方法論記事

セミフレキシブル高分子を研究する多目的ツールとして DNA ナノチューブ

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DOI：

10.3791/56056

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2017年10月25日

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1Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Institute of Experimental Physics I, Universität Leipzig

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

セミフレキシブル高分子は、生きているシステムで広く適用されているユニークな力学特性を表示します。ただし、ポリマーの剛性などのプロパティにはアクセスできませんので、生体高分子に関する体系的な研究は制限されます。本稿では、プログラム可能な DNA ナノチューブ、フィラメント剛性の影響に関する実験的研究を有効にすることによってこの制限を回避する方法について説明します。

要約

細胞や生体高分子ネットワークなど、複雑なポリマー ベースのソフト問題の機械的性質は、どちらも古典的なフレームの柔軟なポリマーも棒状ので理解できます。基になるフィラメントは強い熱変動も残ります、失われつつある非バックボーン剛性のため、永続化長さ (lp) 経由で定量化は、差し出されました。自分の有限の曲げ剛性は一意、非自明な集団力学一括ネットワーク、大規模なメッシュ サイズを提供しながら低容積比で安定した足場の形成に します。この原則は (例えばセルかティッシュで)、自然で流行する分子含有量が高いとそれにより拡散の促進または能動輸送を最小限に抑えます。それらの生物学的意義と生体適合性ヒドロゲルの潜在的な技術アプリケーションのためセミフレキシブル高分子は、膨大な研究の対象とされています。しかし、わかりやすい調査残った挑戦以来、彼らは自由に可変であるアクチン フィラメントなどの天然高分子に依存します。これらの制限にもかかわらず、合成、機械的に可変、セミフレキシブル高分子材料の不足のため、アクチン フィラメントが共通のモデル システムとして確立されました。主な制限は、巨視的なバルク構造への影響を研究する中心数量lpを自由にチューニングできないです。この制限は、フィラメントの高剛性制御の変更を有効にする、構造的にプログラム可能な DNA ナノチューブを採用することにより解決しました。彼らは部分的に相補的な鎖の離散セットが離散円周リング構造で交配させるタイル ベース デザインを通して形成されます。これらのリングは粘着末端、フィラメントに効果的な重合、長さ数ミクロンの有効化の機能し、天然生体高分子として同様の重合速度を表示します。彼らのプログラム可能な力学のためこれらの管は、 lp一括スケールと同様、単一分子の影響を研究する汎用性の高い、新しいツールです。アクチン フィラメントと対照をなして顕著な変性がなく、数週間にわたって安定し、の取り扱いは比較的簡単です。

概要

そのユニークな力学的特性により複雑な振る舞い、セミフレキシブル高分子、生活物質の基本的なビルディング ブロックです。柔軟なポリマーとは異なりセミフレキシブル高分子は強い熱変動1対象まま、失われつつある非バックボーン剛性により差し出された構成を採用します。したがって、完全に柔軟なまたは硬質ポリマーの両極端と同様、彼らの行動と純粋な確率モデルを適用できません。いわゆるワームのようなチェーン モデル2,3,4は、フィラメント4に沿って接線-接線相関の崩壊定数であるlp経由でこの剛性を定量化する開発されました。Lpがフィラメントの輪郭の長さ (lc) に匹敵する場合、ポリマーは、セミフレキシブル1と見なされます。テントのポールと同様、ネットワークまたはバンドルの手配珍しい粘弾性特性5,6,7につながる、低ボリュームの分数で集合的なシステム全体を安定化します。 8,9。これらの構造は、高弾力性で大きなメッシュ サイズ10、まだ促進拡散と能動輸送過程時機械的整合性の維持を提供します。このプロパティは特に細胞骨格や細胞外マトリックスなどの生物学的システムに適してが、食品工学1,11,12でも広く使用されています。

生物にその意義にとどまらず、バイオミメティック材料や新規ハイドロゲルを開発するツールを持っているためにこれらの構造体の物性を総合的に診断することが重要です。セミフレキシブル高分子の面で、これはシングル フィラメント プロパティlpと記述の理論的枠組みの開発などから生じるネットワークの集団特性の系統的分析法を意味します。先駆的な研究で細胞の生体高分子アクチン セミフレキシブル高分子のモデル系として設立され、ゴールド スタンダード5,13,14,15をまだ広く考えられています。,16,17します。 ただし、徹底的に研究はこのシステムと限られているこの蛋白質の固有プロパティにバインドされているので。様々 な理論的アプローチ シングル フィラメント レベル以外の些細な力学的挙動の説明を構築することを目指した、線形弾性高原のせん断弾性係数 Gの依存性の特に異なるスケーリング予測につながっています。 0 (すなわちネットワークの「弾力性」)、(c) 濃度とlp6,7,13,14、に関して 15,18,19,20,21,22,23。アクチンを用いた実験や他のモデル システムで容易にアクセスできる濃度のスケールは理論的な予測が厳密にされている間、および検証13,16,24,25日は実験不可能であった、 lpを基準します。これは、主要な制限lpがセミフレキシブル高分子の定義数量は、独立変数でもあるので。

この中央の自然による制約アクチンの固定lpまたは他の生物学的由来高分子コラーゲンなど最近タイル ベース DNA チューブは、その力学的特性の可変が採用することにより解決されています9,26,27,28. (構成の DNA の数が異なるなど、ストランド単位リング内) チューブのアーキテクチャのわずかな変化をもたらすlp、蛍光顕微鏡で評価することができます、異なる値1 つの変動のチューブを分析することによってまたは複数の付着の管の曲面構成を評価することによって、として上記の9,28。これらの解析では、異なる管集団のlp値よりも 1 桁以上異なるし、異なる評価手法が一貫した結果9,28をもたらすことを明らかにしました。

驚いたことに、すべての前の理論的なアプローチと矛盾する報告されている濃度とlpに関して線形弾性高原のせん断弾性係数G0の全体的なスケール9、特に多くを示すlp依存予測よりも強い。これらの調査結果は、セミフレキシブル高分子の中央特性を研究する新しいモデル システムの価値を強調します。Nを採用-螺旋形 DNA チューブは劇的にこれらの調査の範囲を広げます。Lpが自由に変化させることが、基本マテリアルを変更することがなくただ DNA の本質的なプログラム可能な性質は、クロスリンクや速度論的スイッチング プロセスなどの追加要素の体系的な検討を有効にできます。さらに、これらの管は水に溶けるし、適切な pH およびイオンについては、数週間、検出分解9なしで安定したほとんどの蛋白質のとは対照的。

これらのチューブをアセンブルする DNA のオリゴヌクレオチドの離散セットを使用すると、それぞれの 2 つの近隣の鎖に相補的な塩基配列を共有する 2 つのドメインが含まれています (特定のシーケンスにより一本鎖を形成できません髪のピンなどの構造)。相補的な配列がn相互接続の二重螺旋セグメントの囲まれた、半分重なり合うリングを形成、周期的に交配させる (図 1 a とB)。離散直径 (図 1)、および半分重なって構成でこれらのリングのフォームは、別のリングの粘着性の両端に相補的な軸の粘着末端を公開します。オリゴヌクレオチドをマッチングこの選択的添加は糸状の DNA ヘリックス チューブ サイズn (nHT) の効果的な重合につながるリングの積み重ねをトリガーします。自分の輪郭の長さは通常、長さ数ミクロンを測定し、その長さの分布はアクチン フィラメント9,26,27,28に匹敵します。それは確かにに似てアクチン フィラメントと微小管の重合反応を示す同じような DNA ナノチューブ構造体の示されています。p クラス ="xref"> 29。によっては基本的なリング構造を構成する個々 の DNA の繊維の数n nHT アーキテクチャ円周、直径を制御用様々 なことが。リング/チューブの円周が増加より多くの DNA の繊維を使用して、対応するアーキテクチャの変更シフトより高い剛性に対応する高いlp値 (図 1) に機械的性質。メゾスコ ピック スケールのこれらの大きいlp値高い剛性により少ない曲がったコンフォメーションに変換 (図 1 とE)。

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プロトコル

1 です。 n 高温超伝導体の作製

注: ここでは、n は特定のサイズの螺旋管の形成に関与する別の単一 DNA の繊維の数。N = 8、8 つの異なる単一 DNA の繊維を補うユニット リング

。
  1. 購入 DNA シーケンス (HPLC 純度グレード以上) 適切な DNA 合成からサービスや高品質の合成と精製 (表 1 に与えられた模範的なシーケンス) を実行します
    2. 。 会社から対応するマニュアルに書かれた
  2. 凍結乾燥再懸濁しますオリゴヌクレオチド精製水、従ってそれ以上の再懸濁の手順。最終濃度が 200 μ M のために水の量を調整します
    3. 。
  3. 単一 DNA の濃度を決定するストランド ディストリビューターによって与えられた値を確認します (例えば 260 で紫外可視分光法による nm) 正確な化学量論はアセンブリ プロセスの非常に重要ですので。特定のモルの重量と各単一座礁させた DNA のオリゴヌクレオチドの消散係数を考慮して、オリゴヌクレオチドの濃度を計算します
    。 注: 絶滅の係数値は、本質的に異なるシーケンスによって変わるし、市販購入した DNA のマニュアルに記載されています。彼らは、自由に利用できるオンライン ツールの数を使用して、近傍モデルによると計算できます。分光器の線形の範囲を遵守するため濃度定量のための試料を希釈することを検討してください
    4. 。
  4. DNA ストランド各濃度で同じ目的 n HTs を形成する (例えば、 200 μ L の PCR チューブ) のたちに適したコンテナーをミックス、マイクロ ピペットを使用して (最後のバッファー条件: 1xTE (10 mM トリスと 1 ミリメートルの EDTA、pH 8) と12.5 mM MgCl 2).
    注: n HT の最終的な DNA のサンプルから成る n - 1 鎖、U 1 − U n − 1、および 1 つの T n ストランド。サブ マイクロモル以上 10 μ M、ユーザーのニーズに応じて異なります 1 ストランドあたり濃度 (例えば、 < 単一のフィラメントを観察する後続の希釈のための鎖や審査のため高濃度あたり 1 μ m密なネットワークの力学).
  5. 交配 (65 ° c 以降のクイック ドロップで、90 ° C で 10 分間の変性; 遅い温度 65 ° C から 55 ° C、30 分間-0.50 K 20 温度ステップで相補的な基本ペアリングに減少たちの HTs n各;55 ° C から 20 ° C へのクイック ドロップ); 図 2 a を参照してください
    。 注: 65 ° C からの下落が遅いステップは平均チューブ長さを増加する長くことができます。しかし、20 ° C に後続のクイック ドロップは重合管の凝集を避けるために非常に重要です
    6. 。
  6. は検出すること無く 4 ° C で最大 3 週間交配させられた n HTs を格納します
    。 注: 蛍光顕微鏡、n HTs をラベルが (部分的に) 変更された U1 Cy3 の (表 1) の U1 に置き換えることでハイブリッド型します。観測時間が長くなるため確立された反漂白剤の添加はことをお勧めします
    7. 。
  7. は慎重に所望の最終濃度にサンプルを希釈 (ネットワークまたは 20 μ M など 4 シングル フィラメントの観察の nM) 必要に応じてサンプル バッファーを使用して。エラー ソースの可能性を最小限に抑えるために望ましい最終的な集中でサンプルを組み立てるです
    8. 。

2。レオロジーをせん断

動的せん断粘度の
  1. 選択適切なジオメトリ (プレートまたはコーン プレート)。少量 (すなわち、 200 μ L 以下)、コーン プレート形状を使用します
    2. 。
  2. 動的せん断粘度のサンプルを読み込む
    3. 。
  3. サンプルと潜在的な蒸発を防ぐために次の手順を使用して、環境の空気-水界面パッシベーションします。
    1. 2.5 ml サンプル バッファー風呂のサンプルを囲んで
      2. 。
    2. 界面活性剤ミセル濃度のすぐ下に追加します
      3. 。
    3. ハミルトン シリンジを使用して空気サンプルの直接接触を避けるために脂質とサンプルを囲みます
      4. 。
  4. ウェット スポンジ装備のキャップと試料室を密封し、可能であれば、さらに (サンプル) の接触していない追加の水お風呂と蒸発を抑制します
    5. 。
  5. 室温レオメータ固有のソフトウェアを使用して測定を開始; (生理学的な条件が必要な) 場合、または、37 ° C など、それぞれの温度で測定を実行します
    。 注: サンプルを冷却よく伴われる水蒸気の凝縮周囲の空気から暖房が強化された蒸発になります。両方の効果は、サンプルの濃度を変更できます抑え切れずシリーズのすべての測定値が一定した温度で実行されます
    6. 。
  6. は、2 時間室温で平衡にサンプルを許可します。時間進化が時間掃引で監視されるかもしれない (1 つのデータ ポイント 1 分あたり; ひずみ γ = 5%; 周波数 f = 1 Hz).
  7. 目的のテスト プロトコルの機械的性質を測定します。周波数掃引のシリーズを開始 (f-スイープ) サンプルそのままさらに測定を可能にするためです
    。 注: また、短い f-長い測定の前後にスイープを行う必要があります (長い f など-はるかに高い解像度でスイープ) サンプル計測プロトコル中変わらずに残ったことを確認します。
    1. 実行短い f-スイープ (例えば γ = 5%;f = 0.01 Hz から 30 Hz;10 年ごとに 5 つのデータ ポイント).
    2. 実行長い f-スイープ (例えば γ = 5%;f = 0.001 Hz から 30 Hz;21 データごとにポイント 10 年);計測時間を短縮する必要がない場合、低周波領域を省略できます
      3. 。
    3. 短い f を実行-スイープします
      4. 。
    4. Γ-スイープの実行 (例えば、f = 1 Hzγ = 0.0125% から 100%;十年ごとの 20 のデータ ポイント).
      注: を使用して、短い f - まず、掃引として、それは通常前 f と一致しない - ネットワークは通常 γ スイープ中に破裂やプレートから切り離すためにのスイープします。また、γ ランプを使用 (例えば、 = 0.025 s -1、t = 60 s);ただし、ランプは通常変更モーター モード、続いて短い f 必要-スイープ、反証されるだろう
      5. 。
  8. 箱および/または滑らかなガウス カーネルで raw データ
。

3. 蛍光アシストの DNA 解析アニール

  1. 12 の因数を準備 8 μ L 1-4 μ M を使用して各サンプルの DNA 核酸ゲル × 1、TE バッファー x 12.5 mM MgCl 2 で 1 ストランドあたり 10,000 x DMSO から染色在庫があります。陰性対照ではない DNA が核酸ゲル染色があります
    2. 。
  2. リアルタイム PCR プレートに試料を転送、シール粘着フィルム (例えば、 96 ウェル リアクション プレート).
    注: 熱アニーリングのプロトコルで使用される高温サンプルすぐ乾きます。したがって、井戸は、特に長期的な実験の間に水の蒸発と濃度の増加を防ぐために接着フィルムで密閉を確認してください
    3. 。
  3. ガス気泡を除去する部屋の温度で 1 分の 100 x g でプレートを遠心分離機; ガス泡を展開、井戸が解析できません
    4. 。
  4. リアルタイム定量 PCR システムに封印されたプレートを読み込む
    5. 。
  5. は、焼鈍のプログラムを実行します。10 分ドロップすぐ 72 ° c. に温度 90 ° C で DNA を変化させなさい。その後、0.5 ° C 30 分毎でゆっくり温度を下げます。信号が崩壊すると後の加速温度ランプ
    。 注: 72 ° C は十分に本当ハイブリダイゼーション温度;したがって、信号の必要な温度範囲を決定するのに適した広い温度範囲にわたって記録されます
    6. 。
  6. Cycler の蓋が粘着フィルムに蒸着サンプルの結露を防ぐために、少なくとも 100 ° C に加熱することを確認してください
    7. 。
  7. アセンブリ中に 488 のアルゴン イオン レーザーを用いたサンプルをエキサイト nm、550 で蛍光を検出 nm 核酸ゲル染色を使用する場合 (またはスペクトルと同様)。他の染料は、励起/蛍光の適切な組み合わせを選択します。全体を高めることできるだけ多くの蛍光信号を測定信号品質の内蔵カメラを使用しています
    。 注: ここでは、測定したすべての 9 s.
  8. プリセット溶解・熱処理のプログラムを適用すると、提供されたソフトウェアを使用してデータを分析します。そうでない場合を引く蛍光信号の相対的な変化を取得するステップごと温度平均値から以前の平均値
    9. 。

4。AFM イメージング

  1. 雲母を切断 (例えば、 雲母 " V1 ") 市販の粘着テープを添付してそれをリッピング; 雲母の最上位のレイヤーを削除必要があります
    2. 。
  2. 前もって形成された n HT で Mg 2 + たて劈開雲母の折りたたみのバッファーを含むと 10 分解決するようにし、マイクロ ピペットを使用して入金
  3. は、残りの液体を削除する小さなテーブル遠心 2,000 x g で短い 3 の間隔でサンプルをスピンします。いくつか n HTs はまだマイカ表面に添付します
    4. 。
  4. カンチレバー探針を使用し高剛性 (例えば、 54 Nm -1) と内部の原子間力顕微鏡のソフトウェアとその共振周波数を決定します
    5. 。
  5. タッピング モード低スキャン レート (例: 1 行/秒) または n HTs. を変位の損傷を避けるために空気の AFM による高さプロファイルのレコード

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結果

温度ランプ (図 2) を介して DNA ナノチューブ構造体のアセンブリは、これらの人工セミフレキシブル高分子を形成する非常に信頼性の高い方法です。これらのポリマー アクチン フィラメントなど、自然に発生する対に匹敵する特性を持っているが、その機械的性質は生成を制御することができますのでより広範な実験的枠組み変更9,27 を提供.生体高分子のような彼らはネットワーク (図 3) での手配やバルクの構造と性質のフィラメント剛性の影響をテストする 1 つを明示的に許可。図 4に示すように、これらのネットワークがアクチン繊維のネットワークの特性を密接に似ている 10% までは緊張のため線形ひずみ政権表示します。この政権内で線形剪断レオロジー容易に適用できます、たとえば、異なる周波数

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ディスカッション

適切に整形されたネットワークを得るためには、重要なステップは、DNA ナノチューブ構造体の組み立ています。合成処理中のエラーに悪影響をチューブの品質;したがって、高速液体クロマトグラフィーまたはより厳格なプロセスがオリゴヌクレオチドを浄化するために使用することをお勧めします。濃度を再する必要がある集計 DNA ナノチューブとその長さ分布ではなく離散の形成は、セット内のn構成オリゴヌクレオチドのモル比に依存、するので購入した鎖の以来与えられた値が大幅に変わる実際の集中から。実行できます、たとえば、260 の吸収波長紫外可視分光法による nm。別のシーケンス間の分子量と消散係数が異なることに注意したいと思いますしたがって、各 DNA のオリゴヌクレオチドの濃度を吸光度に変換する値を決定する必要があります。機器、NanoDrop などの小さなサンプル ボリュームの最適化を使用して各測定点数回を撮影され平均します。スペクトロメータの検出の線形の範囲を遵守します。必要に応じて濃度を決定するために使用する分数を希釈します。わずかな誤りが正しい化学量論と管形成; の品質に大きな影響を持つことができます。したがって、できるだけ正確で単...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

我々 は、DFG (1116/17-1)、ライプツィヒ学校自然科学"BuildMoNa"(GSC 185) で資金調達を認めます。この作品は、フラウンホーファー誘致プロジェクト 601 683 によってサポートされています。T. h. は、欧州社会基金 (ESF 100077106) からの資金提供を認めています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AFMカンチレバー ACTAAppNano
AFM - NanoWizard 3JPKインスツルメンツ
CCDカメラAndoriXon DV887
DMSOSigma-AldrichD2650
DNAオリゴヌクレオチドBiomers.net配列については、表1
DNA Cy3標識オリゴヌクレオチドBiomers.net配列については、表 1
EDTASigma-AldrichE-9884
Epi-fluorescence micro-scopeLeicaDM-IRB
MgCl2Sigma-AldrichM-8266
Mica "V1", 12 mm roundPlano GmbH50-12
MicroAmp®高速光学式96ウェル反応プレートサーモフィッシャーサイエンティフィック社
マイクロアンプ®光学系粘着フィルムサーモフィッシャーサイエンティフィック(株)
NanoDrop 1000 分光光度計Thermo Fisher Scientific Inc.
100倍対物レンズライカ5506168
精製水Merk Millipore - Milli-Q &Elix
Sapphire PCR tubes,Greiner Bio-One683271
TProfessional, Standard PCR Thermocycler,Core Life Sciences, Inc.070- 標準
7900HT 高速リアルタイム PCR システムApplied Biosystems4351405
RheometerTA InstrumentsARES
SYBR®Green I 核酸ゲル染色剤サーモフィッシャーサイエンティフィック社S7567
トリスシグマ - アルドリッチT4661
トリトン X - 100シグマ - アルドリッチ株式会社X-100空気と水の界面でのサンプルの蒸発を抑制します
を参照してください 43469074306311,

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