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方法論記事

シュワンの移植細胞のギャップを渡って軸索の再生を促進するために切断のラット脊髄切り株をブリッジする PVDF ・ セッション導管内

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⸱

DOI:

10.3791/56077

⸱

2017年11月3日

 ,  ,  , 
1The Miami Project to Cure Paralysis, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Materials Science and Engineering, New Jersey Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering, New Jersey Institute of Technology, 4Department of Cell Biology, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Neurological Surgery, University of Miami Miller School of Medicine

この記事について

サマリー

この資料では、完全断裂後脊髄切り株とシュワン細胞 (SCs) と橋し、のギャップの間で軸索の再生を促進するために注射の基底膜マトリックス塗りつぶしの中空管を挿入する方法について説明します。

要約

ラットの脊髄の傷害の様々 なモデルの間で、人間の脊髄損傷の最も一般的な型なので挫傷モデルを使用、頻繁。完全断裂モデルが挫傷モデルとして臨床的にない関連は、軸索の再生を評価する最も厳格な方法です。挫傷モデル残りの組織のポスト傷害の存在のために発芽や倹約の軸索から再生を区別することは困難です。完全断裂モデルのブリッジ メソッドは、ギャップを埋めるし、治療の効果を評価するために、吻側から尾側の切り株に継続性を作成する必要です。信頼性の高いブリッジ手術は、手術による変動を減らすことによって結果の措置をテストに不可欠です。ここで説明されているプロトコルを使用するシュワン細胞 (SCs) と移植、胸椎レベル 8 (T8) 脊髄の完全断裂前管、導管を挿入、コンジットに SCs を移植します。このアプローチはまたその場のホスト組織と吻側と尾側のインタ フェース間で改良された軸索の伸長ができる SC 移植と注射の基底膜マトリックスのゲル化を使用します。

概要

脊髄損傷修復、複雑で困難な問題、たとえばを含む組合せ治療戦略を必要とする細胞と移植細胞の機能および軸索の有利な微小環境を提供する生体材料の使用傷害のサイトで再生します。ヘミセクション1,2,3,4,5,6,7,8,9と完全断裂10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22モデルは生体材料ベースのブリッジ治療の効果を評価するために使用頻繁。ヘミセクション モデルを使用しての利点は、完全断裂と比較してブリッジ構築のためより安定性を提供することです。ただし、ヘミセクションのモデルで免れる組織の存在のため適用される治療法の結果として軸索の再生を証明することは困難です。完全断裂モデルは、軸索の再生を実証する最も厳格な方法です。

注射ジェルとして使用する様々 な天然および合成材料を研究されている、前もって形成されたゲル ヘミセクションに挫傷、ヘミセクション モデルまたは構造のパイプ役としてを配置または (詳細レビュー23断裂モデルを完了,24,25). 移植と軸索交差26,27前ゲルのマトリックス/SC のインプラントと比較してのホスト コードのより寛容なインターフェイスを作成します注射マトリックス/SC の混合物のゲル化その場観察5,18,19,28. より剛性と構造電線管またはより少なく成形の前もって形成されたゲルはできなかったに対し、不規則なホスト ・ インターフェース周り輪郭にマトリックスを許可されてその場でゲル化します。構造電線管は多くの場合注射マトリックスと対照をなしてガイダンスとインプラントの接触の安定性を提供します。ここに示すプロトコル記述 (例えばマトリゲル、ここで注射のマトリックスとしての参考資料の表を参照してください) 注射の基底膜マトリックスとする構造化された水路活用術最も厳格な脊髄損傷モデルにおける軸索再生を評価します。

エレクトロスピニング ポリ-vinylidenedifluoride-トリフルオロ エチレン (PVDF ・ セッション) 一直線に並べられた繊維中空管、実験的取り組みで使用されます。PVDF ・ セッションは機械的に変形したとき一時的な電荷を生成し、神経突起の延長と軸索の再生を促進するために示されている圧電高分子30 29,の in vitroとin vivoの両方31. エレクトロスピニングは急速にファイバアライメント、ファイバー径の足場の厚さなどの制御可能なプロパティを持つさまざまな高分子材料を使用して信頼性の高い線維性足場を作り出すことができる一般的な足場工法神経やその他のアプリケーション32,33,34。

ラット脊髄損傷のサイトに移植した SCs の数多くの研究が治療効果5,9,18,19,20,21 を実証しています。 ,26。これらの移植は神経組織の病変部を周囲の巣キャビティ サイズを縮小し、病変/移植サイトと再生軸索の髄鞘形成に軸索の再生を促進します。人間 SCs は autologously 移植することができる、優位性神経関連他のほとんどと比較されたとき細胞は24。SCs の分離し、精製末梢神経生検後、ヒトへの移植の希望の金額に増殖されます。頸髄損傷患者に対する移植 SC イラン35,36,37,38、中国39,40, 念のために証明されているし、アメリカ合衆国の41,42。SCs には、多数の神経栄養因子と軸索の成長にとって重要な細胞外マトリックス蛋白質を分泌して末梢神経損傷後の軸索再生に重要な役割を果たすことが知られています。ここでの目標は、完全なラット脊髄離断モデルにおける SC 移植の予後を改善するコンジット デザインを調べることのできる方法を説明します。

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プロトコル

NIH および米国農務省のガイドラインによると女性アダルト Fischer ラット (180-200 g 体重) が収容されています。制度上の動物のケアおよび使用委員会 (IACUC)、マイアミ大学の動物のすべてのプロシージャを承認した

。

1 移植前準備

  1. 導管準備。。
    1. は解剖顕微鏡の下で #10 刃を使用して 5 mm が導管をカットします
      。 注: 導管の内径 2.4 2.7 mm の間は外径 2.5 2.8 mm の間です
      2. 。
    2. は、長手方向側 ( 図 1 a) に沿って優しく電線管を隠します。0.4 ミリメートルの長さと導管の開口部から少なくとも 1 mm と約 1 mm 離れてストレート エッジ Vannas はさみ ( 図 1 b) を使用して 4 つの小切開をカットします。
      1. は電線管 ( 図 1) を展開し、サイド バイ サイドの 2 つのウィンドウを作成する同じ側面に沿う 2 つの切開の間 ( 図 1) をカットします。窓を開いたし、ノーカットの側面に沿って正しく閉じてできるようにします
        2. 。
    3. 75% のエタノール 10 cm シャーレで 25 分の管を消毒します。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 と 4 分のために一度管を洗浄し、新しい 10 cm シャーレに滅菌ピンセットで水路を転送します。25 分の 1 × PBS で 2 回導管をすすいでください
      4. 。
    4. は、手術まで 1 × PBS のコンジットを格納します
      。 注: 多くの導管を一度に消毒が可能します。個別の滅菌 1.5 mL 遠沈管滅菌しておくことで、コンジットを格納します
      5. 。
  2. 緑の蛍光蛋白質 (GFP)-シュワン細胞 (SC) 準備
    1. 上記 43 として大人の女性フィッシャーの脛骨神経から精製した SC 文化ラットを準備します。このステップの完了時に板ポリ-L-リジン (PLL) の SCs-10 cm シャーレをコーティングし、D10/3 M 媒体の維持これらの SCs の通路 0 として定義されます
      。 注: D10/3 M 媒体は以下から成る: 10% 牛胎児血清 (FBS)、1% ペニシリン-ストレプトマイシン (ペン/連鎖球菌)、20 μ G/ml 下垂体抽出、2 μ M フォルスコリン、ダルベッコの 2.5 nM heregulin ' s 変更イーグル ' s 培地 (DMEM).
    2. 補充培 D10/3 M (7 mL/10 cm シャーレ) とすべての 3 〜 4 日
      3. 。
    3. 分割 SC 文化 70-80% の合流点に達すれば。
      1. 削除中、すすぎ 2 回ハンク ' s 平衡塩類溶液 (HBSS) カルシウムやマグネシウムなし
        2. 。
      2. 各 10 cm シャーレに 0.25% トリプシン/EDTA の 5 mL を追加し、室温 (RT) で 5 分間インキュベートします
        3. 。
      3. トリプシンを中和するために 50 mL の遠心管に D10 媒体 (10 %fbs と 1% ペン/連鎖球菌 DMEM で) 5 mL を追加します
        4. 。 ペトリに
      4. 優しくピペット トリプシン/EDTA ソリューションは、SCs。 削除をデタッチするのには数回お皿から細胞懸濁液を皿し、前の手順で作製した遠心管に入れます。D10 媒体の 5 mL と皿を洗い、セル収穫を最大化する遠心管に入れます
        5. 。
      5. 370 x g 4 o c. 削除上澄みで 5 分で細胞を遠心し、シャーレの各分割 4 mL D10/3 M 培地で細胞を再懸濁します
        6. 。
      6. 10 cm シャーレに 1 mL SC 懸濁液、D10/3 M 中の 6 mL を分注; 各シャーレ分割 4 枚のペトリ皿になります。これらの SCs の通路 1 として定義されます
        7. 。
      7. 新鮮な D10/3 M 中日後めっきとめっき後 3-4 日おき補充します
        8. 。
      8. 一度 SCs は 70-80% の合流点に到達、1.2.3.1 に 1.2.3.6 の手順を繰り返します。SCs は、通路 2 今
        9. 。
    4. 50% の合流点に達する SCs を変換、エンコーディング GFP D10/3 M のレンチウイルスベクターを 30 の感染症の多様性で一晩中前述 44 , 45.
    5. 次の日、めっき後 3-4 日おき D10/3 M 培と補充します
      6. 。
    6. GFP SCs が 70-80% の合流点に達すれば 1.2.3.1 に 1.2.3.5 の手順を繰り返しますが、D10 媒体の 6 mL で GFP SCs を代わりに再懸濁します。1.5 mL 遠心チューブに GFP SC 懸濁液の 15 μ L を分注、0.4% トリパン ブルー溶液 15 μ L を追加します。遠心管を軽くフリックし、細胞数スライドの室に混合物の 10 μ L を分注します。
      1. 自動化された細胞カウンターにスライドを置き、細胞密度を決定します
        2. 。
    7. 4 o c. 削除上澄みで 5 分間 370 x g で細胞を遠心分離、3 x 10 6 GFP の凍結媒体の 1.5 mL で再懸濁します-SCs 調剤 1.5 mL、セラムと-80 で凍結に GFP SC を懸濁液の o。 液体窒素貯蔵のために移動する前に、少なくとも 24 時間の C.
      注: 凍結媒体: DMEM で 25 %fbs と 8% ジメチルスルホキシド
      8. 。
    8. 解凍 GFP SCs 1 週間手術前に。
      1. 50 mL の遠心管に追加 10 mL D10 中です
        2. 。
      2. 37 o 部分的解凍されるまで C で水浴の冷凍 GFP SCs のバイアルを解凍
        3. 。
      3. は極低温バイアルから GFP SC サスペンションを取り外して 1.2.8.1 で 50 mL の遠心管に入れます。ピペット ソリューション優しく上下に繰り返しします
        4. 。
      4. 370 x g 4 o c. 削除上澄みで 5 分で細胞を遠心し、解凍した各バイアルの 4 mL D10/3 M 培地で細胞を再懸濁します
        5. 。
      5. 10 cm シャーレに GFP SC 懸濁液の D10/3 M 培地 5 mL 及び 2 mL を分注; 各バイアルは、2 枚のペトリ皿になります。GFP SCs の通路 3 として定義されます
        。 注: 10 cm シャーレ 1 週間後に約 8 × 10 6 GFP SCs を通常得られます
        6. 。
    9. 手術の日、1.2.6 の手順を繰り返します。1.2.10 のステップで計算した細胞密度を使用します
      10. 。 1.2.9 のステップから細胞密度に基づく
    10. ディスペンス因数 3 x 10 6 GFP SCs に滅菌 1.5 mL 遠心チューブが計算されます。4 o C で 5 分間 370 x g で GFP SC 因数を遠心し、上清を除去します。各因数と 370 x g に遠心分離機/F12 DMEM 培地 1 mL を追加
      注: 各動物を受け取る 3 × 10 6 GFP-このステップまで GFP SCs で SCs 血清培地を使用します。
      11. 。
    11. 移植の時まで氷の上を保つ GFP SCs
      12. 。

2。胸部のレベル 8 (T8) で切除を完了

(60 mg/kg 体重) ケタミン ・ キシラジン (5 の腹腔内注入
    1. 麻酔女性フィッシャー 動物外科手術のため のラット (180-200 g)mg/kg 体重)。つま先をつまんでチェックして次のステップに進む前に麻酔の深さを監視し、目の点滅応答します
      2. 。
    2. は電気クリッパーとラットの背中をそるし、70% アルコールで皮膚を拭きます。両方の目に点眼の潤滑剤を適用されます。脊椎骨が簡単にアクセスにのって約 37 o C のイス、動物の体の温度を維持するために加熱パッドの動物を手術テーブルに転送します
      。 注: ロールはペーパー タオルまたは滅菌できるガーゼで x2 の 2 から可能です。T7 T9 はロールの上に平らに置かれる必要があるときに大きなロールお勧めします
      3. 。
  2. T9 椎弓切除術に T7
    1. T9 T11 棘突起のランドマークを検索します
      。 注: T9 と T10、T11 のギャップが小さい他のセグメントに比べて私n 地域。ロールをラットを配置した後 T9 T11 棘突起が皮膚を通して小さな三角形のバンプのような気がします
      2. 。
    2. T11 T4 から #10 刃を使用して皮膚の 4 〜 5 cm 正中切開を行います。脂肪を解剖する鈍端と曲線はさみで表面的な脂肪層で小切開を行います
      。 注: 機器の他のタイプは脂肪を分離する使用ことができますが、鈍端と曲線はさみ脂肪分離の最も効果的な少なくとも侵襲的な方法を有効にします
      3. 。
    3. は、#10 ブレードの背面を使用して T9 棘突起に T7 を見つけます。T4 の鈍い鉗子が付いてで筋肉を押しながら T6 T10 から脊椎の両側に沿って筋肉に切開を行います。きれいなオープニングを作るし、動物に最小限の損傷を引き起こす可能な脊椎の近くに、カットをしています
      4. 。
    4. 各個々 棘プロセスから分離 T7 筋肉および T6 と T7、T7、T8、T8、T9、間靭帯を切断することによって T9 と T9 と T10 #10 ブレードと
      5. 。
    5. は、T9 に T7 から筋肉とラミナで靭帯を削除するのに、rongeur を使用します。T7 から T9 の横突起間のギャップが表示されるまで、できるだけ横に筋肉や靭帯を削除します
      6. 。
    6. は、rongeur と T9 棘突起を削除します。鈍い鉗子と T9 と T10 のプロセス間の小さな開口部で T9 の板を昇格に優しくリフト T8 棘突起を保持します
      7. 。
    7. は削除板開口部から始まって、T9 で rongeur に吻方に移動します。可能な限り横に板を削除します。後根は、椎弓切除後表示する必要があります
      8. 。
    8. 板を取り外したら、T7、T8、プロセスを繰り返します
      。 注: 椎弓切除術、中に、椎弓切除術を続行しながら血液を削除する吸収槍を使用します。過剰な出血が発生した場合出血サイトに圧縮スポンジを置き、血液凝固のために生理食塩水を追加します
      9. 。
  3. T8 で離断
    1. T9 に T7 周りリトラクターを配置。すべての葉身を取り外したら、横突起間のギャップが特に T8 で、表示されていることを確認します。また外側突出骨片がないことを確認する T9 に T7 間両側の長さに沿って骨を調べる
      。 メモ: T8 でこのギャップは完全断裂を実行するため重要です。簡単に電線管挿入の長さに沿って椎を削除必要があります
      2. 。
    2. カット、背側と腹側根上と下の T8 を使って角度春はさみ。脊髄に生理食塩水を追加し、血塊に血のため待つ
      注: この手順は適切な管を挿入するため重要です
      3. 。
    3. T8 で横突起間のギャップの脊髄上斜め春はさみを配置、脊髄を完全に切断する 1 カットできます。結果 2-2.5 mm のギャップに圧縮された泡の小片を置き、地域にすぐに生理食塩水を追加します
      4. 。

3。電線挿入

  1. 1x PBS からの導管を取り出す止血に到達する切断コード切り株を待っている間。薄い長い粉々 吸収三角形にカットし、余分な PBS を削除する導管に配置します。カット済みのウィンドウが開いていることを確認してください
    2. 。
  2. は、生理食塩水を削除し、血液の吸収の三角形の薄い長い部分を使用しています。脊髄の良好な分離を確保するため、microspatula を使用して 2 つの切り株を持ち上げます。注意深く、microspatula と吻側断端を持ち上げ、自分に直面する窓と切り株上の導管をスリップします。全体の切り株が挿入されます、コンジットへの過剰な出血がないことを確認します
    3. 。
  3. は、尾側断端を注意深く持ち上げ、切り株上、電線管のもう一方の端をスリップします。全体の切り株が挿入されます、窓は ( 図 2 a) 背側表面を確認してください
    4. 。

4。シュワン細胞/注射マトリックス (材料の表を参照してください) 準備と注入

  1. 止血に到達する切断されたコードを待っている間 (1.2 の手順で準備) GFP SC ペレット上記媒体を削除します。冷たい DMEM/F12 の 10 μ l の GFP SCs を再懸濁します。細胞懸濁液に冷たい注射ゲルの 10 μ l を追加し、繰り返しピペッティングでよく混ぜます。電線管の挿入が完了するまで、氷の上 GFP SC/DMEM/F12/注射マトリックス混合物を保持します
    2. 。
  2. 背側表面は上のウィンドウ開く ( 図 2 a) であることを確認した後 GFP SC/DMEM/F12/注射マトリックス混合物の 20 μ l を 46 カット済みの windows の 1 つを通して導管注入します。チップとマイクロ ピペット ロード西部のしみを使用しています。SC、DMEM、F12、注射マトリックスの混合物は、コンジットをあふれて必要がある場合、は、吸収の三角形と超過分を削除します。射出成型後のウィンドウを閉じます縫合はありません ( 図 2 b) が必要です
    3. 。

5。創傷閉鎖と術後ケア

  1. 縫合筋肉層と表面的な脂肪層。70% のエタノールと、主食 (例えば 傷のクリップを使用して) 肌をきれい肌がシャット ダウンします。彼らは意識を取り戻すまで、熱規制のインキュベーターで、動物を飼います。ケージに動物を転送します。長い栄養チューブを水を提供し、容易なアクセスのための寝具に餌ペレットを配置します
    2. 。
  2. 管理ブプレノルフィン (0.1 mg/kg 体重) 皮下に痛みを軽減する手術直後後から 3 日間 1 日 2 回。ゲンタマイシン (5 mg/kg 体重) を防止し感染を減らす手術直後後 7 日間一日一回皮下を注入します。水分補給のため 7 日間一日二回皮下一日リンガーズ溶液 10 mL を注入します
    3. 。
  3. 空膀胱手動で 2 回膀胱まで関数を返す。膀胱の感染症が発生した場合、管理生理食塩水 10 mL 皮下尿が明らかになるまで。2 日間で改善しない場合は、注入ゲンタマイシン (5 mg/kg 体重、1 日 1 回) 皮下まで尿が明らかになります
    4. 。

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結果

この手技を使用しての目的は、構造電線管および完成した切断脊髄に移植後 SC 関数を最大化する注射のマトリックスの使用を評価することです。移植後 3 週間動物は 4% パラホルムアルデヒドで灌流と脊柱を肉眼的切除し、さらに 24 時間同じ固定液で固定します。脊髄を解剖し、矢状切片のサンプルはに対する凍害保護作用の 30% ショ糖液に配置されます。切り裂かれた脊髄の別のセットの SC 橋の真ん中から分離した 1 mm 厚の断面積は、グルタルアルデヒド固定プラスチック セクションを処理するために配置されます。サンプルとしてベイツらによって詳細な電子顕微鏡の準備のためのスケジュールを受けます47. 矢状切片が GFP、グリア線維性酸性蛋白 (GFAP) に対する主な抗体で immunostained 重鎖ニューロ フィラメント (RT97)、中鎖ニューロ フィラメント (NF) 二次抗体などが続くヤギ-反-鶏-488、ヤギ-反-ウサギ-546、ヤギ抗マウス 647、ヤギ抗うさぎ 647、それぞれ。GFP SCs は...

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ディスカッション

効果的な断裂モデルを作成する最も重要なステップは、1 つまたは 2 つのカットで脊髄を切断です。吻側と尾側の脊髄切り株の間 2 〜 2.5 mm のギャップが離断サイトで表示されます。表示されないこのようなギャップの 3 つの最も可能性の高い理由は、(1) 背/腹根が正常に削除されませんでした、(2) 腹側硬膜は適切に削除されませんでしたまたは (3) の動物だった彼女の下に置かれたロールに正しく配置されていないです。

切り株の間効果的な導管に挿入を実行する: 特定の種および実験; で使用される動物の年齢の合うべきである導管の直径 (1)(横突起の間のギャップを可視化することができます; まで十分な横方向 2) ラミナを取り外す必要があります。(切り株の間 (4) 電線管の挿入は、最初の試行で達成しなければならないし、3) 根を削除する必要があります。複数回の試行が必要な場合、浮腫を切り株をさらに切り株の間の導管に挿入するタスクを複雑にし、追加傷害を引き起こすこの可能性があります。

コンジットに GFP SC/DMEM/F12...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

マイアミ麻痺治療プロジェクトでのウイルスのベクトルと動物コアをクライオスタット、共焦点顕微鏡の使用のため遺伝子導入 GFP ウイルス、動物のケアをそれぞれ、生産および組織学とイメージング コアに感謝したいと蛍光顕微鏡ステレオ捜査官。資金調達は、NSF (DMR-1006510)、国防総省 (W81XWH-14-1-0482)、NINDS (09923) によって提供されました。M.B. バンジはクリスティン E リン識別教授の神経です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
低温学のバイアルThermoFisher Scientific5000-0020
10 cm ペトリ皿VWR25382-428
Dulbeccoの修正されたワシの媒体: 栄養混合物 F-12ThermoFisher Scientific11039-021「DMEM/F12」プロトコルで。
ペニシリン-ストレプトマイシンサーモフィッシャーサイエンティフィック15140-122「ペン/溶連菌
ウシ胎児血清HycloneSH300-70-03「FBS」のプロトコル。
下垂体抽出物Biomedical TechnologiesBT-215
ForskolinSigma-AldrichF6886
ヘレグリンR&D Systems396-HB/CF
Poly L-lysineSigma-AldrichP2636"PLL" プロトコル。
ダルベッコの修正されたイーグルの媒体サーモフィッシャーサイエンティフィック11965-092「DMEM」 プロトコルで。
ハンクの平衡塩溶液ThermoFisher Scientific14170-112"HBSS"プロトコル。
Tryspin-EDTAThermoFisher Scientific15400-054
雌フィッシャーラット (160-180g)Envigo
Vannas はさみ、ストレートFST15018-10
KetamineVedcoInc 5098976106100 mg/ml
XylazineLloyd IncAnaSed20 mg/ml
GentamycinAPP PharmaceuticalsNDC 63323-010-02任意のブランドを選択できます。
マイクロスパチュラFST10089-11任意のブランドを選択できます。
鈍い端を持つ湾曲したはさみFST14017-18ブランドにすることができます。
鈍い鉗子FST11006-12任意のブランドを選択できます。
rongeurFST16121-14任意のブランドを選択できます。
角度付きスプリングハサミFST15006-09任意のブランドを選択できます。
吸収三角形FST18105-03任意のブランドを選択できます。
GelfoamHenry Schein9083300「圧縮フォーム」のプロトコル。
#10ブレードSklar06-3010ブランドを選択できます。
マトリゲルコーニング354234プロトコルの「注射可能なマトリックス」。
ニワトリ抗緑色蛍光タンパク質抗体ミリポアAB16901
マウス RT97 ハイブリドーマ抗体DSHBRT97
ウサギ抗ニューロフィラメント抗体Encor Biotechnology, IncPRCA-NF-H
ポリクローナルウサギ抗グリア線維酸性タンパク質抗体DakoZ033401
Alexa Fluor 488 ヤギ抗ニワトリ IgG (H+L)サーモフィッシャーサイエンティフィA-11039
Alexa Fluor 546 ヤギ抗ウサギ IgG (H+L)サーモフィッシャーサイエンティフィックA-11035
Alexa Fluor 647 ヤギ抗ウサギ IgG (H+L)サーモフィッシャーサイエンティフィックA-21244
Alexa Fluor 647 ヤギ抗マウス IgG (H+L)サーモフィッシャーサイエンティフィックA-21236
共焦点顕微鏡Nikonclsi
」任意の任意のック

参考文献

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