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方法論記事

窒素キャビテーションと差動遠心分離培養細胞の周辺膜蛋白質の分布を監視することができます。

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DOI:

10.3791/56037

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2017年8月18日

 , 
1Langone Medical Center, New York University

この記事について

サマリー

超遠心法による窒素のキャビテーションとゾル性細胞質と膜結合蛋白質のそれに続く分離に基づく哺乳類細胞の洗剤無料均質化のためのプロトコルをご紹介します。この方法は可溶性の周辺膜蛋白質の分割監視に最適と膜の一部分。

要約

培養細胞、末梢膜タンパク質を含む蛋白質の細胞内分布の勉強に役立ちます。蛍光遺伝子エンコード タグ付きタンパク質は細胞内蛋白質の分布の研究をもたらしました。ただし、部分的にゾル性細胞質蛋白質場合は特に、蛍光顕微鏡を用いた分布を定量化することは困難です。さらに、内因性のタンパク質を研究することが重要ですよく。生化学的アッセイ immunoblots まま細胞レベル下の分別後のタンパク質分布の定量化のためのゴールド スタンダードのよう。ゾル性細胞質または特定の膜画分を分離することを目指す商業キットはありますが、これらのキットのほとんどは洗剤、膜から抽出された簡単に周辺膜蛋白質を勉強のために不適当かもしれないと抽出に基づいています。ここで超遠心法による窒素キャビテーション ・ ゾル性細胞質と膜結合蛋白質のそれに続く分離による携帯電話用洗剤無料プロトコルを提案します。我々 は、種類の異なる細胞で水溶性の細胞小器官の分離とペレットの分数を確認し、一般的な洗剤ベース力学的均質化手法の中での蛋白質の抽出を比較します。いくつかの利点の窒素のキャビテーション繊細な細胞小器官を最小限の物理的および化学的損傷細胞破壊の優れた効率であります。超遠心法と組み合わせると、窒素のキャビテーションは周辺膜蛋白質の細胞質間のシフトを調べる優れた方法と膜の一部分。

概要

細胞蛋白質は 2 つのクラスに分けることができます: これらの膜に関連付けられています。非膜準蛋白質は、細胞質、核質、小胞体 (ER) などの細胞小器官のルミナで発見されます。膜準蛋白質、整数部と周辺の 2 つのクラスがあります。不可欠な膜タンパク質は、ポリペプチド鎖の 1 つ以上のセグメントが通常は α ヘリックスの疎水性アミノ酸の構成として膜をまたがっているために、膜貫通タンパク質とも呼ばれます。膜貫通タンパク質の生合成の過程で膜に挿入される co-translationally、彼らが異化されてまで、構成されています。周辺膜蛋白質は膜脂質など疎水性分子の翻訳後修飾の結果として通常第二に駆動されます。不可欠な膜タンパク質と対照をなして周辺膜蛋白質の細胞膜との関連付けと戻すことは調整することができます。シグナル伝達経路と膜との規制関連で多くの周辺膜蛋白質機能の有効化または経路を阻害するメカニズムの 1 つであります。周辺膜蛋白質であるシグナリング分子の 1 つの例は、小さな GTPase、RAS です。ファルネシルピロリン酸脂質修飾を含むポスト翻訳の修正のシリーズの後成熟した RAS 蛋白質の修正の C 末端は細胞膜の細胞質のリーフレットに挿入します。具体的には、細胞膜は RAS がその下流エフェクター RAF1 を行っています。マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ (MAPK) 経路の構成的活性化を防ぐためには、複数レベルの RAS の制御は、場所にあります。GTP を GDP へ加水分解によって RAS を非アクティブなレンダリング以外にもアクティブな RA も解放できます膜から修正またはシグナル伝達を阻害する要因を可との相互作用の。膜協会を評価するための重要な必要性が残っているが、蛍光ライブ イメージングは、細胞生物学者蛍光タンパク質タグ周辺膜蛋白質1の細胞内の局在を観察する機会を与える、シンプル生化学的アプローチを半定量的内因性蛋白質。

タンパク質の膜と可溶性画分の間分配の適切な生化学的評価は 2 つの要因に大きく依存する: 細胞の均一化と膜と可溶性画分の効率的な分離。最も広く使用されている商業キットを含むいくつかのプロトコルは、洗剤を用いた均質化に依存して、これらのメソッドは、可溶性のフェーズ2に膜タンパク質を抽出して解析の難読化します。したがって、セル中断の非洗剤ベース、機械的メソッドは、クリーンな結果を提供します。血液や臓器から収穫栽培におけるセルの機械的破壊のいくつかの方法があります。Dounce 均質化、細針の中断、ボール ベアリングの均質化、超音波処理、窒素キャビテーションが含まれます。ここで我々 は窒素のキャビテーションを評価し、他の方法と比較します。窒素のキャビテーションは高圧下での細胞の細胞質に溶解している窒素の依存しています。平衡後、細胞懸濁液は気圧に公開では突然の沸騰の結果としてセルを開いて涙の細胞質窒素気泡が形成されます。圧力が十分に高い場合は、窒素沸騰核3を破壊できる、膜バインド リソソーム4のような細胞小器官。しかし、圧力が十分に低く保たれ、ない他の細胞器官、それにより細胞質とそのまま細胞内小器官の流出 cavitate5を指定されている磨砕液に、小胞体膜で減圧が中断されます。このため、窒素キャビテーションは、リソソーム、ミトコンドリアのような細胞小器官を分離する最適な方法です。

しかし、膜と可溶性画分に簡単に分離することがでく磨砕液を準備するための優れた方法であるも。キャビテーションの中に使用される圧力容器 (「爆弾」と呼ぶ) タンクと調節可能な放電バルブの出口ポートから窒素ガス配信の入口との高圧に耐える厚いステンレス鋼製ケーシングで構成されます。

窒素のキャビテーションは 1960 年代6以来セル均質化のために使用されています。1961 年に、ハンターと Commerfold7は哺乳類の組織破壊のための実行可能な選択肢として窒素キャビテーションを設立しました。以来、研究者は、各種の細胞や組織、成功とするための手法を適応している、窒素キャビテーション膜準備8,9, 核と細胞小器官を含む複数のアプリケーションで定番となっています。準備10、11、および不安定な生化学的抽出。細胞生物学者は現在、窒素の均質化の利点が広く宣伝されていない、窒素爆弾は高価であり、セルの比較的大きい数は誤解があるのでセルの均質化の他の方法を多く採用します。必須。そのまま核無細胞のホモジネートを達成するために窒素のキャビテーションのためのプロトコルは公開されていない、パブリッシュされた最も評価の 20 mL の細胞懸濁液の量が使用されました。小規模なサンプルの使用の現在の要件に合うようにこの古典的な手法を適応し、培養細胞に適した窒素キャビテーションの修正されたプロトコルを提案する.窒素キャビテーション後磨砕液と分かれています可溶性 (S) 膜 (P) の一部分差動遠心分離によって最初低速スピン核と切れ目のないセルを削除するとし、高速スピン (> 100,000 × g) を分離するには可溶性画分から膜。Immunoblots を分離の効率を解析し、他の機械的破壊技術窒素キャビテーションを比較します。また窒素のキャビテーションの間に均質化バッファーの浸透効果を調べた。

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プロトコル

1 バッファーと機器の準備

  1. 4時 45 mL 細胞破壊爆弾・ 15 mL チューブ ・遠心管を冷やす ° c
    2. 。
  2. 準備と 25 mL の 4 ° C 追加 1 つプロテアーゼ阻害剤のタブレットは使用前に 2 x 10 の 7 セルあたり均質化バッファーを寒さ
    。 注: 通常、均質化バッファーの KCl はより塩化ナトリウムが細胞内の塩類組成を反映ではなくに含まれています。このプロトコルで使用する均質化バッファーは、10 mM HEPES ph 7.4 では、10 mM KCl と 1.5 mM MgCl 2 (低張性均質化バッファーとしてという) で構成されます。ほとんどのバッファーは窒素のキャビテーションのために適応することができます (ディスカッション を参照してください).
  3. の準備で 4 ° C 追加プロテアーゼ阻害剤錠使用前に新鮮なサンプルあたり Phosphate-Buffered 生理食塩水 (PBS) バッファー x 1 の 6 mL を寒さと
    。 注: このプロトコルで使用される PBS バッファー pH 7.4 では、1.8 mM KH 2 PO 4、137 mM NaCl と KCl 2.7 mM で 10 mm Na 2 HPO 4 で構成されています
    4. 。
  4. 準備可溶化バッファー使用直前の 4 ° C 追加 1 つのプロテアーゼ阻害剤のタブレットでサンプルごとの 4 つの mL を寒さと
    。 注: このプロトコルで使用される可溶化バッファーは 1 の x Radioimmunoprecipitation 検定法 (RIPA) バッファー pH 7.4 では、150 mM の NaCl、0.1 %sds、デオキシ コール酸ナトリウム 0.5%、1%、25 mM Tris から成っている NP 40。4.6 の注を参照してください
    5. 。

2。セル収穫

型のセルの
    推奨で 10 9 ティッシュ文化セル x 2 x 10 の成長 7-10
  1. 培地。通常、1 つの 15 cm 皿利回り 2 x 10 7 HEK 293 細胞 DMEM で 90% の confluency ( 図 1) にします
    2. 。
  2. 真空によって成長媒体を削除します
    3. 。
  3. 付着性のセルのため氷の上の培養皿を配置、チルド均質化バッファー 2 倍 (10 mL 洗浄あたり 15 cm 皿あたり) で軽く文化皿で直接細胞を洗浄し、適切な量で大細胞スクレーパーとセルを収穫均質化バッファー;浮遊細胞の場合収集しチルド均質化バッファー 2 倍 (10 mL 洗浄あたり 50 mL カルチャごと) 4 ° C、5 分で 500 x g スピンに細胞ペレットを洗って、氷の上の均質化バッファーの適切なボリュームで洗浄細胞ペレットを再懸濁します。
    注: ボリュームは、細胞破壊爆弾で許可される最小/最大ボリュームと同様に、意図されていた実験の蛋白質の集中の要件に基づく必要があります。一般的なガイドラインは 2-10 10 7 セル/mL、x またはセルの約 10 巻ペレットします。このプロトコルは、2 mL の均質化バッファーの HEK 293 の細胞の 3 つの 15 cm 料理に最適です
    4. 。

3。窒素キャビテーション

  1. 波紋上氷浴で清潔でチルド爆弾への転送細胞懸濁液プレートします
    。 注意: 爆弾、高圧、低温、窒素ガス – 適切な個人用保護具 . を着用
  2. 爆弾の中マイクロ電磁攪拌棒を置き、懸濁液の均質性を維持するために攪拌プレートをオンにします
    3. 。
  3. 懸濁液に 1 つのプロテアーゼ阻害剤タブレットを追加し、メーカーごとの爆弾を閉じます ' s 命令
    4. 。
  4. 徐々 に加圧窒素ガスのタンク メーカーごとに爆弾 ' 爆弾圧力計まで s 命令は 300 に 600 psi を読み取ります。すべてのバルブを閉じ窒素タンクを切断しています
    。 注: セルの種類によって必要な圧力が異なります。Jurkat、NIH 3T3 HEK 293 の細胞の 400 に 350 psi でキャビテーションを行ったここ
    5. 。
  5. 窒素に分解し、細胞内で平衡に達するように 20 分待つ
    6. 。
  6. 布タオルを使用して吐出バルブ周りの余分な水を削除します。磨砕液の滴下しリリースを達成し、前冷蔵 15 mL チューブに収集に優しく吐出バルブを開きます
    。 注: コレクションの末尾近くあるホモジネートのスパートとシューという音とともにガスが出てくる。ガスがないことを確認してください以前に収集された原因はチューブから撮影する妨 (それ故に 15 mL の使用チューブ 1.5 mL チューブの代わりに)。スパートを開始すると、吐出バルブを閉じて、減圧爆弾と爆弾の残りのセルのキャビテーションを達成するために突然窒素入口弁を開きます。オープンは爆弾の妨の回復と徹底的に掃除します
    。 注: 上の泡と乳白色の外観は、最終的な cavitate 必要があります。ピペット チップ遠心分離前に沈静化して泡を許可すると優しくかき混ぜる
    。 注: は、均質化の効率を判断する位相差顕微鏡による、cavitate を確認します。15 μ L のドロップを追加、coverslip でカバーして顕微鏡スライドの表面に空洞を作る。20 × 対物で 3.4 3.6 多すぎる場合にのみ切れ目のない細胞が検出手順を繰り返します
    。 注: 均質化バッファーに EDTA またはグリコールエーテルジアミン四酢酸を含まない場合に追加収集した退院後 5 分以内 1 mM の最終的な集中を妨します
    7. 。

4。Cytosolic と膜画分の分離

切れ目のない細胞や核を削除する 4 ° C で 10 分間の
  1. 遠心分離機 500 x cavitate g.
    注: は遠心分離のステップを繰り返して表示されているペレットは生成されませんし、上部に浮かぶ泡を回避しながらポスト核上清 (PNS) を収集します。必要に応じてさらに収集し、PNS を結合するフォームを再遠心分離機 ( 図 1).
  2. は、関心の分数を取得する必要に応じて、PNS を処理します。ゾル性細胞質の分離と膜の一部分を目的として遠心チューブに PNS を転送し、必要に応じて遠心を行います。このプロトコルが最適です、< 3.5 mL サンプル 4 で 1 時間 350,000 × g で遠心、ポリカーボネート製遠心管に ° C
  3. (S 分画) 上清 1 mL ピペットを使用してを収集します
    4. 。
  4. は、それを乱すことがなく慎重に 3 mL の冷 PBS でペレットをすすいでください。真空によって PBS を削除します
    。 注: ゾル性細胞質蛋白質によって膜画分の汚染がサンプルの損失より大きい問題は、ペレット寒さの PBS と 4.2 の手順と再遠心の 3 mL に再懸濁します。真空によって PBS を削除します
    5. 。
  5. は好みの洗剤を含む可溶化バッファーの適切なボリュームでペレットを完全に再懸濁します。セルの等価を達成、内局として可溶化バッファーの同じボリュームを使用します
    。 注: 効率的な膜蛋白質の抽出のための可溶化バッファーとして 1 x RIPA バッファーを使用してお勧めします。下流のアッセイが膜画分の必要ない場合は、最大膜たんぱく質抽出用 1 x laemmli サンプル バッファーを使用します
    。 メモ: 提案は外れ、最大膜蛋白質の抽出のための 4 ° C で管上クリーン チューブ可溶化バッファーにペレットを転送します
    。 注: ペレットが目から効率的に削除する粘り (あまりにも多くの脂質) の場合e 可溶化バッファーの超遠心機チューブ スナップおすすめペレットを液体窒素で凍結、ペレットは分解する前にすぐにミニ金属ヘラで超遠心機チューブからペレットを外れします
    。 注: また、膜ペレットだけ再停止できない膜小胞懸濁液、遠心分離のステップ 4.6 の場合は不要の P 分数を生成する洗剤を含むバッファー中に溶解しました。膜協会に依存する酵素活性などの機能を調査するときその P 端数が役に立つ
    6. 。
  6. 4時 10 分卓上遠心分離機で 20,000 × g ステップ 4.5 から完全に可溶化されたペレット懸濁液を遠心分離機 ° C 上清 1 mL ピペット (P の一部) を使用してを収集し、ペレット (不溶性の脂質) を破棄します
    7. 。
  7. ゾル性細胞質や膜画分を用いてウェスタンブロッティングなど必要なアッセイを実行または将来使用するため-80 ° C で保存します
    8. 。

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結果

図 2は、可溶性細胞質画分 (S) または膜ペレット画分 (P) に PNS から細胞蛋白質の分割を示します。異なる種類の細胞から 3 つの代表的な細胞を調べた: HEK 293 (細胞上皮)、NIH 3T3 (繊維芽細胞) および Jurkat (リンパ球)。Rho グアニン解離阻害剤 (RhoGDI) と陽イオン依存性マンノース-6-リン酸受容体 (CIMPR) のポジティブ コントロールとして使用されたゾル性細胞質と膜の一部分、それぞれ。窒素キャビテーション後細胞質と膜の効率的な分離を確認した 〜 低張バッファー内の 350 の psi に続いて 1 時間 350,000 × g で遠心。総蛋白が治った S と P の分数は小胞体、エンドソーム、リソソーム、ミトコンドリア、ゴルジ体、他の細胞器官のマーカーと、分析しました。すべての膜貫通タンパク質は膜画分に存在のみ、Na+を含む/K+ ATPase と原形質膜、小胞体、リソソーム膜蛋白質 1 (LAMP1) からカ...

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ディスカッション

機械的破壊の他の方法に比べて窒素キャビテーションの利点は多様です。おそらく最も重要なメリットは、静かにはまだ効率的に標本を均質化する能力です。生成の局所加熱ダメージの代わりに減圧冷却試料の物理的原理は超音波など摩擦/せん断ベースの技術。キャビテーションも細胞膜を混乱させるに非常に効率的です。窒素の気泡が解凍、キャビテーション プロセス個々 のセル内では制限されているため小さいセル サイズをサンプル サイズや濃度のサンプルします。したがって、通関ベース Dounce 以上針の通路均質化付加的な利点を提供しています。窒素のキャビテーションは、同じ圧力でサンプル全体に一様に適用される同じ破壊力を再現できるより一貫した結果を提供しています。また、各セルのみの 1 つの単一の時間中断プロセスを経験し、細胞レベル下のコンポーネントが変数の破壊的な力を絶えず公開されます、したがって。これは細胞小器官の artefactual 断片化を制限します。中断によって引き起こされる不安定な細胞成分の酸化の心配は軽減されますまた、窒素は細胞懸濁液を飽和させるため、酸素補給の無料です。窒素キャビテーションによって課せられた制限の物理的・化学的ストレスにより、不安定...

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開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

この作品は、GM055279、CA116034 および CA163489 によって賄われていた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
細胞破壊容器(45 mL)Parr Instrument4639窒素キャビテーション爆弾
ドンスホモジナイザー(2 mL)Kontes885300-0002乳棒とチューブ
U-100インスリン注射器28G½をBecton Dickinson329461Needle
Atg12 antibodySanta Cruz271688マウス抗体、1:1000希釈で使用
&β;-アクチン抗体Santa Cruz47778マウス抗体、1:1000
で使用&β;-チューブリン抗体DSHBE7-sマウス抗体、1:5000希釈で使用
Calnexin抗体Santa Cruz23954マウス抗体、1:1000希釈で使用
カルレギュリン抗体Santa Cruz373863マウス抗体、1:1000希釈で使用
カタラーゼ抗体Santa Cruz271803マウス抗体、1:1000希釈で使用
CIMPR抗体アブカム124767ウサギ抗体、1:1000希釈で使用
EEA1抗体Santa Cruz137130マウス抗体、1:1000希釈で使用
EGFR抗体Santa Cruz373746マウス抗体、1:1000希釈で使用
F0-ATPase抗体Santa Cruz514419マウス抗体、1:1000希釈で使用
F1-ATPase抗体Santa Cruz55597マウス抗体、1:1000希釈で使用
ブリラリン抗体Santa Cruz374022マウス抗体、1:200 希釈で使用
Golgin 97 抗体Santa Cruz59820マウス抗体、1:1000 希釈で使用
HDAC1 抗体Santa Cruz81598マウス抗体、1:1000希釈で使用
Hexokinase 1 抗体Cell Signaling Technology2024Sウサギ抗体、1:1000希釈で使用
Lamin A/C 抗体Santa Cruz376248マウス抗体、1:1000 希釈で使用
LAMP1 抗体DSHBH4A3-cマウス抗体、1:1000 希釈で使用
Na+/K+ ATPase 抗体Santa Cruz48345マウス抗体、1:1000 希釈で使用
Rab7 抗体アブカム137029ウサギ抗体、1:1000 希釈で使用
Rab9抗体ThermoMA3-067マウス抗体、1:1000希釈で使用
RCAS1抗体Santa Cruz398052マウス抗体、1:1000希釈で使用
RhoGDI抗体Santa Cruz360ウサギ抗体、1:3000希釈で使用
リボソームタンパク質 S6抗体Santa Cruz74459マウス抗体、1:1000希釈で使用
Sec61a抗体サンタクルス12322ヤギ抗体、1:1000希釈で使用
厚肉ポリカーボネート超遠心チューブベックマン・コールター349622超遠心分離用サンプルチューブ
TLK-100.3ローターベックマン・コールター超遠心349481ローター
オプティマMAX 大容量パーソナル超遠心機ベックマン・コールター364300超遠心分離機
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25cmハンドルと3.0cmブレード付きセルスクレーパーコーニング353089ラージセルスクレーパー
マグネティックスターバーフィッシャーサイエンティフィック14-513-57SIXマイクロスターバー
セラミックトップマグネティックスターラーフィッシャーサイエンティフィックS504501ASマグネチックスターラー
ダウンス。希釈 フィ

参考文献

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