方法論記事

巨大リポソームの膜カーボンナノ チューブを引っ張ってください。

DOI：

10.3791/56086

⸱

2017年12月7日

 ,  ,  , 
1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR168, 2Department of Genetics and Complex Diseases, T. H. Chan School of Public Health, Harvard Medical School, 3Department of Cell Biology, Harvard Medical School, 4Sorbonne Universités, UPMC University Paris 06, 5Center for Studies in Physics and Biology, The Rockefeller University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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多くのタンパク質の細胞感覚し、膜の曲率を誘発します。湾曲した膜体外タンパク質または任意曲率活性分子の相互作用を研究する脂質小胞から膜ナノチューブをプルする方法について述べる。

要約

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細胞膜の再編は、エンドサイトーシス、人身売買、糸状等の形成など多くの細胞現象の不可欠な部分です。多くの異なった蛋白質に関連付ける曲面膜感覚または膜の曲率を誘発する能力のため。通常、これらのプロセスは複雑すぎるために、細胞の定量的研究し蛋白質の多数を含みます。エンドサイトーシスの首などの曲線の細胞構造を模倣した、曲線状の膜の in vitro再構成するプロトコルについて述べる。巨大リポソーム (GUV) 小嚢は、ピペット吸引がその内部圧力と表面張力を制御、細胞膜のモデルとして使用されます。光ピンセットによる旦那のポイント引き力を適用するには、平膜に接続されている高曲率のカーボンナノ チューブが作成されます。このメソッドは、曲げ剛性などの脂質膜の基本的な機械的性質を測定する伝統的に使用されています。近年、タンパク質が膜の湾曲や形状および膜の力学に影響する方法と対話する方法の研究に展開されています。マイクロマニピュレーション、マイクロインジェクション、光ピンセットと共焦点顕微鏡を組み合わせたシステムは、膜の曲率、膜張力および蛋白質の表面密度の測定を同時にできます。これらの測定からタンパク質膜システムの多くの重要な機械的および形態学のプロパティを推測できます。さらに、我々 は生理的塩濃度および分類された蛋白質と脂質の蛍光強度から膜タンパク質の表面密度を定量化する手法の存在下で膜を作成するプロトコルをレイアウトします。

概要

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エンドサイトーシス、人身売買、糸状、感染症などの形成など多くの細胞プロセスは細胞膜1,2という形で劇的な変化を伴っています。セルで、いくつかの蛋白質は膜にバインドし、その形状を変更するこれらのプロセスに参加します。最も顕著な例は、本質的にドメイン3,4,5,6,7バー曲線特性を含む箱/アンフィフィシン/Rv (バー) 蛋白質家族のメンバーです。通常、彼らは表面と、多くの場合、両親媒性ヘリックスを 2 層も浅く挿入バー ドメインを付着する膜と対話します。形状、サイズ、および両親媒性ヘリックスの数と共に BAR ドメインの料金を決定します: (1) 膜の湾曲の方向 (すなわち、かどうか彼らは陥入や突起を誘発するが)、(2) 膜の大きさ曲率5,8。注記のうち、ここで正の曲率は曲線状の膜、すなわち、相互作用する粒子と負の膨らみのそれ....

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プロトコル

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1 Pt 線の Electroformation によって膜の作製

  1. Electroformation の洗浄 (導入および図 1A参照) と Pt-ワイヤ エタノールや脂質を洗い流すためアセトンなどの有機溶剤と水で塩を洗い流す。
    注: 私達は徹底的にエタノールに浸したティッシュでふき取り、アセトン、エタノール、水、5 分ごとで sonicating を提案します。
  2. 1 mg/mL のクロロホルムで必要な脂質の脂質ミックスを準備します。ミックスが含まれてする必要があります 〜 ビオチンと結合して脂質のモル分率を 0.05% (例えば1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]) と 〜 0.5%、脂質のモル分率は、fluorophore (共役例えば、BODIPY TR-C5 セラミド)。
    注: 我々 の経験では難しかった 30% 以上を含む高収率で膜を生成する脂質を充電します。
    注意: クロロホルムは、適切な手袋を着用化学フード内部処理必要があります。
  3. Electroformation 室に Pt ワイヤのペアを挿入します。滴で区切られた白金線に脂質ミックスを預金 〜 2 〜 3 mm (合計 〜 ミッ....

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結果

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チューブを抜く実験膜に関する重要な力学的情報を与えることができます。旦那50,51 から引き出されたチューブ式のタンパク質や他の分子膜膜曲率を持つカップルを強制的に、Canham Helfrich ハミルトニアンを用いた膜張力チューブの半径を関連付けることができますがない場合

figure-results-1(関係式 1)

どこfigure-results-2膜管、曲げ剛性、

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ディスカッション

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膜からチューブを抜く方法、膜蛋白質システムに豊富な情報と、膜の基本的な機械的性質を測定するための手段だけではないが、タンパク質や膜間の結合に光を当てること曲率。サブミクロン リポソーム表面パッシベーションされた18,19につながれたと蛋白質をインキュベートするか観察することによって、タンパク質の膜カーブの効果を測定する他の技術が存在する導入部分で説明したように、尿細管ピペット吸引膜タンパク質20,21の注入の自発的形成。ここで説明した方法は、蛋白質密度、膜張力膜力など、同時にシステムの重要な物理的な測定値を提供するユニークなエンドサイトーシス幾何学的な直接接続を提供します。

メソッドの重要な制限はそれが構築し、試金に関連するすべてのコンポーネントを調整する簡単ではありません。しかし、共焦点顕微鏡の組み合わせ中、光ピンセットとマイクロマニピュレーション.......

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

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著者は、ブノワ ・ ソール、ダミアン キュヴリエ、ピエール ・ Nassoy、フランソワ Quemeneur、グループでカーボンナノ チューブ法を確立するギル Toombes 彼らの本質的な貢献のためにありがとうございます。脱法属する CNRS コンソーシアム CellTiss、Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038)、およびパリ科学 et レトル (ANR-10-アイデックス-0001-02)。F. C. ツァイ エンボ長期フェローシップ (ALTF 1527-2014 年)、マリー キュリー アクション (H2020 MSCA-場合 2014、プロジェクト膜・ エズリン アクチン) によって資金を供給されました。修士はシモンズの仲間社会短期やつです。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン(DOPC)Avanti850375図3のデータで使用されている脂質の例
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[ビオチニル(ポリエチレングリコール)-2000] [DSPE-PEG(2000)-ビオチンAvanti880129ビオチン化脂質
BODIPY-TR-C5-セラミドMolecular Probes (ThermoFisher)D7540蛍光脂質
BODIPY- FLC5-ヘキサデカノイルホスファチジルコリン(HPC*)分子プローブ(サーモフィッシャー)タンパク質密度校正
卵L-&α用蛍光脂質 L-&α;-ホスファチジルコリン(eggPC)Avanti840051チューブ半径定数の校正に使用されます
&β;-牛乳(>99%)からのカゼインシグマAldrichC6905実験チャンバー
スクロースSigma AldrichS7903
D(+) グルコースSigma AldrichG7021
NaClSigma AldrichS7653
トリスSigma Aldrich10708976001
浸透圧計Losern/a
Ptワイヤー、直径0.5 mm、純度99.99%Goodfellow USAGUV電気形成
機能発電機n/aGUV電気形成
パテシーラントVitrex(CMLフランスから)CRIT 140013電気形成チャンバーをシールするために使用される電気形成チャンバー
バスソニケーターn/ a形成チャンバーをきれいにするのに役立ちますが、重要ではありません
ニコンTE2000倒立顕微鏡、eC1共焦点システム(ニコン)、2本のレーザーライン(&λ; = 488 nmおよび543 nm);5Wイッテルビウムファイバー連続波レーザー(&ラムダ>1070nmによって誘導された光ピンセット;IPG GmBH Germany)
、ホ
ウケイ酸キャピラリー(内径0.78mm、外径1mmHarvard apparatus30-0036
micropipette pullerSutter InstrumentP-2100
microforgeNarishigeMF-800
圧電アクチュエータPhysik Instrumenten / a
ポリスチレンストレプトアビジンコーティングビーズ(直径3.2&マイクロ;m)スペロテックSVP-30-5
]マイクロピペットの不動態化に使用されるに使用されるPT005139 を電気光ピンセット、マイクロマニピュレーター)を搭載した共焦点顕微鏡システムの一例

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
  2. Johannes, L., Wunder, C., Bassereau, P. Bending "on the rocks"--a cocktail of biophysical modules to build e....

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