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方法論記事

窒素キャビテーションと差動遠心分離培養細胞の周辺膜蛋白質の分布を監視することができます。

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DOI:

10.3791/56037

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2017年8月18日

 , 
1Langone Medical Center, New York University

この記事について

サマリー

超遠心法による窒素のキャビテーションとゾル性細胞質と膜結合蛋白質のそれに続く分離に基づく哺乳類細胞の洗剤無料均質化のためのプロトコルをご紹介します。この方法は可溶性の周辺膜蛋白質の分割監視に最適と膜の一部分。

要約

培養細胞、末梢膜タンパク質を含む蛋白質の細胞内分布の勉強に役立ちます。蛍光遺伝子エンコード タグ付きタンパク質は細胞内蛋白質の分布の研究をもたらしました。ただし、部分的にゾル性細胞質蛋白質場合は特に、蛍光顕微鏡を用いた分布を定量化することは困難です。さらに、内因性のタンパク質を研究することが重要ですよく。生化学的アッセイ immunoblots まま細胞レベル下の分別後のタンパク質分布の定量化のためのゴールド スタンダードのよう。ゾル性細胞質または特定の膜画分を分離することを目指す商業キットはありますが、これらのキットのほとんどは洗剤、膜から抽出された簡単に周辺膜蛋白質を勉強のために不適当かもしれないと抽出に基づいています。ここで超遠心法による窒素キャビテーション ・ ゾル性細胞質と膜結合蛋白質のそれに続く分離による携帯電話用洗剤無料プロトコルを提案します。我々 は、種類の異なる細胞で水溶性の細胞小器官の分離とペレットの分数を確認し、一般的な洗剤ベース力学的均質化手法の中での蛋白質の抽出を比較します。いくつかの利点の窒素のキャビテーション繊細な細胞小器官を最小限の物理的および化学的損傷細胞破壊の優れた効率であります。超遠心法と組み合わせると、窒素のキャビテーションは周辺膜蛋白質の細胞質間のシフトを調べる優れた方法と膜の一部分。

概要

細胞蛋白質は 2 つのクラスに分けることができます: これらの膜に関連付けられています。非膜準蛋白質は、細胞質、核質、小胞体 (ER) などの細胞小器官のルミナで発見されます。膜準蛋白質、整数部と周辺の 2 つのクラスがあります。不可欠な膜タンパク質は、ポリペプチド鎖の 1 つ以上のセグメントが通常は α ヘリックスの疎水性アミノ酸の構成として膜をまたがっているために、膜貫通タンパク質とも呼ばれます。膜貫通タンパク質の生合成の過程で膜に挿入される co-translationally、彼らが異化されてまで、構成されています。周辺膜蛋白質は膜脂質など疎水性分子の翻訳後修飾の結果として通常第二に駆動されます。不可欠な膜タンパク質と対照をなして周辺膜蛋白質の細胞膜との関連付けと戻すことは調整することができます。シグナル伝達経路と膜との規制関連で多くの周辺膜蛋白質機能の有効化または経路を阻害するメカニズムの 1 つであります。周辺膜蛋白質であるシグナリング分子の 1 つの例は、小さな GTPase、RAS です。ファルネシルピロリン酸脂質修飾を含むポスト翻訳の修正のシリーズの後成熟した RAS 蛋白質の修正の C 末端は細胞膜の細胞質のリーフレットに挿入します。具体的には、細胞膜は RAS がその下流エフェクター RAF1 を行っています。マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ (MAPK) 経路の構成的活性化を防ぐためには、複数レベルの RAS の制御は、場所にあります。GTP を GDP へ加水分解によって RAS を非アクティブなレン....

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プロトコル

1 バッファーと機器の準備

  1. 4時 45 mL 細胞破壊爆弾・ 15 mL チューブ ・遠心管を冷やす ° c
    2. 。
  2. 準備と 25 mL の 4 ° C 追加 1 つプロテアーゼ阻害剤のタブレットは使用前に 2 x 10 の 7 セルあたり均質化バッファーを寒さ
    。 注: 通常、均質化バッファーの KCl はより塩化ナトリウムが細胞内の塩類組成を反映ではなくに含まれています。このプロトコルで使用する均質化バッファーは、10 mM HEPES ph 7.4 では、10 mM KCl と 1.5 mM MgCl 2 (低張性均質化バッファーとしてという) で構成されます。ほとんどのバッファーは窒素のキャビテーションのために適応することができます (ディスカッション を参照してください).
  3. の準備で 4 ° C 追加プロテアーゼ阻害剤錠使用前に新鮮なサンプルあたり Phosphate-Buffered 生理食塩水 (PBS) バッファー x 1 の 6 mL を寒さと
    。 注: このプロトコルで使用される PBS バッファー pH 7.4 では、1.8 mM KH 2 PO 4、137 mM NaCl と KCl 2.7 mM で 10 mm Na 2 HPO 4 で構成されています
    4. 。....

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結果

図 2は、可溶性細胞質画分 (S) または膜ペレット画分 (P) に PNS から細胞蛋白質の分割を示します。異なる種類の細胞から 3 つの代表的な細胞を調べた: HEK 293 (細胞上皮)、NIH 3T3 (繊維芽細胞) および Jurkat (リンパ球)。Rho グアニン解離阻害剤 (RhoGDI) と陽イオン依存性マンノース-6-リン酸受容体 (CIMPR) のポジティブ コントロールとして使用されたゾル性細胞質と膜の一部分、それぞれ。窒素キャビテーション後細胞質と膜の効率的な分離を確認した 〜 低張バッファー内の 350 の psi に続いて 1 時間 350,000 × g で遠心。総蛋白が治った S と P の分数は小胞体、エンドソーム、リソソーム、ミトコンドリア、ゴルジ体、他の細胞器官のマーカーと、分析しました。すべての膜貫通タンパク質は膜画分に存在のみ、Na+を含む/K+ ATPase と原形質膜、小胞体、リソソーム膜蛋白質 1 (LAMP1) からカ.......

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ディスカッション

機械的破壊の他の方法に比べて窒素キャビテーションの利点は多様です。おそらく最も重要なメリットは、静かにはまだ効率的に標本を均質化する能力です。生成の局所加熱ダメージの代わりに減圧冷却試料の物理的原理は超音波など摩擦/せん断ベースの技術。キャビテーションも細胞膜を混乱させるに非常に効率的です。窒素の気泡が解凍、キャビテーション プロセス個々 のセル内では制限されているため小さいセル サイズをサンプル サイズや濃度のサンプルします。したがって、通関ベース Dounce 以上針の通路均質化付加的な利点を提供しています。窒素のキャビテーションは、同じ圧力でサンプル全体に一様に適用される同じ破壊力を再現できるより一貫した結果を提供しています。また、各セルのみの 1 つの単一の時間中断プロセスを経験し、細胞レベル下のコンポーネントが変数の破壊的な力を絶えず公開されます、したがって。これは細胞小器官の artefactual 断片化を制限します。中断によって引き起こされる不安定な細胞成分の酸化の心配は軽減されますまた、窒素は細胞懸濁液を飽和させるため、酸素補給の無料です。窒素キャビテーションによって課せられた制限の物理的・化学的ストレスにより、不安定.......

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開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

この作品は、GM055279、CA116034 および CA163489 によって賄われていた。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
細胞破壊容器(45 mL)Parr Instrument4639窒素キャビテーション爆弾
ドンスホモジナイザー(2 mL)Kontes885300-0002乳棒とチューブ
U-100インスリン注射器28G½をBecton Dickinson329461Needle
Atg12 antibodySanta Cruz271688マウス抗体、1:1000希釈で使用
&β;-アクチン抗体Santa Cruz47778マウス抗体、1:1000
で使用&β;-チューブリン抗体DSHBE7-sマウス抗体、1:5000希釈で使用
Calnexin抗体Santa Cruz23954マウス抗体、1:1000希釈で使用
カルレギュリン抗体Santa Cruz373863マウス抗体、1:1000希釈で使用
カタラーゼ抗体Santa Cruz271803マウス抗体、1:1000希釈で使用
CIMPR抗体アブカム124767ウサギ抗体、1:1000希釈で使用
EEA1抗体Santa Cruz137130マウス抗体、1:1000希釈で使用
EGFR抗体Santa Cruz373746マウス抗体、1:1000希釈で使用
F0-ATPase抗体Santa Cruz514419マウス抗体、1:1000希釈で使用
F1-ATPase抗体Santa Cruz55597マウス抗体、1:1000希釈で使用
ブリラリン抗体Santa Cruz374022マウス抗体、1:200 希釈で使用
Golgin 97 抗体Santa Cruz59820マウス抗体、1:1000 希釈で使用
HDAC1 抗体Santa Cruz81598マウス抗体、1:1000希釈で使用
Hexokinase 1 抗体Cell Signaling Technology2024Sウサギ抗体、1:1000希釈で使用
Lamin A/C 抗体Santa Cruz376248マウス抗体、1:1000 希釈で使用
LAMP1 抗体DSHBH4A3-cマウス抗体、1:1000 希釈で使用
Na+/K+ ATPase 抗体Santa Cruz48345マウス抗体、1:1000 希釈で使用
Rab7 抗体アブカム137029ウサギ抗体、1:1000 希釈で使用
Rab9抗体ThermoMA3-067マウス抗体、1:1000希釈で使用
RCAS1抗体Santa Cruz398052マウス抗体、1:1000希釈で使用
RhoGDI抗体Santa Cruz360ウサギ抗体、1:3000希釈で使用
リボソームタンパク質 S6抗体Santa Cruz74459マウス抗体、1:1000希釈で使用
Sec61a抗体サンタクルス12322ヤギ抗体、1:1000希釈で使用
厚肉ポリカーボネート超遠心チューブベックマン・コールター349622超遠心分離用サンプルチューブ
TLK-100.3ローターベックマン・コールター超遠心349481ローター
オプティマMAX 大容量パーソナル超遠心機ベックマン・コールター364300超遠心分離機
cOmpleteプロテアーゼ阻害剤カクテル錠ロシュ11697498001プロテアーゼ阻害剤
25cmハンドルと3.0cmブレード付きセルスクレーパーコーニング353089ラージセルスクレーパー
マグネティックスターバーフィッシャーサイエンティフィック14-513-57SIXマイクロスターバー
セラミックトップマグネティックスターラーフィッシャーサイエンティフィックS504501ASマグネチックスターラー
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参考文献

  1. Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).
  2. Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. Comparison of five commercial extraction kits for subsequen....

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再版と許可

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