出芽酵母におけるタンパク質ベース継承の高速スクリーニング

Summary

このプロトコルでは、出芽酵母でタンパク質に基づく継承のため画面の機能的に高スループット方法論について説明します。

Abstract

将来の世代にアクセス可能な生物学的情報のエンコードは、DNA シーケンスの変更を介して達成される一般に。(シーケンスではなく) 蛋白質立体構造でエンコードされた長寿命の継承は、パラダイム シフトしますが、珍しいとして表示されている長い。などのエピジェネティックな要素の最高の特徴の例は、プリオンは、新しい表現型の遺伝的症状をドライブすることができます自己組織化挙動を所有しています。多くの典型的なプリオンは印象的な豊富な N/Q シーケンス バイアスを表示し、アミロイドの折りにアセンブルします。これらの珍しい特徴は、新しいプリオン蛋白質を識別するほとんどのスクリーニングの努力を知らせています。ただし、(創設のプリオン、PrP^Scを含む)、少なくとも 3 つの知られているプリオンは、これらの生化学的な特徴を港ないです。したがってプローブ質量作用のプロパティに基づいて蛋白質ベースの継承の範囲に代替法を開発した: プリオン蛋白質の一時的な過剰発現する彼らは自己テンプレート構造を取得頻度が増加します。本稿では、蛋白質ベースの継承を引き出す酵母 ORFeome の能力を分析するためのメソッドについて説明します。この戦略を使用して、我々 は以前ことを発見した > イースト蛋白質の 1% は長寿命、安定した遺伝の突然変異よりも頻繁に起こったされ生物学的形質の出現を燃料でした。全体 ORFeomes 全体または特定の遺伝子ネットワークまたは環境刺激の標的スクリーニング パラダイムとして、高スループットでこの方法を採用できます。同様に前方遺伝的画面多数発達とシグナル伝達経路を定義する、これらの技術は生物学的過程での蛋白質ベースの継承の影響を調査するための方法論を提供します。

Introduction

生物学的システムはよくタンパク質豊富で過渡変動を経験します。これらは有機体のまたは将来の世代の表現型を形作る上で永続的な影響をあるかどうかは不明します。この生物の最も有名なインスタンスを含むタンパク質、プリオンは、ゲノム修正なしの遺伝性の特性の出現をドライブの珍しいクラス。代わりに、これらのプロの teinaceous とのfectious 粒子タンパク質構造^1,2の自己永続的変更による表現型を送信します。この型を継承は、壊滅的な神経変性疾患の異常な継承のパターンの原因として発見されました。しかし、菌類から哺乳類^{3,4,5,6,7,8,9,10}まで及ぶ有機体の研究は以来プリオンのような要素が適応値を与えることができること明らかに。それにもかかわらず、プリオンは、魅惑的で珍しい生物風変わりなしかしとして表示されています。

この相場の知恵は、継承の蛋白質ベースの特性は長い例の小さなセットによって制限されているので一部で開催されます。最近の組織的スクリーニングの努力は大幅燃料プリオンのような構造変換する能力を持ついくつかの新しいbona fideプリオン¹¹およびほぼ 2 つのダース蛋白質ドメイン¹²を識別することによってこの画像を拡大しています。ただし、これらのアプローチは、一般的に強力なアミノ酸シーケンス バイアスを当てている、ので、発見されているプリオンは創立酵母プリオン [PSI⁺]^13,14、[URE3]¹⁵[RNQ⁺]^11,16の生化学的性質を共有します。これらが含まれます: 1) モジュラー ドメイン アスパラギン (N) とグルタミン (Q)、2)、アミロイド [プリオン⁺] 構造^17,18,に¹⁹アセンブリの長い高分子の伸張に富んでいる、3) 完了 disaggregase 母から娘^13,20,21に忠実な伝播のための Hsp104 関数に依存します。確かに、多くbona fideプリオンを含む [ガー⁺] [ヘット s]、元プリオン (PrP^Sc) にも、このような厳しい条件下では見逃されること。おそらくもっと重要なは、彼らことはできません蛋白質ベースの継承²²の任意の新規メカニズムをキャプチャします。したがって、このような現象の真の生物学的幅は、はるか以前の仮定より自然で一般的な可能性があります。

この問題を調べるためには、高スループット、プロテオーム的戦略が採用されました。PrP^Sc[ガー⁺] を含む全てのプリオンの特徴 [ヘット-s] は、原因タンパク質の一過性発現が強くプリオン買収^{15,23,24,25,26}の率を増加することとします。一過性個々 のタンパク質の発現を誘導することによって安定した蛋白質ベース、エピジェネティック状態を開始できる場合、体系的に全体にわたって酵母の ORFeome、お願い、この機能の利用をしました。その蛋白の過剰発現は、表現型²⁷を変更できますをよく知られています。しかし、彼らの一時的な過剰世代初期の過剰発現後の数百の遺伝性は表現型の変化を生成するため、プリオン蛋白質は通常ありません。以前、ホリールード ゲノム²⁸を変えないで表現型の風景を再配線することができる蛋白質の多数を識別するために、タンパク質ベース遺伝的要素の異常な継承のパターンだけでなく、この機能を利用しました。いくつかの特定蛋白質以前として知られていたプリオン、ほとんどなかった、タンパク質ベースの継承の新たな形態を明らかにするこのアプローチの力を強調します。

Protocol

1. 初期過剰表現

1. 以前にYPD液(酵母抽出物10 g、ペプトン20 g、1 Lあたり20 gのグルコース)で以前に増殖させた酵母細胞(この場合はBY4741 MAT一倍体)を、FLEXGene ORFeomeライブラリ(URA3-mark centromeric plusid骨格のガラクトース誘導性プロモーターの制御下にある酵母ORF)の目的の候補コンストラクトで形質転換します。 pBY011²⁹) です。
2. オートクレーブ処理したつまようじを使用して、これらの変換から4つの別々のコロニーを選び、生物学的複製として機能します。96ウェルプレートに150 μLのSRaffinose-URA(0.74 gのCSM-URA、6.7 gのアミノ酸を含まない酵母窒素塩基、および1 Lあたり20 gのラフィノース)で48〜72時間成長させます。全プレートのA1井戸に第1のORFからのコロニーを接種し、全プレートのA2に第2のORFからのコロニーなどを接種するなど<br /> 注:すべての成長ステップは、特に明記されていない限り、30°Cおよび大気レベルのCO₂(407.05 ppm)で実施されます。
3. 培養物が飽和している(各ウェルの底に目視で見える細胞)ことを確認し、リキッドハンドリングロボットを使用して、各96ウェルプレートウェルから1:4アレイの1μLを、45μLのSGal-URA(0.74gのCSM-URA、0.74gのCSM-URA、 アミノ酸を含まない酵母窒素塩基6.7g、および1Lあたり20gのガラクトース/ウェル
   注:これにより、各ORFの4つの生物学的複製が正方形のパターンで配列された複合プレートが作成されます。
4. 同時に、ウェルごとに目的のストレッサー(例:20 mMの塩化マンガン)を含む45 μLのSGal-URAを含む個別の384ウェルプレートを準備します。ステップ1.3.
   と同じ方法でこのプレートに接種します 注:表現型検出のダイナミックレンジを最大にするためには、特定のストレッサーのLD50濃度を中心とする2倍希釈系列が推奨されます。これは、成長の促進と減少の両方を観察するための最適な濃度を決定するために事前に行うことができます。
5. 最終的なパラレルコントロールとして、3 つ目の 384 ウェルプレートに同じ方法で接種し、プラスミド発現を誘導しない同じストレッサーを培地に含ませます。プレートにウェルあたり45 μLのSD-URA(0.74 gのCSM-URA、6.7 gのアミノ酸を含まない酵母窒素塩基、および1 Lあたり20 gのグルコース)が含まれていることを確認し、ステップ1.3および1.4と同様に接種します。
6. 細胞入りプレートをマイクロプレートスタッカーに直ちに置き、72時間の連続ループのプロトコルを設定し、スタッカーを装備したマイクロプレートリーダーでOD₆₀₀を室温および大気中のCO₂(407.05 ppm)で測定します
   注:増殖測定の頻度は、実行で使用されたプレートの数(最終的には、研究者が調査したい遺伝子と条件の数によって決定される)によって異なります。使用するプレートが多いほど、プレートリーダーがループを完了するのにかかる時間が長くなり、測定間の時間が長くなります(プレートあたりの測定時間は、使用する機器によって異なりますが、~45秒です)。
7. 増殖測定後、同じリキッドハンドリングロボットを使用して、SGal-URA誘導培養物(すなわち、タンパク質過剰発現を経験した培養物)のウェルあたり1μLを、ウェルあたり45μLのSD-URAを含む新しい384ウェルプレート(プラスミドのタンパク質発現を許さない培地)に移します。
   1. 並行して、ストレッサーの存在下でSD-URAで増殖させた培養物(すなわち、ステップ1.5のもの)から、ウェルあたり45μLのSD-URAを含む384ウェルプレートの2番目のセットの類似接種を行います。
   2. プレートを30°Cで48時間成長させ、加湿チャンバー(つまり、湿ったペーパータオルが入った密閉可能なプラスチックビン)で飽和させます。
8. 前のステップのプレートを取り出し、45 μL の SD-URA を含む 384 ウェルプレートに 1 ウェルあたり 1 μL を再接種します。次に、同じソースプレートから1ウェルあたり1μLを、ストレッサーを使用して45μLのSD-URAを含む別の384ウェルプレートに個別に再接種します
   注:これにより、タンパク質の過剰発現が停止した後も、ストレッサーに対する感度/耐性表現型が持続するかどうかが決まります。
9. すぐに細胞入りプレートをマイクロプレートスタッカーに置き、室温および大気中のCO₂(407.05 ppm)でマイクロプレートリーダーを使用してOD₆₀₀を測定する48時間連続ループのプロトコルを設定します。
10. プレートリーダーソフトウェアを使用して、時間対OD₆₀₀の測定値をXYテーブルとしてエクスポートします。各生物学的レプリケートの OD₆₀₀ の列をグループ化し、平均を計算します。時間対外径₆₀₀ の XY プロットを作成して、成長曲線を生成します。
    1. 過去に過剰発現を受けた培養物(すなわち、SD-URAで再接種する前にガラクトース含有培地で最初に誘導された培養物)と、そうでない培養物(すなわち、グルコースで増殖した培養物)の成長率を、前述したように比較します³⁰。
11. 特定のストレッサーに応答して有意な増殖差を示す培養物の場合、祖先タンパク質の過剰発現に依存して、各生物学的複製から1 μLを取り出し、10 mLの水で希釈した後、5-FOA(0.74 gのCSM-URA、1 gの5-FOA、50 mgのウラシル、50 mg)を含むプレートに50 μLをプレートします。 アミノ酸を含まない6.7 gの酵母窒素塩基、20 gのグルコース、および20 gの寒天/リットル)。30°Cで3日間成長させます。
    1. これにより、プレートあたりのコロニーが多すぎたり少なすぎたりする場合は、それに応じて希釈係数を調整します。
       注:5-FOAは、ウラシル生合成経路によって毒性中間体に変換されます。これにより、最初のステップで形質転換されたURA3でマークされた発現プラスミドが失われます。
12. オートクレーブ爪楊枝で8〜32個の単一コロニーをピックし、150 μLのSD-CSMを含む96ウェルプレートに固定します。30°Cの加湿チャンバーで48〜72時間飽和まで増殖させ、これらの培養物を使用して、ステップ1.11のストレッサーの有無にかかわらず、150μLのSD-CSMを含む2つの新しい96ウェルプレートセットを接種します。
13. プレートをマイクロプレートスタッカーに置き、48時間の連続ループでOD₆₀₀を測定するためのプロトコルを設定します。
14. ステップ 1.10 と同様にデータを分析し、ステップ 1.10 で見られた有意な増殖差がプラスミド損失後も維持されることを確認します.
    注:これらの細胞は、タンパク質ベースの遺伝を示す可能性のある安定した表現型の状態を保持しています。
15. 誘導された表現型を維持した細胞を、タンパク質ベースの遺伝の古典的な特徴について試験します(下記参照)。

2. プリオン様継承のテスト

1. シャペロンによる「キュアリング」
   1. Hsp104シャペロン依存をテストします。
      1. 3 mM GdnHClを含むYPDプレート(10 gの酵母抽出物、20 gのペプトン、20 gのグルコース、および20 gの寒天/1 L)上の単一のコロニーに安定した表現型状態を持つ酵母株のコロニーを選択し、30°Cで3日間増殖します。並行して、ナイーブ株のコロニーをYPD+ 3 mM GdnHCl上の単一のコロニーに同様にストリークアウトします。
      2. 3 mM GdnHClを含む新しいYPDプレートでさらに2回繰り返します。
      3. GdnHClへの曝露は小柄な細胞が出現する頻度を増加させる可能性があるため、GdnHClで3つの継代を受けた複数のコロニーを選び、7日後にYP-グリセロールプレート(酵母抽出物10 g、ペプトン20 g、グリセロール20 mL、1 Lあたり20 gの寒天)で目に見えるコロニーに成長する能力を調べることにより、機能的なミトコンドリア呼吸を確認します。
      4. YP-グリセロールプレートから複数のコロニーを選択し、ストレッサーの存在下での成長を使用して、ストレッサーの存在下での成長を非「硬化」およびナイーブ(すなわち、BY4741 MAT一倍体のような表現型状態を持たない同質遺伝子細胞)と比較して、安定した表現型状態の維持をテストしますステップ1.13で説明したのと同様の方法で制御します。
   2. Hsp70 シャペロン依存性をテストします。
      1. プラスミドを介して「硬化」します。
         1. ナイーブ細胞と安定した表現型状態を持つ細胞の両方を、強力な構成プロモーター(GPD)からHsp70(K69M)^{25,31)の優勢な負の対立遺伝子を発現するURA3マークプラスミドで形質転換}します。
         2. それぞれに単一の形質転換体を選択し、SD-URAプレート上の単一のコロニー(0.74 gのCSM-URA、6.7 gのアミノ酸を含まない酵母窒素塩基、20 gのグルコース、および1 Lあたり20 gの寒天)にストリークし、30°Cおよび大気中の_CO2で3日間増殖します。
         3. この継代をSD-URAプレートでさらに2回繰り返します。
         4. プラスミドを排除するために、5-FOAプレート上の単一のコロニーに複数のコロニーとストリークを選択します。
         5. 各単離物に対して複数の単一コロニーを選択し、ステップ1.13で説明したのと同様の方法で、安定した表現型状態の保持(または喪失)をテストします。
      2. 遺伝的交配による「治療」。
         1. BY4741 MATは、安定した表現型状態を持つ一倍体株と、4つの酵母Hsp70パラログ(ssa1Δ ssa2Δ)のうちの2つに遺伝的欠失を持つ逆の交配型(この場合はBY4742 MATα)のナイーブ株です。
            注:この株はHsp70シャペロン機能が欠損しています。
         2. SD-LYS-MET(0.74 gのCSM-LYS-MET、6.7 gのアミノ酸を含まない酵母窒素塩基、20 gのグルコース、および1 Lあたり20 gの寒天)ダブルドロップアウト培地で単一のコロニーにストリークすることにより、二倍体の増殖に選択します。
         3. 単一の二倍体コロニーを選択し、8 mLの胞子形成前培地(0.8%酵母抽出物、0.3%ペプトン、10%デキストロース、および100 mg/L硫酸アデニン)で30°Cで24時間増殖します。
         4. 培養物を3,000 xgで3分間スピンダウンし、胞子形成前(pre-SPO)培地を吸引し、ペレットを滅菌水で1回洗浄します。
         5. ペレットを2 mLの胞子形成培地(1%酢酸カリウム、0.1%酵母抽出物、0.05%グルコース、および0.01%アミノ酸添加物)に再懸濁します(ヒスチジン2 g、ロイシン10 g、リジン2 g、およびウラシル2 g))。25°Cで5日間成長させます。
         6. 培養物を30°Cに動かし、さらに48時間インキュベー
         トします。
         7. 光学顕微鏡を使用してテトラッドの存在を探すことにより、胞子形成の効率を評価します³²。
         8. 40 μL の培養液を 1.5 mL チューブ内で 3,000 xg で 1 分間スピンダウンし、等量のザイモリアーゼ酵素ミックス (1 M ソルビトール、0.1 M EDTA、10 mg/mL ザイモリアーゼ 100T) に再懸濁
         します
         9. 25°Cで5分間インキュベートします。
         10. 10 μLの消化した培養物を非常に乾燥した、非常に水平なYPD寒天プレートに適用し、培養物がプレートに直線的にゆっくりと広がるのを待ちます。
         11. プレートを層流フードで少なくとも30分間乾燥させます。
         12. 解剖顕微鏡を使用して、胞子を四肢に分離し、プレート上に配列します。
         13. 個々の一倍体胞子をコロニーに成長させ、SD-HIS-LEU(0.67 gのCSM-HIS-LEU、6.7 gのアミノ酸を含まない酵母窒素塩基、20 gのグルコース、および1Lあたり20 gの寒天)プレートで成長する能力をテストします。これは、両方の遺伝的欠失(ssa1Δ ssa2Δ)を抱いていることを示しています。
         14. ステップ1.13.
             で説明したのと同様の方法で、Hsp70欠損バックグラウンドの表現型状態の維持についてそれぞれをテストします 注:これらの胞子を交配して、Hsp70機能が回復した野生型株に戻しても、プリオン表現型は回復しないはずです。
2. 非メンデル遺伝のテスト。
   1. BY4741 MATは、安定した表現型状態を持つ一倍体株であり、アイソジェニックナイーブコントロールは、反対の交配タイプのアイソジェニックナイーブ株(この場合はBY4742 MATα)と交差します。
   2. SD-LYS-METダブルドロップアウト培地上の単一コロニーにストリークすることにより、二倍体の成長に選択します。
   3. 単一の二倍体コロニーを選択し、8 mLの胞子形成前培地中で30°Cで24時間増殖します。
   4. 上記のように、手順 2.2.2.3 から 2.2.2.12 を繰り返します。
   5. 個々の一倍体胞子がコロニーに成長するのを許し、ステップ1.13.
      のように、成長アッセイを使用して減数分裂による表現型状態の維持についてそれぞれをテストします 注:プリオンのもう一つの特徴は、元のカジュアルタンパク質の除去によってプリオンを遺伝的に排除できることです。したがって、同様に、プリオン株と元の誘導タンパク質の遺伝的欠失を持つ株を交配すると、欠失を継承する胞子のプリオン表現型が無効化されます。また、そのような突然変異体では、プリオンが「不可解」な状態に維持される可能性があるのは、欠失した遺伝子がプリオン表現型を発現するために必要であるが、プリオン自体を増殖させる必要がない場合であることにも留意されたい。これら2つの可能性を区別するには、胞子をナイーブな野生型株にさかのぼり、遺伝子の機能が回復した二倍体の遺伝的背景でプリオン表現型が再出現するかどうかをテストします。
3. サイトダクション。
   1. 初期 BY4742 レシピエント株を生成します。
      1. 形質転換を通じて、交配中に核融合を防ぐ欠陥のあるKAR対立遺伝子(kar1-15)を導入します²³。
      2. この株を「プチ」(すなわち、ミトコンドリア呼吸に無能)にするために、YPDブロスの単一コロニーに0.25%エチジウムブロマイドを接種します。
      3. 30°Cで後期指数/定常相(OD₆₀₀~1)まで培養物を増殖させます。
      4. 新鮮なYPDで0.25%エチジウムブロマイドで1:1,000希釈し、2回繰り返します。
      5. 培養物が後期指数関数的/早期固定相(OD₆₀₀ 0.8-1.2)に達したら、滅菌水で1:10,000を希釈し、YPDプレートに50μLをめっきすることにより、単一のコロニーにプレート化します。30°Cで3日間増殖させた後、複数のコロニーを選び、7日後にYP-グリセロールプレート上で目に見えるコロニーに成長する能力を調べることにより、それぞれに呼吸不能がないかテストします。
   2. BY4742への初期サイトダクションを行います。
      1. YPD寒天プレートの表面に、安定した表現型状態を有するドナーBY4741株の細胞とナイーブBY4742 kar1-15レシピエント株の細胞を混合します。
      2. 30°Cおよび大気中の_CO2(407.05ppm)で24時間増殖し、グリセロール(SGly-MET:1Lあたり0.74gのCSM-MET、6.7gのアミノ酸を含まない酵母窒素塩基、20mLのグリセロール、および20gの寒天)を含むメチオニンドロップアウト培地に移します
         注:これは、細胞質交換による機能的なミトコンドリアの回復を可能にするとともに、両方のBY4742核マーカーを選択します。
      3. 3〜5日後、複数の単一コロニーを選択し、SD-METで別の選択ラウンドを実行します(0.74 gのCSM-MET、6.7 gのアミノ酸を含まない酵母窒素ベース、20 gのグルコース、および1 Lあたり20 gの寒天)。
      4. 並行して、SD-LYS-MET 培地で継代することにより、コロニーが二倍体ではないことを確認します。
   3. 逆サイトダクションを行います。
      1. 新しいドナー株(今回は成功したBY4742 kar1-15細胞誘導体)を、YPD寒天培地でプチナイーブBY4741細胞(上記のように生成)と混合します。
      2. リジンを欠くグリセロール培地(SGly-LYS:1 Lあたり0.74 gのCSM-LYS、6.7 gのアミノ酸を含まない酵母窒素塩基、20 mLのグリセロール、および20 gの寒天)上のBY4741レシピエント核マーカーを選択する場合を除き、前述のようにサイトダクションを繰り返します(ステップ2.3.2.1-2.3.2.4)。
      3. 複数の細胞誘導体を選択し、ステップ1.13の前と同様に、成長アッセイを使用して安定した表現型状態の維持をテストします。
4. タンパク質の形質転換。
   1. ライセートを準備します。
      1. YPDで安定した表現型状態を有する細胞を50 mL、30°Cで18時間増殖させます。
      2. 培養物を3,000 x gで4分間ペレット状にした後、オートクレーブ処理したH₂Oで1回、次に1 Mソルビトールで2回洗浄します。
      3. 200 mLのSCEバッファー(1 Mソルビトール、10 mM EDTA、10 mM DTT、10 mM クエン酸ナトリウム、および50 mLあたり1つのミニEDTAフリープロテアーゼ阻害剤錠剤、pH 5.8)に細胞を再懸濁し、50 U/mLの酵母溶解酵素100Tを加えます。
      4. 混合物を35°Cで30分間インキュベートします。
      5. 氷上で20 kHz、20%の強度で、音波除去器を用いて細胞を10秒間超音波処理します。
      6. 細胞破片を10,000 x gで4°Cで15分間遠心分離して除去します。
      7. 上清をきれいなチューブに移し、RNase Iとビオチン化DNaseを3倍過剰(活性単位によって決定)で添加し、37°Cで1時間インキュベー
      トします。
      8. 過剰なストレプトアビジン-アガロースビーズを添加し、5分間インキュベートし、10,000 x gで1.5分間遠心分離してペレット化することにより、DNase Iを除去します。
      9. 上清を新しいチューブに移します。
   2. レシピエントのスフェロプラストを準備します。
      1. 5 mLのナイーブレシピエント細胞をYPDで中指数期(OD₆₀₀、0.5-1の範囲)で増殖させます。
      2. 遠心分離(3,000 x gで4分間)で回収し、4回洗浄します:H₂Oで2回、1 Mソルビトールで2回。
      3. 200 U/mL酵母溶解酵素を含む1 Mソルビトールに細胞を再懸濁し、35°Cで15分間インキュベートして細胞壁を消化します。
      4. 得られたスフェロプラストを600 x gで5分間穏やかに遠心分離して回収し、1 mLの1 Mソルビトールで洗浄し、次に1 mLのSTCバッファー(1 Mソルビトール、10 mM Tris pH 7.5、および10 mM CaCl₂)で再度洗浄します。
      5. 洗浄したスフェロプラストを50 μLのSTCバッファーに再懸濁します
         注:はさみを使用して、ピペットの先端の最後の~0.7cmを切り取ります。これにより、口が広くなり、スフェロプラストの溶解が防止されます。
   3. ナイーブ細胞をタンパク質で形質転換します。
      1. 50 μL のスフェロプラストアリコートを 50 μL のドナー溶解物、20 μL のサケ精子 DNA (2 mg/mL)、および 5 μL の URA3 マーク選択プラスミド (pAG426-GFP など) ^{28,33 で形質転換}します。
      2. ミックスを25°Cで30分間インキュベートします。
      3. 600 x gで5分間遠心分離してスフェロプラストを回収し、150 μLのSOSバッファー(1 Mソルビトール、7 mM CaCl₂、0.25%酵母抽出物、および0.5%ペプトン)に再懸濁します。
      4. 30°Cで30分間回復します。
      5. SD-URAプレートに培養全体をプレート化します。
      6. 0.8% 寒天を含む温かい (~45 °C) SD-URA でめっき培養物をすばやく重ねます.
         注:これにより、スフェロプラストの破裂を防ぐことができます
      7. 形質転換プレートを30°Cで2〜3日間インキュベー
      トします。
      8. つまようじを使用して、重ね合わせたプレートから細胞をうまく成長させ、SD-URAプレート上の単一のコロニーに再ストリークします。
      9. それぞれに数十のコロニーを選び、5-FOAプレートに縞模様を付けてURA3マーク付きキャリアプラスミドを排除します。
      10. 5-FOAプレート上で成長するコロニーを選択し、成長アッセイを使用して安定した表現型状態の移行をテストします(ステップ1.13)。

Results

タンパク質の過剰発現は、細胞の表現型を劇的に変化させることが知られています²⁷.実際、最初のスクリーニングアプローチでは、酵母ORFeomeのクローンの過剰発現から、わずか10個のストレッサーを使用して、何百もの新しい表現型が再現可能に回復されました。しかし、上記のアッセイにより、この過剰発現後に細胞が長期的に安定した表現型を保持しているかどうかを評価することができます。Psp1は、複製機構(例えば、pol alpha^{34)の変異体を抑制できる未知の機能を持つタンパク質}である。PSP1 ORFの過剰発現は、さまざまなストレッサーで細胞表現型を調節しました。驚くべきことに、1つの表現型(塩化マンガンに対する耐性)は、過剰発現が停止した後も細胞内で何百世代も維持されました(つまり、Psp1誘導を直接経験したことがないが、祖先が経験した子孫)(図1A

Discussion

最初の酵母プリオンは、彼らの異常な表現型と継承の複雑なパターンによって識別されました。これらのプリオンの特性は、アルゴリズムと計算ツール追加プリオン蛋白質のため画面を構築するそれから使用されました。ここで説明する方法は対照的は実験的一時的な過剰発現タンパク質の立体構造の状態でエンコードされた永続的な変更は安定を作成するに依存しています。ただし、任意の特定の蛋白質の過剰発現によるプリオン アセンブリを「シーディング」の効率が非常に低い場合、そのタンパク質はこのタイプの過剰発現画面で偽陰性として出現継続的に。この問題を解決する 1 つこのような変更は、将来的に蛋白の過剰発現に 2 ミクロン プラスミドを使用する実験でしょう。最後に、各誘導のプリオンは成長の表現型の独自のセットがすべての条件で明白な試金しません。したがって、さまざまな条件と用量テストの数は、ヒット数を制限します。

重要なは、すべての種類のタンパク質に基づく継承同様に回復されますこのメソッドを使用しています。タンパク質を効率的に毒性の有無で過剰に発現することはできません明らかに継続的に逃されます。"Mnemons、"などの...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
グアニジン塩酸塩	Sigma	Cat#G3272-25G	化学
塩化マンガン	Sigma	Cat#M8054-100G	化学
エチジウムブロマイド	ΣE1510	化学
5-フルオロロ酸	Σ	Cat#F5013-50MG	化学
BY4741 MATa (his3Δ1 leu2&デルタ;0 LYS2 met15Δ0 ura3Δ0)	Winston et al., 1995;Brachmann et al., 1998	N/A	酵母株
BY4741 MATα(彼の3Δ1 leu2&デルタ;0 lys2&デルタ;0 MET15 ura3Δ0)	Winston et al., 1995;Brachmann et al., 1998	N/A	酵母株
Hsp70 (K69M)	Jarosz et al., 2014b	N/A	Plasmid
FLEXGene library	Hu et al., 2007	N/A	Plasmid library
Dextrose (glucose)	Fisher Scientific	D16-3	メディアコンポーネント
Raffinose	Sigma	R0250-25G	メディアコンポーネント
Galactose	Fisher Scientific	BP656-500	メディアコンポーネント
CSM	Sunriseサイエンス	1001-100	メディアコンポーネント
CSM-URA	サンライズサイエンス	1004-100	メディアコンポーネント
CSM-LYS	サンライズサイエンス	1032-100	メディアコンポーネント
CSM-MET	サンライズサイエンス	1019-100	メディアコンポーネント
CSM-LYS-MET	サンライズサイエンス	1035-100	メディアコンポーネント
酵母エキス	フィッシャー科学的な	BP1422-2	培地成分
ペプトン	研究製品 国際	P20240-5000	培地成分
バクトペプトン	BD	211677	培地成分
グリセロール	EMD ミリポア	GX0185-2	培地成分
酵母 窒素塩基 w/o アミノ酸	BD	291920	培地成分
寒天	IBI Scientific	IB49172	メディアコンポーネント
硫酸アデニン	Σ	A3159-25G	メディアコンポーネント
酢酸カリウム	Σ	P1190-500G	メディアコンポーネント
ウラシル	シグマ	U0750-100G	メディアコンポーネント
ヒスチジン	シグマ	H8000-100G	メディアコンポーネント
ロイシン	シグマ	L8000-25G	メディアコンポーネント
リジン	シグマ	L5501-25G	メディアコンポーネント
RNase I	サーモフィッシャーサイエンティフィック	EN0601	酵素
ビオチン化DNase	サーモフィッシャーサイエンティフィック	AM1906	酵素
ザイモリアーゼ100T(酵母溶解酵素)	サンライズサイエンス	N0766555	酵素
マイクロプレートリーダー	BioTek	Synergy H1	機器
マイクロプレートスタッカー	BioTek	BioStack3	機器
プレートフィラー	BiotTek	EL406	Equipment
リキッドハンドリングロボット	Beckman Coulter	Biomek FX	Equipment