Method Article

顕微鏡を用いたひと脂肪組織血管機能評価

DOI:

10.3791/56079

⸱

September 29th, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Medicine and Whitaker Cardiovascular Institute, Boston University School of Medicine

In This Article

Summary

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ビデオ顕微鏡システムは、生理学的および薬理学的刺激への反応で分離脂肪細動脈の機能特性を調べるに使用されます。この手法は、肥満人間で異なる脂肪組織ドメインにおける微小血管表現型を確認する使用できます。

Abstract

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肥満が代謝と心血管の病気の開発に密接にリンクしている、これらのプロセスを支配するメカニズムについてはほとんど知られています。それはローカルおよび全身、中央/腹部内臓脂肪蓄積との関連で特に脂肪組織から解放 pro 動脈硬化のメディエーターが病原性の血管の変化を促進して心血管疾患があります概念仮説は、脂肪組織の機能不全の結果は、進化し続けます。ここでは、生きているヒトの脂肪のデポから削除そのままの小さな人間の細動脈の血管拡張と血管収縮反応の分析を含むビデオ顕微鏡のユニークな方法をについて説明します。顕微鏡を使用して、薬理学的または生理学的な刺激の体内の条件を模倣する圧力システムを使用して分離された微小血管の機能プロパティを確認します。テクニックは、病態と脂肪組織環境のローカルの血管機能不全に寄与する分子メカニズムの理解を得るための便利な方法です。また、脂肪組織の血管の異常は、全身疾患にリンクされています。肥満者のデポ固有血管反応を調べるためにこの手法を適用した.増加の流れと同じ個体から肥満症治療手術の中に 2 つの異なる脂肪倉庫から分離した脂肪細 (50 350 μ m の内径、長さ 2-3 mm) におけるアセチルコリンの両方に内皮依存性血管拡張反応を検討しました。内臓脂肪から細動脈が皮下のデポから血管と比較して内皮依存性血管拡張反応を示すデモンストレーションを行った。内臓の微小環境の臨床的観察: 全身性疾患メカニズムに内臓脂肪の増加をリンクに関連すると思われる血管内皮機能障害に関連付けられているが示唆されました。ビデオ顕微鏡法は、異なる脂肪質のターミナルから血管表現型を調べるだけでなく、肥満と代謝異常の程度が異なると個人間での調査結果を比較する使用できます。血管反応の臨床的介入の長手方向を調べるメソッドを使用もできます。

Introduction

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顕微鏡は、生きているヒトを対象前のヴィヴォから削除小細動脈の血管の機能をみるための便利な方法です。当研究室は、解剖の様々 な脂肪微小血管構築に及ぼす影響を特徴付ける様々 な脂肪組織コンパートメントから小さな血管を重視しています。この手法の主な利点は、血管は人間の体から削除機能が維持され、生検に続く時間に数分以内に容易に調べることができます。生理学的な条件のまねをして着実に経壁圧の生体内での多くの特徴を要約するマイクロ ガラス カニューレを介して腔内空間で管理されます。1,2また、自動エッジ検出ソフトウェアの信頼性の高い顕微鏡の組み立ては分離の内皮依存性および非依存血管拡張と血管収縮能力の質的・量的評価を可能します。物理、薬理学的刺激への応答の生理的評価法を急速にリアルタイムの許可船。3他の微小血管の技術はより時間がかかることし、力変換器により様々 なアゴニストに張力応答を測定する傾向がある線図法などご利用頂けます。

当研究室では、肥満と脂肪組織の異なるドメインの血管系に及ぼす影響に焦点を当て、血管機能障害との関係を調べるための顕微鏡を適用しています。腹部内臓脂肪の蓄積と中央肥満は、アディポサイトカイン生産・代謝異常・ cardiometabolic リスクに最も密接にリンクされ....

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Protocol

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プロトコルとここで説明した例でボストン大学学校の医学制度審査委員会 (IRB、プロトコル #H-25644) が承認され、ヘルシンキ宣言に従って運営しました。すべての科目は、参加前に文書による同意を提供します

。

1 です。 ソリューションの準備とマイクロ ガラス カニューレ

  1. 4-2-hydrosyethyl-1-piperazineethanesulfonic 酸塩 (HEPES) 解決の準備。1 L の溶解 8.059 g NaCl、KCl、0.298 g 0.296 g MgSO 4 • 7 H 2 O は、0.235 g CaCl 2 • 2 H 2 O、0.16 g KH 2 PO 4, 950 mL の 0.01 g 酸 HEPES 2.383 g、1.081 g グルコース、EDTA 脱イオン水。脱イオン水で 1 L にボリュームを構成します。NaOH を使用して 7.4 に pH を調整します。4 の 7 日間に HEPES バッファーに格納できる ° C
  2. は、Salt のバッファー在庫 x 20 を準備します。1 L 追加 143.8 g 塩化ナトリウム、KCl 7.0 g、5.9 g MgSO 4、7.4 g CaCl 2

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Results

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当研究室は内皮依存性を調べる顕微鏡を使用し、-肥満人間の皮下脂肪および内臓脂肪から分離した脂肪組織の細動脈の vasocontractile 関数と同様に、独立した血管拡張。特性の実験の設定は、図 1 aに表示されます。脂肪組織の細動脈は 2 つガラス毛細管ピペットの間中断され、図 1 bに示すように、臓器のチャンバー内縫合糸の場所に固定します。眼底の応答することができます基準径 (図 2 b) ~ 55% に ET 1 と前の収縮が続くし、アゴニストによるベースライン (図 2 a) で船を調べることによってそれから査定するセクション 5.1 で説明しました、血管拡張と図 2のように、血管の内腔のリラクゼーション。

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Discussion

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郭清と脂肪細動脈周囲組織からの分離は、ディテールとプロトコルの技術に細心の注意と時間のかかり、労働集約的なプロセスをすることができます。レーザーマイクロダイ セクション手順細心の技術と平滑筋や内皮細胞の潜在的な損傷を防ぐ特殊な解剖器具細胞、血管の層が必要です。細動脈の壁にも、小さな偶然穿刺は、腔内加圧と失敗した実験の結果を防ぐことができます。また、縫合糸を利用した細動脈の穿刺は、容器の両端にガラス毛細管ピペット チップ間細動脈をセキュリティで保護することが重要です。

人間の孤立した血管は、60 mmHg で加圧の 30-40 分後自発筋トーンを開発できます。ただし、人間の脂肪細サイジング 50-350 μ m 内部内腔の直径が血管の平滑筋の疎層で比較的小さく、骨格筋細動脈と比較して有意な筋トーンを開発しない傾向があることがわかった。我々 はこのように、これらの小さな細血管拡張薬への暴露前に ET 1 を使用して前の収縮を誘発します。エ 1 がより予測可能な収縮反応を発揮するいくつかのケースであるかもしれない間変動のフェニレフリンなどの α 受容体作動薬の反応がわかります。希望 ~ .......

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Disclosures

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著者情報開示やレポートに利害の対立があります。

Acknowledgements

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著者らは、これらの研究と脂肪組織生検を提供するボストン医療センターの外科スタッフに参加するためのボランティアに感謝したいと思います。博士 Gokce は、HL081587、HL114675、および HL126141 の健康 (NIH) の助成金の国立衛生研究所によってサポートされます。博士ファーブは NIH 支え K23 HL135394 を付与します。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
化学名
アセチルコリンSigma AldrichA6625
塩化カルシウム(CaCl2)Sigma Aldrich223506
D-(+)-グルコースSigma AldrichG5767
エンドセリン-1Sigma AldrichE7764
エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-テトラ酢酸(EGTA)シグマアルドリッチE3889
エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)シグマアルドリッチE9884
HEPESシグマアルドリッチH3784
Nw-ニト-L-アルギニンメチルエステル塩酸塩グマアルドリッチN5751
硫酸マグネシウム (MgSO4)Sigma AldrichM7506
塩化カリウム (KCL)Sigma AldrichP3911
リン酸カリウム (KH2PO4)Sigma AldrichP5655
PapaverineSigma AldrichP3510
重炭酸ナトリウム (NaHCO3)Sigma AldrichS6014
ナトリウム(NaCl)Sigma AldrichS7653
ナトリウム一塩基性一塩基性一水和物(NaH2Po4)Sigma AldrichS9638
名前会社カタログ番号コメント
Equipment
Forceps Finescienceツール15000-08
倒立顕微鏡ツァイスアクロマー
実験用チューブEuro-Pharm250100306F999
ニードル/ピペットプーラーデビッドコフインスツルメンツ720
眼科用モノフィラメント ナイロン縫合糸外科専門A7756N
はさみファインサイエンスツール150000-08
血管チャンバーDMTVAS v.2.1
シ塩化リン酸ト

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96 (4), 313-326 (1999).
  2. Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Res....

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