ここでは、シアノバクテリア細胞のグリコーゲン含有量を測定するための信頼性の高い簡単なアッセイを提示します。この手順は、沈殿、選択可能な解重合、およびグルコース残渣の検出を必要とする。この方法は、野生型および遺伝子操作された株の両方に適しており、シアノバクテリアの代謝工学を促進することができる。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
シアノバクテリアは、光合成の間に主要な細胞内炭素およびエネルギー貯蔵としてグリコーゲンを蓄積する。最近の研究の進展により、生合成と異化のディールサイクル、レドックス調節、非コードRNAの関与を含む、グリコーゲン代謝の複雑なメカニズムが明らかになった。同時に、産物収量を増強するために、遺伝子操作されたシアノバクテリア中のグリコーゲンから望ましい産物に炭素をリダイレクトする努力がなされている。さまざまな精度と技術的な複雑さを伴い、シアノバクテリアのグリコーゲン含量を決定するためにいくつかの方法が使用されています。ここでは、標準的なライフサイエンス研究室で行うことができるシアノバクテリアのグリコーゲン含量の信頼できる測定のための詳細なプロトコールを提供します。プロトコールは、細胞溶解物からのグリコーゲンの選択的沈殿およびグリコーゲンの酵素的解重合によってグルコース単量体を生成し、これはグルコースオキシidase-peroxidase（GOD-POD）酵素結合アッセイを用いて測定した。この方法は、 Synechocystis sp。 PCC 6803およびSynechococcus sp。代謝工学で広く使用されている2つのモデルのシアノバクテリア種、PCC 7002。さらに、該方法は、野生型と調節エレメントまたはグリコーゲン生合成遺伝子に欠損を有する変異体との間のグリコーゲン含量の差異を首尾よく示した。
概要
シアノバクテリアは、光合成により光に固定されたCO 2から炭素の主要な炭水化物貯蔵物としてグリコーゲンを蓄積する。グリコーゲンは、α-1,6-結合グルコシル結合によってつくられる分枝を有する線状α-1,4-結合グルカンからなるグリカンである。シアノバクテリアにおけるグリコーゲン生合成は、ホスホグルコムターゼおよびADP-グルコースピロホスホリラーゼの連続作用によるグルコース-6-リン酸のADP-グルコースへの変換から始まる。 ADP-グルコース中のグルコース部分は、1種以上のグリコーゲンシンターゼ（GlgA）によってグリコーゲンのα-1,4-グルカン主鎖の非還元末端に転移される。続いて、分枝酵素はα-1,6-結合グルコシル結合を導入し、これはさらに伸長してグリコーゲン粒子を生成する。暗所では、グリコーゲンは、グリコーゲンホスホリラーゼ、グリコーゲン脱分岐酵素、α-グルカノトランスフェラーゼ、およびマルトデキストリンホスホリラーゼによってリン酸化されたグルコースおよび遊離グルコースに分解される。これらのフィードintO酸化的ペントースリン酸経路、エムデン-マイヤーホフ-パルナス経路（解糖）、およびエントナー・ドゥドロフ経路1、2、3、4を含む異化経路、。 <....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
1.準備
- シアノバクテリア培養
- 成長するSynechocystis sp。 1％（v / v）CO 2を補充した一定量の空気を供給しながら、液体BG11培地8中、30℃でPCC 6803。 50μmol光子/ m 2 / sの光合成光子束密度で光で連続的に培養物を照明する。
- 成長するSynechococcus sp。 1％（v / v）CO 2を補充した空気を一定にして、液体A +培地23 （BG11培地も使用することができる）中のPCC7002。温度は37℃でなければなりません。 150μmol光子/ m 2 / sの光合成光子束密度で光を用いて連続的に培養物を照明する。
- 1cmの光路を有するキュベットを用いて730nmで培養物の光学密度（OD）を測定する。 OD値が0.8より大きい場合、適切な希釈を行い、OD測定値を得る。e細胞濃度。
注記：以下に示すプロトコールは、OD 730nm値2以上に対応する細胞密度を有する液体培養に適している。指数関数的増殖期の培養物（典型的にはOD 730nm値が1未満である）が望ましい場合、OD 730nm....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
10mLの野生型シネコシスティス種。 PCC 6803を、OD 730nm値が約0.8に達するまで、光合成独立栄養条件下で増殖させた。細胞を回収し、pH8の50mM Tris-HClに再懸濁した.OD 730nm値を2-3に調整した。グリコーゲン含量は、上記のプロトコルに従って分析した。 OD 730nmあたりのグリコーゲン含量は、13± 1.8μg / mL / OD 730nm （ N = 12）であった。タンパク質含量のグリコーゲン含量相対0.24±0.03μgの/μgの（N = 12）、およびクロロフィルのグリコーゲン含量相対含有量は5.7±0.6μgの/μgの（N = 12）でした。利用可能な材料の量が少ないため、細胞乾燥重量の測定は省略された。同等の条件下で培養シアノバクテリアにおけるタンパク質含量は細胞乾燥重量の25 <の約.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
プロトコル内の重要なステップは、グリコーゲン沈殿および再懸濁である。エタノール沈殿後の遠心分離後、グリコーゲンは、微量遠心管の壁に緩く付着する半透明ペレットを形成する。したがって、上清を除去する際には、ペレットを除去しないように注意する必要があります。グリコーゲンペレットは粘着性があり、乾燥すると可溶化が困難になります。グリコーゲンペレットの完全な可溶化は重要である。なぜなら、不完全な可溶化は効率の悪い酵素消化を招き、したがって技術的複製間に大きな変動を生じさせるからである。ボルテックスによる可溶化前の超音波処理の適用は、プロセスを容易にすることができる。
正規化法の選択に関して、細胞乾燥重量は広く用いられている参考文献である。これは、タンパク質およびクロロフィルの測定よりも面倒であり、細胞バイオマスを多く必要とするa 。総タンパク質含量は、細胞バイオマスに対する別の言及を提供し、本プロトコールに記載されているように、小規模で決定することができる。正確な値は、成長条件25、28
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者は何も開示することはない。
謝辞
著者らは、デンマークのInnovationfonden Denmark（Pant Power、プロジェクト番号12-131844）、Villum Fonden（プロジェクト番号13363）のNordic Energy Research（AquaFEED、プロジェクト番号24）
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| QSonica Sonicators Q700 | Qsonica, LLC | NA | QSonica |
| SpectraMax 190 マイクロプレートリーダー | モレキュラーデバイス | NA | エリザ プレートリーダー |
| ブレットブレンダー ストー | ネクストアドバンス | BBY24M-CE | ビーズビーター |
| ウルトロスペック 3100 プロ UV/可視分光光度計 | アマシャムバイオサイエンス | NA | 分光光度計 |
| トリス | Sigma-Aldrich | T1503 | バッファー |
| HCl | Merck | 1-00317 | pH adjutment |
| 酢酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | 32319 | バッファー |
| アミログリコシダーゼ (Rhizopus sp.) | Megazyme | E-AMGPU | グリコーゲン解重合酵素 |
| &α;-アミラーゼ、耐熱性 (Bacillus licheniformis) | Sigma-Aldrich | A3176 | グリコーゲン解重合酵素 |
| D-Glucose | Merch | 8337 | グルコースアッセイ用スタンダード |
| Pierce BCA Protein assay kit | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 23225 | タンパク質濃度の測定用 |
| アルミニウム乾燥トレイ、使い捨て | VWR | 611-1362 | 細胞乾燥重量の測定用 |
| D-グルコースアッセイキット(GODPODフォーマット) | メガザイム | K-GLUC | グルコース濃度の測定用 |
| 酸化ジルコニウムパン、0.15 mm | ネクストアドバンス | ZrOB015 | 細胞溶解用ビーズBullet Blendar Storm |
| RINOチューブ | Next Advance | NA | チューブ Bullet Blendar Stormでの細胞溶解用 |
参考文献
- Chen, X., et al. The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).
- Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose. Metab Eng. 4 (3)....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
