顕微鏡を用いたひと脂肪組織血管機能評価

Summary

ビデオ顕微鏡システムは、生理学的および薬理学的刺激への反応で分離脂肪細動脈の機能特性を調べるに使用されます。この手法は、肥満人間で異なる脂肪組織ドメインにおける微小血管表現型を確認する使用できます。

Abstract

肥満が代謝と心血管の病気の開発に密接にリンクしている、これらのプロセスを支配するメカニズムについてはほとんど知られています。それはローカルおよび全身、中央/腹部内臓脂肪蓄積との関連で特に脂肪組織から解放 pro 動脈硬化のメディエーターが病原性の血管の変化を促進して心血管疾患があります概念仮説は、脂肪組織の機能不全の結果は、進化し続けます。ここでは、生きているヒトの脂肪のデポから削除そのままの小さな人間の細動脈の血管拡張と血管収縮反応の分析を含むビデオ顕微鏡のユニークな方法をについて説明します。顕微鏡を使用して、薬理学的または生理学的な刺激の体内の条件を模倣する圧力システムを使用して分離された微小血管の機能プロパティを確認します。テクニックは、病態と脂肪組織環境のローカルの血管機能不全に寄与する分子メカニズムの理解を得るための便利な方法です。また、脂肪組織の血管の異常は、全身疾患にリンクされています。肥満者のデポ固有血管反応を調べるためにこの手法を適用した.増加の流れと同じ個体から肥満症治療手術の中に 2 つの異なる脂肪倉庫から分離した脂肪細 (50 350 μ m の内径、長さ 2-3 mm) におけるアセチルコリンの両方に内皮依存性血管拡張反応を検討しました。内臓脂肪から細動脈が皮下のデポから血管と比較して内皮依存性血管拡張反応を示すデモンストレーションを行った。内臓の微小環境の臨床的観察: 全身性疾患メカニズムに内臓脂肪の増加をリンクに関連すると思われる血管内皮機能障害に関連付けられているが示唆されました。ビデオ顕微鏡法は、異なる脂肪質のターミナルから血管表現型を調べるだけでなく、肥満と代謝異常の程度が異なると個人間での調査結果を比較する使用できます。血管反応の臨床的介入の長手方向を調べるメソッドを使用もできます。

Introduction

顕微鏡は、生きているヒトを対象前のヴィヴォから削除小細動脈の血管の機能をみるための便利な方法です。当研究室は、解剖の様々 な脂肪微小血管構築に及ぼす影響を特徴付ける様々 な脂肪組織コンパートメントから小さな血管を重視しています。この手法の主な利点は、血管は人間の体から削除機能が維持され、生検に続く時間に数分以内に容易に調べることができます。生理学的な条件のまねをして着実に経壁圧の生体内での多くの特徴を要約するマイクロ ガラス カニューレを介して腔内空間で管理されます。^1,2また、自動エッジ検出ソフトウェアの信頼性の高い顕微鏡の組み立ては分離の内皮依存性および非依存血管拡張と血管収縮能力の質的・量的評価を可能します。物理、薬理学的刺激への応答の生理的評価法を急速にリアルタイムの許可船。³他の微小血管の技術はより時間がかかることし、力変換器により様々 なアゴニストに張力応答を測定する傾向がある線図法などご利用頂けます。

当研究室では、肥満と脂肪組織の異なるドメインの血管系に及ぼす影響に焦点を当て、血管機能障害との関係を調べるための顕微鏡を適用しています。腹部内臓脂肪の蓄積と中央肥満は、アディポサイトカイン生産・代謝異常・ cardiometabolic リスクに最も密接にリンクされています。Pro-動脈硬化のサイトカイン、アデポカイン不全の過剰生産と脂肪組織の機能不全、これらのプロセスに強く関与しているが、特定の規制分子と治療目標のまま主と仮定されています。未発見。⁴また、局所の脂肪組織レベル、毛細血管の膨張および血流障害では、脂肪組織 pseudohypoxia と代謝不全にリンクされています。心血管疾患脂肪組織の機能不全の結果であるかもしれないこと仮説は進化しています。中央/内臓脂肪過多症、可能性が高いとの関連で特に脂肪からリリース pro 動脈硬化のメディエーター内皮機能障害を促進するためおよび病原性血管変化できる脂肪の血管のローカル マニフェストを使用して検出、方法論が記載。⁵

分離脂肪細動脈の機能的アセスメント、病態と血管機能不全に貢献する人間の肥満の分子機構の理解を得るための便利な方法です。脂肪のデポ固有の機能不全に寄与するメカニズムを調べるためには、内皮依存性を調べる方法を開発したおよび - 独立した血管拡張、血管に対する様々 な規制の式を評価して対内臓や皮下 (SC) 脂肪組織標本を用いた肥満者肥満手術の時の候補者。

Protocol

プロトコルとここで説明した例でボストン大学学校の医学制度審査委員会 (IRB、プロトコル #H-25644) が承認され、ヘルシンキ宣言に従って運営しました。すべての科目は、参加前に文書による同意を提供します

。

1 です。 ソリューションの準備とマイクロ ガラス カニューレ

1. 4-2-hydrosyethyl-1-piperazineethanesulfonic 酸塩 (HEPES) 解決の準備。1 L の溶解 8.059 g NaCl、KCl、0.298 g 0.296 g MgSO ₄ • 7 H ₂ O は、0.235 g CaCl ₂ • 2 H ₂ O、0.16 g KH ₂ PO ₄, 950 mL の 0.01 g 酸 HEPES 2.383 g、1.081 g グルコース、EDTA 脱イオン水。脱イオン水で 1 L にボリュームを構成します。NaOH を使用して 7.4 に pH を調整します。4 の 7 日間に HEPES バッファーに格納できる ° C
2. は、Salt のバッファー在庫 x 20 を準備します。1 L 追加 143.8 g 塩化ナトリウム、KCl 7.0 g、5.9 g MgSO ₄、7.4 g CaCl ₂ • 2 H ₂ O 900 mL の蒸留水に。脱イオン水で 1 L にボリュームを構成します。原液をデパート 4 ° C
3. は、緩衝在庫 x 20 を準備します。1 L 26.8 g NaHCO ₃ と 0.2 g EDTA·2H ₂ O に 900 mL の脱イオン水を追加します。脱イオン水で 1 L にボリュームを構成します。原液をデパート 4 ° C
4. 生理学実験に使用するクレブス ソリューションを準備します。1 L、900 mL の脱イオン水、緩衝在庫 x 20 の 50 mL、塩緩衝液、0.99 g D-グルコースおよび 0.16 g KH ₂ PO ₄ x 20 の 50 mL を追加します。7.4 HCl を使用して pH を調整します。バッファーの pH を維持するために絶えずかき混ぜるとパラフィンでカバーまたは継続的にバブルします。
   1. PH 20 分ごとにチェックするクレブス ソリューション新鮮な毎日
   。
5. 市販針/ピペットの引き手を使用して 40 240 μ m の内径とマイクロ ガラス カニューレを作る。ガラス カニューレのサイズは、(50-350 μ m) 血管の内径のサイズによって決定されます。また、あらかじめ決められたサイズのマイクロ ガラス カニューレを購入
。

2。試薬の調製

1. 準備アセチルコリン (Ach、10 ^-2 M、原液)。10 mL の脱イオン水で 18.29 g を溶解します。-80 ° C の原液 (10 ^-2 M) の 1 つの mL の因数を格納します。次の働く集中を取得するシリアル希薄の実験の日: 10 ^-9, 10 ^-8 10 ^-7 10 ^-6 10 ^-5 m.
2. は、パパベリン (2 × 10 ^-2 M、原液) を準備します。10 mL の脱イオン水で 0.07517 g を溶解します。原液と-80 でストアの 10 μ L の因数を準備 ° C. 連続希釈 10 ^-8 M、10 ^-7 10 ^-6 10 ^-5 10 ^-4 を実験の日に取得する
。
3. は、エンドセリン 1 (ら 1、2 × 10 ^-5 M、原液) を準備します。1 ml 1% の 50 μ g エンドセリン 1 の溶解 BSA/PBS。-80 ° C の原液 (2 × 10 ^-5 M) の 1 つの mL の因数を格納します。実験、実験の日に 10 ^-10 M の作業濃度希釈の日
。
4. 試薬をいずれかの-20 ° C で保存または-80 ° C のフリーザーのタイプによって異なりますが、6 ヶ月以内にアップします
。

3。脂肪組織の採取と血管の準備

1. リクルート肥満男性と女性 (ボディマス指数 (BMI) ≥ 35 kg/m ²、年齢 ≥ 18 年) 肥満症治療手術プログラム ボストン医療センター (BMC) で在籍します。これらの実験に参加した 40 人の被験者の合計
。
2. 操作を実行する外科医によって計画された肥満手術中に皮下脂肪および内臓脂肪組織サンプルを収集します。
   1. 収穫、皮下脂肪組織下の腹部からと内臓脂肪、大網からそれぞれ。典型的な脂肪質のティッシュ サンプル サイズによって異なります組織の 3-10 mg.
   2. 場所組織すぐに冷たい HEPES バッファー溶液 pH は 7.4 と 4 ° c 24 時間まで店で
      注: また、脂肪細他のタイプのヘルニア修理や外科などの手術中に細い個人同様から得ることが、トランス-皮膚の腹部脂肪パッド生検を介して皮下のデポから生検することができます < supクラス ="xref"> 6.
3. 小さな脂肪細動脈 (50 350 μ m 腔径、長さ 2-3 mm) から周囲の脂肪や結合組織を慎重に取り外します組織解剖顕微鏡、マイクロ剪刀とマイクロ鉗子を使用する.
4. ガラス毛細管ピペットで cannulating 前に小さなナイロンまたは絹縫合糸を使用して細動脈のすべての枝をネクタイ。細動脈壁のダメージも大幅な機能変更を引き起こすため慎重に細動脈を切り裂く。
   1. 最小化容器露出の光と熱とは、血管拡張を引き起こす可能性があります。それは時々 に細動脈と細静脈を区別することは困難することができます、ので血管の先端を挟む、血管のサイズと滑らかな筋肉調子を識別します。細動脈は通常より小さく、細静脈と比較して大きい音を示します
   。
5. オルガン室を準備します。ガラス毛細管ピペットおよびゴム製管でクレブス ソリューションの 10 mL の注射器を使用してゆっくり塗りつぶす
。
6. ゴム製管をいっぱいになりガラス毛細管ピペットはクレブス ソリューション オルガン チャンバー内に沈んでいる、一度安全ピペットで安全に細動脈を cannulate しナイロンと血管の両端を結ぶまたは絹縫合糸の結び目の慎重に
。
7. クレブス ソリューションとオルガン室を埋める 2 mL
。
8. 倒立顕微鏡 (倍率 10 倍/0.25 目的) とステージ上に機関室を確保とビデオ カメラ
。
9. 1 kHz のサンプリング レートでリアルタイムでストリーム エッジ検出ソフトウェアをオンに (1 フレーム/秒) です
。
10. は、泡することができます実験誤差を導入、充填圧力タンク無料マイクロバブル、クレブス ソリューションに加圧チューブの一方の側を接続します。機関室に加圧チューブの反対側を接続します
。
11. クリーン チューブの圧力トランスデューサーにクレブス ソリューション充填圧力タンクを接続します
。
12. 貯水池同じ高さで配置することが、内管腔の流れは発生しません; したがって、これら 2 つの貯水池の高さを調節することによって内腔内のフローを制御します
。 37 で温度を維持するためにブロックやソフトウェア プログラムを暖房オンに
13. これらのすべてのプロセスが完了したら、° c. 継続的にクレブス ソリューションの容器を灌流し、5% CO ₂ 21% O ₂ 74 %n の混合ガスを通気しなさい ₂ ^{7 , 8} 実験プロシージャ全体で
。 常々 主張目的の圧力を達成するために
14. デ分離血管の内腔が徐々 に内皮層の損傷を避けるために遅い速度でそう墓インターフェイス パネルの圧力コントロール ユニットを介して内圧 (5 mmHg、5 分ごと) を増加します
    。 注: 圧力 60 mmHg に達すると、20-30 分の平衡期間が船を安定させるために必要です。すべての血管機能の研究は、60 mmHg と pH 7.4 で 37 ° C で行われます。 ⁷

4。脂肪の血管機能評価

注: 脂肪細動脈内皮依存性血管拡張することができます (流体) に生理学的な応答誘発される一般に、および薬理学的刺激 (Ach 誘起).

1. フローを介した、内皮依存性血管拡張反応
   1. 以下の加圧、残り (Di) で脂肪細動脈の直径を記録。これを安静時の基準径と呼びます
   。
   2. 事前エンドセリン 1 の 1 μ L を追加することで安静時の基準径 (Dp) ~ 55% に血管を収縮させる (エ-1、10 ^{− 10} M) 効果を待つ 5 分とお風呂に直接。状態を収縮事前希望 ~ 55% に到達するまでこのプロセスを繰り返します
   。
   3. 前収縮後平均腔圧を変更することがなく容器に圧力差を開発ことができます脂肪細動脈と等しいと反対方向の管腔内空間に連続的な流れを誘発します。60 mmhg
      。 注: たとえば、1 つのタンクは高さ 10 cm だけ上に移動、他の 1 つ必要があります圧力勾配を変更し、したがって腔内流量を変更する 10 cm で上下に移動します。正確な測定が必要な定量的流量計システムが実験のセットアップに適用できます
   。
   4. 測定の流れ媒介の拡張の流れ誘導開始後 3-5 分。腔内流れ (圧力勾配) のレベルがすることができます 0 - の範囲に 100 cmH ₂ o. 増圧力勾配の各インクリメント Δ10 cmH ₂ O 100 cmH ₂ o. の最大の 5-6 分毎
      注: 必要内腔で安定した層流を誘導するためにマイクロ ガラス カニューレ先端のサイズが両方非常に細動脈の内径に近いことそうでなければ、それはルーメン内の乱流を生成し、不要な測定誤差を誘発する
   。
   5. フローを介した拡張評価、次圧力タンクを同じ高さ (60 mmHg) に戻ります
   。
   6. すぐに商工会議所からソリューションを削除することによって細動脈と商工会議所を洗浄し、新鮮なクレブスによるソリューションに置き換え。これは、チャンバー内で中断された細動脈を妨害しないよう注意します
   。
   7. 3-4 回 20-30 分のため、または分離の容器は、安静時の基準径に戻るまでこのプロセスを繰り返します
   。
2. アセチルコリンを介した、内皮依存性血管拡張反応
   1. 脂肪細動脈が安静時の基準径に返されると、あらかじめ収縮エンドセリン 1 (エ-1、10 ^{を投与することによって船 ~ 55%− 10} M) 直接バス、セクション 4.1.2 で上記のようにします
   。
   2. 前の収縮後順次、受容体を介した窒素酸化物アゴニスト (Ach、10 ^-9 10 ^-5 M) お風呂に直接であるアセチルコリンの用量増加 (2 μ L) を管理します。各用量の投与後動脈直径 5 分の変化を記録します
   。
   3. 容器が到達する最終的なアセチルコリン投与の投与高原クレブス ソリューションの 3-4 回容器を洗います。回復して基準径を休憩に戻る船に 20-30 分を許可します。オルガンのキャンバーで pH を維持するため、変更クレブス ソリューション 15 分ごとに
3. N _w - ニトロ - l 細動脈を孵化させなさい-アルギニン メチルエステル (L 名、10 ^-4 M)、30 分の一酸化窒素合成酵素の阻害剤を繰り返します 4.2.1 と 4.2.2 の相対的寄与を特徴付けるアセチルコリンを介した血管拡張に一酸化
。
4. は、お風呂に直接パパベリン (10 ^-8 10 ^-4 M) の用量増加の連続投与による内皮非依存性血管 (血管平滑筋機能) と容器の可能性を評価します。血管径を戻すには、またはパパベリン (すなわち 適切な血管拡張) への応答で安静時のベースライン (Di) 直径を超過しない場合、容器を非実行可能考慮し、データ ポイントを捨てる
。

5。データの解析と計算

1. 血管反応性を計算します。血管径の基準の違いを考慮し、次の式を使用して計算データ表現のためのパーセントの血管拡張を使用して、:
   % 血管拡張 (DT-Dp/ディ-Dp) × 100 =
   DT がある特定の時点 (最大で記録された直径直径)、Dp は血管収縮剤 (すなわち 添加後記録直径です。ET-1 による狭窄径)、Di は血管収縮剤 (安静時基準径) の追加の前にすぐに記録された直径と。 ⁹
2. アゴニストに Ach、パパベリン、またはエ-1 最大応答 (EC ₅₀) の 50% を引き出すことによって定義することができます濃度として血管拡張と血管収縮の感度 (用量-反応) を定義します。s 字のパラメーターと前述のように、プロットされました。 ¹⁰
   注: 脂肪の血管の血管拡張の検者間再現性研究は 0.99 の高相関係数 (CC) (n = 10 の船実験) 当研究室で

。

6 統計解析

± SEM. を意味

1. エクスプレスの連続測定。これらは正規分布する傾向があります。繰り返される措置二元によって脂肪細動脈における血管反応を分析します
。
2. はまた、試験治療グループ間の線量応答に累積的な血管拡張のためのプロットの (AUC) 曲線下面積を比較します。すべてのケースで検討 P < 0.05 を有意
。

Results

当研究室は内皮依存性を調べる顕微鏡を使用し、-肥満人間の皮下脂肪および内臓脂肪から分離した脂肪組織の細動脈の vasocontractile 関数と同様に、独立した血管拡張。特性の実験の設定は、図 1 aに表示されます。脂肪組織の細動脈は 2 つガラス毛細管ピペットの間中断され、図 1 bに示すように、臓器のチャンバー内縫合糸の場所に固定します。眼底の応答することができます基準径 (図 2 b) ~ 55% に ET 1 と前の収縮が続くし、アゴニストによるベースライン (図 2 a) で船を調べることによってそれから査定するセクション 5.1 で説明しました、血管拡張と図 2のように、血管の内腔のリラクゼーション。

Discussion

郭清と脂肪細動脈周囲組織からの分離は、ディテールとプロトコルの技術に細心の注意と時間のかかり、労働集約的なプロセスをすることができます。レーザーマイクロダイ セクション手順細心の技術と平滑筋や内皮細胞の潜在的な損傷を防ぐ特殊な解剖器具細胞、血管の層が必要です。細動脈の壁にも、小さな偶然穿刺は、腔内加圧と失敗した実験の結果を防ぐことができます。また、縫合糸を利用した細動脈の穿刺は、容器の両端にガラス毛細管ピペット チップ間細動脈をセキュリティで保護することが重要です。

人間の孤立した血管は、60 mmHg で加圧の 30-40 分後自発筋トーンを開発できます。ただし、人間の脂肪細サイジング 50-350 μ m 内部内腔の直径が血管の平滑筋の疎層で比較的小さく、骨格筋細動脈と比較して有意な筋トーンを開発しない傾向があることがわかった。我々 はこのように、これらの小さな細血管拡張薬への暴露前に ET 1 を使用して前の収縮を誘発します。エ 1 がより予測可能な収縮反応を発揮するいくつかのケースであるかもしれない間変動のフェニレフリンなどの α 受容体作動薬の反応がわかります。希望 ~ ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
化学名
アセチルコリン	Sigma Aldrich	A6625
塩化カルシウム(CaCl2)	Sigma Aldrich	223506
D-(+)-グルコース	Sigma Aldrich	G5767
エンドセリン-1	Sigma Aldrich	E7764
エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-テトラ酢酸(EGTA)	シグマアルドリッチ	E3889
エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)	シグマアルドリッチ	E9884
HEPES	シグマアルドリッチ	H3784
Nw-ニト-L-アルギニンメチルエステル塩酸塩	グマアルドリッチ	N5751
硫酸マグネシウム (MgSO4)	Sigma Aldrich	M7506
塩化カリウム (KCL)	Sigma Aldrich	P3911
リン酸カリウム (KH2PO4)	Sigma Aldrich	P5655
Papaverine	Sigma Aldrich	P3510
重炭酸ナトリウム (NaHCO3)	Sigma Aldrich	S6014
ナトリウム(NaCl)	Sigma Aldrich	S7653
ナトリウム一塩基性一塩基性一水和物(NaH2Po4)	Sigma Aldrich	S9638
名前	会社	カタログ番号	コメント
Equipment
	Forceps Finescienceツール	15000-08
倒立顕微鏡	ツァイスアクロマー
実験用チューブ	Euro-Pharm	250100306F999
ニードル/ピペットプーラー	デビッドコフインスツルメンツ	720
眼科用モノフィラメント ナイロン縫合糸	外科専門	A7756N
はさみ	ファインサイエンスツール	150000-08
血管チャンバー	DMT	VAS v.2.1