2次元培養系を用いた主な大脳皮質細胞のイメージングをライブします。

サマリー

ライブ画像は、リアルタイムで携帯電話の行動を研究するための強力なツールです。ここでは、タイムラプス ビデオ-顕微鏡検査のため主要な大脳皮質細胞の主な神経幹細胞から分化したニューロンとグリア系統進行中に成立段階の詳細な検査を可能にするプロトコルについて述べる。

要約

大脳皮質の開発中には、前駆細胞は新しい前駆細胞または後の神経細胞を生成する対称および非対称細胞分裂のいくつかのラウンドを受けます。その後、いくつかの前駆細胞は、アストロ サイト、オリゴデンドロ サイトの人口への追加幹運命に切り替えます。主要な大脳皮質細胞培養のタイムラプス ビデオ顕微鏡を使用すると、細胞分裂のモードと前駆細胞の細胞周期のパラメーターを制御する細胞・分子メカニズムを研究することが可能です。同様に、セル固有蛍光レポーター蛋白質を使用してまたは後免疫細胞化学をイメージング、後細胞の運命は調べることができます。もっと重要なは、これらすべての機能は、特定のセル型を生成することを約束の前駆細胞の同定を許可する単一細胞レベルで分析できます。また細胞自律的・細胞自律的現象の研究を許可するウイルスを介する遺伝子導入を用いた遺伝子発現の操作を実行できます。最後に、蛍光の融合蛋白質を使用区分と娘細胞運命との対比の中に選択した蛋白質の対称および非対称分布に関する研究。ここでは、数日に及ぶ主要な大脳皮質マウス細胞を画像、細胞分裂、細胞周期の長さと新しく生成された細胞の運命のモードを分析してタイムラプス ビデオ顕微鏡法について述べる.興味のある遺伝子を操作する、または単にレポーター蛋白質と細胞をラベルに適用できる前駆細胞を使って簡単な方法について述べる。

概要

神経幹細胞 (NSC) は、大脳皮質の開発中にニューロンと macroglial 細胞を生成します。初期-内因、NSCs 対称の細胞分裂のいくつかのラウンドを受けるし、前駆プールを展開します。その後、NSCs は中間¹を介して直接または間接的にニューロンを生成する非対称的に分割します。だけで半ば-に後半-内因、前駆細胞のアストロ サイト、オリゴデンドロ サイトの^2,3、4を生成するスイッチします。しかし、ユニークな種類のニューロンや macroglial 細胞の世代に運命制限前駆細胞の寄与と同様、細胞の増殖と分化を制御する完全なメカニズムは、激しい議論^4,5,6の問題を続けます。神経細胞、アストロ サイト、オリゴデンドロ サイトを生成する個々 の皮質 NSCs の可能性は広範囲に研究生体外および生体内で無数の技術を使用して、されている: 単一細胞培養^{7,8,9,10、11,12,13}; イメージング ライブライブ イメージングの高密度文化文化^3,14,15;ライブ イメージング スライス文化^16,17,18;ウイルス媒介性遺伝的ラベリング処理による高密度培養^{14,15,19,20,21}; のクローン解析クローン解析体内レトロ ウイルス^{22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33}; を使用してそして体内のクローン解析トランスジェニック動物の³⁴を使用しています。

これらのテクニックは、長所と短所がそれぞれ。たとえば、トレースする血統体内一括と分割エラー³、個々 の大脳皮質前駆細胞の潜在性について矛盾する結論に至る。また、両方in vitroとin vivoの研究が早い時点で前駆細胞の分類に基づいて、³⁵系統進行中に細胞死の検出されない発生による細胞系譜の事後分析を受けます。したがって、単一 NSCs の可能性の分析に適したシステムは生成されると、すべての細胞の同定だけでなく、系統内での細胞運命の適切な特性を考慮しなければなりません。一次電池文化とライブ イメージングの組み合わせでは、この設定を提供します。単一細胞培養とタイムラプス ビデオ顕微鏡を用いた、寺らは gliogenesis¹¹神経新生から個々 の大脳皮質前駆細胞の血統のスイッチを示しています。後で、彼らはニューロンの異なったタイプが¹²の単一の大脳皮質前駆細胞から生成されることを示す同じシステムを使用しました。しかし、このシステムには重要な注意事項: 初期内因で分離された大脳皮質前駆細胞の 1% は 4 つ以上の子孫⁹のクローンを生成するだけです。FGF2 の付加の後で 4 つ以上のセルを生成する細胞の頻度は 8-10⁹に増加します。それにもかかわらず、この数はこの段階で、ほとんどすべての大脳皮質前駆細胞が増殖を考慮した小さすぎます。また、³⁶運命仕様に FGF2 の潜在的な影響は否定できません。(Pax6 を発現) 心室の両方の増殖をサポートする高密度細胞培養を用いてこれらの制限を回避するために、脳室下帯 (Tbr2 表現) 大脳皮質前駆細胞¹⁵。また、これらの文化のリアルタイム観察は NSC 系統進行のいくつかの機能、^3、15細胞分裂、細胞周期の延長、ニューロンとグリアなどを生成する単一細胞の潜在性のモードなど、これらの条件下で再現を示しています。最近では、我々 も CREB シグナルがマウス³⁷で未熟な大脳皮質ニューロンの細胞の生存に影響を与えることをこのシステムを使用しています。したがって、プライマリ マウス大脳皮質のタイムラプス ビデオ顕微鏡を考えて高密度成長のセルは細胞周期の進行のメカニズムを解明、細胞分裂、細胞生存率、細胞運命の指定のモードを研究する強力かつアクセス可能なツール。後者ができますリアルタイム^38,39,40の特定細胞運命の識別またはポスト各種^3,38,41,42をイメージングの使用許可、トランスジェニック動物を使用しています。

ここでは、NSCs の増殖とニューロンと macroglial 細胞の次の世代を支える主要な大脳皮質細胞培養を準備する手順を追ってプロトコルを提供します。識別およびコマ撮りビデオ顕微鏡を用いた単一細胞レベルで追跡することができます個々 の細胞の遺伝子を操作する遺伝子をレトロ ウイルス媒介の使用についても述べる。齧歯類、内因の端に最初から主要な大脳皮質細胞の研究にこのプロトコルを使用することができますが、ステージ¹⁴によるといくつかの調整が必要があります。二次元文化のタイムラプス ビデオ顕微鏡を用いた、NSCs 他のソースから分離を検討ことができますが、適切な培養システムは細胞挙動の in vitroとin vivo^38,43を比較することによって決定する必要があります。

プロトコル

この議定書に記載されている生きた動物を含むすべての実験は、国内および国際法に従って行われ、地元の大学動物管理および使用委員会(CEUA / UFRN)によってライセンス009/2014の下で承認されました。以下のプロトコールは、無菌環境で行われます。基本的な細胞培養に精通していることが望ましいです。

1. 背外側終脳マイクロダイセクション

1. 解剖培地(100 mL)を準備します:98.5 mLハンクス平衡塩溶液(HBSS)、0.5 mL 5 M HEPES pH 7.4、1 mLペニシリン/ストレプトマイシン(10,000ユニット/ mLおよび10,000 μg / mL)。
2. 解剖媒体をフィルター滅菌します。
3. イソフルランによる麻酔下で、妊娠中のマウスC57/Bl6(Mus musculus)から胚14日目(E14)の胚を取り出します
   注:E0は膣栓検出の日と考えてください。解剖は、妊娠中のマウスから取り外してから1時間以内に完了する必要があります。.このプロトコルは、胚E11-E17にも適用されます。
4. 無菌条件下で子宮摘出術により胚を摘出します。
5. 胚を冷解剖培地(4°C)を入れたシャーレに移します。
6. 縦方向の亀裂に沿って切断することにより、頭蓋骨から脳を取り出します。胚の数は通常5から10までさまざまです。各E14脳は、前駆細胞および有糸分裂後ニューロンを含む約2×10⁶個の細胞を産生する(1:1の比率)
   注意: 次の手順では、実体顕微鏡を使用してください。
7. 解剖鉗子を使用して髄膜を取り除きます。中央で終脳を分割して、半球を分離します。背外側終脳を分離するには、解剖鉗子を使用して背内側曲線と陰璃体-陰璃下境界に沿って切断します。背外側終脳を冷解剖培地(4°C)を入れた2mLチューブに移し、すべての脳が解剖されるまで待ちます。

2. 細胞の解離とめっき

1. 増殖培地(50 mLのDMEM + 10%FCS)を準備します:44 mLのダルベッコ修飾イーグルス培地(DMEM)、5 mLの子牛胎児血清(FCS)、0.5 mL 40%グルコース、0.5 mLペニシリン/ストレプトマイシン(10,000ユニット/ mLおよび10,000 μg / mL)。.増殖培地をフィルター滅菌します。
2. 分化培地(DMEM+2% B27 50 mL):DMEM 48 mL、B27 1 mL、40% グルコース 0.5 mL、ペニシリン/ストレプトマイシン 0.5 mL (10,000 units/mL および 10,000 μg/mL) を調製します。分化培地をフィルター滅菌します。
3. E14マウスから背外側終脳を顕微解剖した後、採取した組織と冷解剖培地(4°Cで5分間、340 x g)でチューブを遠心分離し、組織を沈殿させます。
4. ピペットで上清を取り除き、予熱した(37°C)トリプシン-EDTA(0.05%)1 mLを加えて化学消化します。37°Cで15分間インキュベートし、2 mLの増殖培地を加えてトリプシン活性を停止させます。
5. ガラス製のパスツールピペットの先端をガスバーナーまたはブンゼンバーナーで数秒間研磨して、絞りを少し狭めます。FCSを吸引してピペットを洗浄し、チップをコーティングします。気泡を避け、ファイヤーポリッシュおよびFCSコーティングされたパスツールピペットで細胞を機械的に解離します。
6. 細胞を遠心分離します(4°Cで5分間、340 x g)。ピペットで上清を取り除きます。1 mLの増殖培地を加え、ピペットを使用して細胞を再懸濁します。この手順を一度繰り返します。
7. 0.4% Trypan Blue溶液を使用して、細胞懸濁液を1:1に希釈して調製します。生存不能な細胞は青色になります。Neubauerチャンバーを使用して生細胞(未染色)の数をカウントします。
8. 細胞を増殖培地で希釈して、10⁶細胞/mLを得ます。24ウェル組織培養プレートの各ウェルに500μLの細胞懸濁液を加えます(約2.5 × 10⁵細胞/cm²)。細胞を37°Cおよび5%CO₂.
   でインキュベートします 注:ガラスカバースリップは、実験中に移動して観察フィールドを変更する可能性があるため、使用しないでください。あるいは、ガラス底組織培養プレートを使用してください.
   注:細胞培養処理されたマルチディッシュを使用していない場合は、プレートをPoly-D-Lysin(50 μg/ml)で2時間37°Cで前処理することが重要です。

3. レトロウイルスを介したトランスフェクション

注:これは、前駆細胞のみをトランスフェクションする簡単な方法です。ただし、他のウイルスベクターまたは化学的/電気的トランスフェクションを使用して、培養細胞に目的の遺伝子を挿入できます。

1. 遺伝子発現を操作し、蛍光レポータータンパク質で細胞を標識するには、細胞プレーティングの2時間後に目的の遺伝子を持つプラスミドを運ぶレトロウイルスを追加します><。 注:レトロウイルスベクターは、分裂する細胞のゲノムにのみ組み込まれます。そのため、増殖率が高いときに細胞に感染させることが重要です
   注:Β-actin/CMV融合配列(CAG)と内部リボソームエントリーサイト(IRES)を含むプラスミドを使用し、その後に緑色蛍光タンパク質(GFP)のコード配列をpCAG-IRES-GFP^44と命名しました。目的の遺伝子は、CAGプロモーターとIRES配列^{37の間でクローニングできます}。
2. レトロウイルスを分化培地で希釈して、mLあたり必要な数の粒子を得ます。レトロウイルスを含む分化培地500μLを各ウェルに加えます
   注:使用されるレトロウイルスの量は、その力価に依存し、ウェルあたり50〜100個の感染細胞を得るために計算する必要があります。この力価により、単離されたGFP発現クローンの同定が可能になり、その関係は位相コントラスト画像を追跡することでさらに確認することができます(セクション6を参照)。レトロウイルスの滴定は、同じ細胞集団を使用して実行する必要があります⁴⁵。

4. タイムラプスビデオ顕微鏡

注:このステップには、インキュベーションチャンバー付きの倒立蛍光顕微鏡が必要です(材料の表を参照)。

1. レトロウイルス感染後、組織培養プレートを温度コントローラーと_CO2コントローラーに接続されたインキュベーターに入れます
   注:イメージングを開始する前にチャンバーを3時間予熱すると、取得中のドリフトと焦点ぼけを最小限に抑えるのに役立ちます.
   注:チャンバーは、細胞を37°Cおよび5%CO₂の一定の条件に維持する必要があります。
2. ゼロ点(XY = 0)として機能するXY軸の位置を選択します。これにより、将来、例えばイメージング後の免疫細胞化学(セクション5を参照)の後など、参照先が再び位置を見つけることができるようになる
   注意: ゼロ点を決定するための基準として使用できる記号をプレートに描くことをお勧めします。
3. 10倍の倍率で撮影する位置を選択します.
   注:レトロウイルストランスフェクション細胞を観察する可能性を高めるために、ウェルごとに10〜15の位置を選択してください
   注意: 長距離の高倍率対物レンズ(20倍または40倍)を使用して、より高解像度の画像を取得できます。対物レンズの作動距離によっては、ガラス底板が必要になる場合があります。
4. 5分ごとに位相差画像を取得し、3時間ごとに蛍光画像を取得して、光毒性を減らします。実験の最初の3時間では、温度が平衡化している間に焦点が変化する可能性があるため、焦点を確認して調整します。毎日ピントを合わせてチェック
   注:最初の24時間後に焦点が安定することがわかります。ただし、フォーカスを監視することをお勧めします。または、ソフトウェアベースのオートフォーカスシステムを使用してください。
5. 7 日後、取得を中止し、イメージング後の免疫細胞化学に進みます(セクション 5 を参照)。
6. 免疫細胞化学の後、顕微鏡インキュベーターのプレートを交換し、ゼロ点を見つけ、XYZ = 0をリセットして、保存した位置で実験を再ロードします。適切な蛍光フィルターを使用して、各位置の蛍光画像を取得します。

5. イメージング後の免疫細胞化学

1. 培養に7日間浸した後、細胞培養物を4%パラホルムアルデヒド(PFA)固定液で室温で15分間固定します
   注意: PFAは有毒であるため、化学薬品のドラフトで取り扱ってください。
2. 0.5 mL PBS 0.1 Mで5分間すすぎ、3回繰り返します。
3. 一次抗体を4°Cで一晩インキュベートし、0.5%トリトンおよび10%の正常ヤギ血清含有PBS 0.1 M.
   注:抗微小管関連タンパク質2(MAP2)抗体を使用してニューロンの表現型を確認し(マウスIgG1、1:1,000)、抗GFPを使用して形質導入細胞を標識します(ニワトリ抗体、1:500)。他の抗体は、前駆細胞またはグリア細胞を検出するために使用できます。
4. 0.5 mL PBS 0.1 Mで5分間すすぎ、3回繰り返します。
5. 二次抗体を0.5%トリトンおよび10%の正常ヤギ血清でPBS 0.1 Mで希釈し、室温で2時間インキュベートします。推奨希釈:1:1,000。
6. 0.5 mL PBS 0.1 Mで5分間すすぎ、3回繰り返します。
7. 核染色では、0.1 μg/mL 4′6′-ジアミノ-2-フェニルリンドン(DAPI)含有PBS 0.1 Mで細胞を5分間インキュベートします。
8. 0.5 mL PBS 0.1 Mで5分間すすぎ、3回繰り返します。
9. 細胞をPBS 0.1 Mに保ち、光から保護します(プレートをホイルで包むなど)。

6. セルトラッキング

注:ここでは、Table of Materialsのリンクから入手できるソフトウェアThe Tracking Tool(tTt)を使用して、タイムラプスビデオ顕微鏡データを分析するための主な手順を簡単に説明します。

注:画像取得を他のソフトウェアで実行する場合は、tTtインストーラーで利用可能なtTtコンバーターを使用して画像データをインポートしてください(資料の表に記載されているリンク)。png、tif、jpgの画像形式のみ受け付けています。tTt コンバータを起動した後、図 1 A - B に示されている手順に従ってください。

1. ソフトウェアtTtを起動し、ユーザー名を選択します。「ユーザーの追加」と「続行」ボタンをクリックします (図 2A) をクリックします。「TTTWorkFolder」(図 2B)を参照して選択します。系統、ツリー、統計、エクスポートされた画像は、このフォルダに保存されます。次に、解析する実験を選択してロードします (図 2B)。
2. 画像が以前にtTt Converterによって変換された場合は、「LogFileConverter」(図3A)をクリックし、LogFileConverterウィンドウで2つの連続する時間点間の秒数を指定します。「Convert log files for whole experiment」をクリックします (図 1C)。
3. tTtウィンドウに表示される画像のリストで、手動でロードするか、プログラムに表示されているオプションを使用して、目的の画像を選択します。イメージをロードします (図 3)。
4. [ファイル] > [開く] > [新しいコロニー] を選択します。「トラッキング」をクリックし、続いて「トラッキングを開始」をクリックして、選択した位置でトラッキングを開始します。
5. ムービー・ウィンドウが表示されます (図 4)。トラッキングサークルを使用してセルを選択し、キー0を押します。ソフトウェアは次のフレームに進みます。マウスを使用して追跡されたセルの周囲に追跡円を配置し続け、各フレームで 0 をクリックしてセルに追跡マークを追加します。
6. キー 1 と 3 を使用して、それぞれ前または次のフレームに移動します。トラックマークを削除するには、マークする正しい位置をクリックして0を押すだけです。
7. セルが分割されている場合は、ボタン「division」を選択します (図 4) の赤い長方形)。Shift+D を押して、1 つの娘セルの追跡を続けます。2 番目の子セルを追跡するには、セル エディターで選択し、F2 キーを押します。
8. ビデオ顕微鏡検査中に細胞が死滅した場合は、「アポトーシス」(図4)の青い長方形)を選択します。
   注:ソフトウェアはイベントを「アポトーシス」とラベル付けしますが、他のメカニズムが細胞死の原因である可能性があります。
9. 細胞が観察視野を離れたり、隣接する細胞と混ざり合って追跡が妨げられたりする場合は、「lost」を選択してください (図 4 にある緑色の長方形)。
10. トラッキングを停止して後で続行するには、「interrupt」(図 4 にある紫色の長方形)をクリックします。
    注:セルエディタウィンドウでは、トラッキング中にツリーが生成されます。系統ツリーを保存するには、[ファイル] > [現在のツリー>保存] を選択します (セル エディター ウィンドウで)。
11. 別のセルのトラッキングを開始するには、マウスの右ボタンでセルをクリックするか、マウスの左ボタンでセルを選択して「トラッキング」>「トラッキング開始」をクリックします。
12. トラッキングデータを使用してムービーをエクスポートするには、ソフトウェアを「トラッキングモード」にしないでください。トラッキングモードをオフにするには、手順6.10を実行します。ムービーウィンドウで、「ムービー>エクスポート」を選択します。形式、フレームの範囲、1秒あたりのフレーム数、ビットレートを設定します。「エクスポートを開始」をクリックします。

7. 定量化

注:ビデオ顕微鏡データを使用していくつかの測定を行うことができます⁴⁶。ここでは、後の「代表的な結果」セクションで例示される 3 つの可能性について説明します。

1. 各細胞系統の細胞生存率を定量化するには、異なる時点で生存している細胞の数を、個々のクローン内でこれらの時点に達する前に生成された細胞の総数で割ること³⁷。
2. 対称的な前駆細胞(SP、両方の娘細胞が増殖し続ける)、非対称(A、一方の娘細胞が増殖し続け、もう一方の娘細胞が有糸分裂後になる)、または対称末端(ST、両方の娘細胞が有糸分裂後になる)^{15,38の割合を定量化}します。
3. 増殖する細胞の生成から分裂までの期間を計算して、細胞周期の長さを測定します¹⁵。

結果

胚E14から単離された大脳皮質細胞の初代培養物には、前駆細胞とニューロン細胞の両方が含まれています。イメージングの期間中、前駆細胞は細胞分裂を数回繰り返し、細胞の数を増やします(図5およびビデオ図1)。

少数の前駆細胞のレトロウイルス媒介トランスフェクションは、細胞クローンの同定を容易にします（図6)。GFP発現は24時間後に検出可能であることに注意してください。この時点で、位相差画像からGFP発現細胞を同定し、それらをさかのぼって系統を完成させることができます。ここに含まれるGFP画像は、次の理由で良好なコントラストを持っていません:1)内因性GFP発現がレトロウイルス形質導入の数日後に観察された;2)画像は、24ウェルプレートのプラスチック底部を通る10倍の長距離対物レンズを使用して撮影されました...

ディスカッション

主要な大脳皮質細胞のリアルタイム観察では、細胞増殖の解析、細胞分裂、細胞周期、細胞分化、細胞生存^3,14,15,37のモードをことができます。もっと重大に、それは NSCs からニューロン³への進行の間に制定された中間相の同定につながる単一細胞系統の研究を許可します。最後に、この文化システムと遺伝子発現を操作するバイオ エンジニア リング ツールの組み合わせは、選択したターゲット⁵の細胞の自律的効果を研究する強力な手法です。ここで説明する方法は、他ソース^38,42から分離された NSCs と同様に大脳皮質前駆細胞で発達段階別¹⁴

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen Life Technologies	14175129
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-25G
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140122
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM)	Gibco	12400-024
子牛胎児血清 (FCS)	Gibco	10437028
グルコース	Gibco	A2494001
B27	Gibco	17504044
トリプシン-EDTA (0.05%)	Gibco	25300054
パラホルムアルデヒド	Sigma	16005
ヤギ血清	Sigma-Aldrich	69023
Triton X-100	VWR International Ltd.	306324N
イソフルラン	シグマ	792632
抗 MAP2、マウス	Sigma	M4403
抗 GFP チキン	Aves	0511FP12
DAPI	Sigma	D9542
ヤギ 抗マウス アレクサ 594	Invitrogen	A11005
ヤギ 抗チキン アレクサ 488	Invitrogen	A11039
ImageJ	NIH
tTt	ETH チューリッヒ
細胞観察顕微鏡	ツァイス
パスツールピペット
PBS
トラッキングツール(tTt)ソフトウェア		https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html	ダウンロードリンク