異種 amplicons のシーケンスを使用して各胚19の変異導入効率を評価する代わりに、...

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ディスカッション

このレポート提供中動物の生殖細胞を変更する PGCs。 移植の PGCs を含む植物性の組織移植のための詳しいプロトコルはゲノム編集技術 (例えばCRISPR/Cas9) と組み合わせて使用遺伝子野生型としてその体細胞組織のほぼすべてを維持します。成功するリープフロッギングの行う移植を実行する前に考慮すべき重要な要因の数があります。

生殖細胞の突然変異体の対立遺伝子との完全な代替品を確保するため、1 つは最初 sgRNAs の生体内で効率を決定することをお勧めします。経験では、ほとんど sgRNAs CRISPRDirect (https://crispr.dbcls.jp/) または CRISPRScan (http://www.crisprscan.org/) によって設計されている 250 pg/胚で使用すると効率的を示唆しています。ただし、場合によっては、高濃度 (例えば電撃ら17刊gsc sgRNA ~ 1 ng/胚を必須) を使用する必要がある場合があ...

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開示事項

著者は、何を開示します。

謝辞

この作業は、助成金の支援を受けて行われた 5R21HD080684-02、国立小児保健と人間開発から。著者は彼の継続的な熱意と支援の県町をお礼申し上げます。著者とも認めるしたいブルース ・ ブランバーグ彼のカメラ、リベカ チャーニー、原稿とショーン · マクナマラ、Marcin Wlizla 国立アフリカツメガエルリソース (RRID:SCR_013731) での重要な読書のための使用のための貴重なX. tropicalisの餌と動物の治療法についての会話。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
デュモン#5鉗子ファインサイエンスツール11252-20または11252-30
眉毛ヘアナイフ自家製
ヘアループ自家製
パスツールピペット、ホウケイ酸ガラスフィッシャーサイエンティフィック13-678-20A
クレイジーグルー(シアノアクリレートベース)エルマーズプロダクツ株式会社KG581眉毛とヘアループをパスツールピペットに貼り付けるには、他の同様の接着剤を使用できます。
オリゴデオキシヌクレオチド、カスタムオーダーの統合DNAテクノロジーsgRNAカスタムオーダーテンプレートオリゴ、デザインの詳細については、Nakayama et al., 2014を参照してください。
Megascript T7キットAmbion/ThermoFisherAM1334または、Megashortscript T7 (AM1354) キットを使用
フェノール、トリスバッファー任意の商業サプライヤーからの高品質蒸留フェノール
クロロホルムあらゆる商業サプライヤーからの高品質クロロホルム
エタノールあらゆる商業サプライヤー
からの高品質エタノールジエチルピロカーボネート(DEPC)シグマケミカル(株)D5758-50ML
Cas9タンパク質、核局在シグナルを有するPNA Bio, Inc.CP01メーカーの推奨に従ってDEPC処理水を使用して再構成
10X Marc's Modified Ringers solutionHomemade.1X MMR(EDTAなし)のレシピ(参考文献26)は、100 mM NaCl、2 mM KCl、1 mM MgSO4、2 mM CaCl2、5 mM HEPESです。溶液はpHを7.4に調整します。
アガロー任意の分子生物学グレードのアガロースで十分です
60 X15 mm ペトリプレートファルコン351007
24 ウェルプレートファルコン3047
L-システインシグマ ケミカル Co.C7352-100GHCl 塩プロ
テイナーゼ Kロシュ03 115 828 001
タマジャクシ食品から ~20mg/ml です。成長培地に再懸濁します。.さまざまなオンライン小売業者から購入できます
合成用のス 通常、ロシュ血清ミクロン血清オ

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