方法論記事

生産、結晶化、および人間 IKK1/α の構造決定へのガイド

DOI：

10.3791/56091

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2018年11月2日

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1Department of Chemistry & Biochemistry, University of California, San Diego, 2Department of Biophysics, Bose Institute

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IκB キナーゼ 1/α (IKK1/α CHUK) は主に転写因子の NF-κ B の活性化を介して細胞活動の無数に関係するセリン/スレオニン蛋白質キナーゼ。ここでは、生産、この蛋白質の結晶構造解析に必要な主な手順について述べる。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞外刺激のクラスには、NF-κ B サブユニット、p52、その前駆体の p100 の処理による生成を誘導する IKK1/α の活性化が必要です。p52 ホモまたはヘテロダイマー別 NF-κ B サブユニット、RelB ととして機能します。これらの二量体はターンでは何百もの炎症、細胞生存率、細胞周期に関与する遺伝子の発現を調節します。IKK1/α 三元複合体として主に IKK2/β とネモに関連付けられたままです。しかし、それの小さなプールがまた低分子量 complex(es) として観察されます。P100 処理アクティビティが大きく内 IKK1/α の活性化または小さい複雑なプールによってトリガーされる場合は不明です。IKK1/α の構成アクティビティがいくつかの癌や炎症性疾患で検出されました。IKK1/α の活性化のメカニズムを理解し、創薬のターゲットとしての使用を有効にする、我々 は大腸菌など、別のホスト システムでの組換え IKK1/α を表明した昆虫および哺乳類細胞。成功したバキュロ ウイルスで水溶性 IKK1/α を表現する感染昆虫細胞、非常に純粋な蛋白質の mg 量を取得、阻害剤の存在下で結晶化、x 線結晶構造を決定します。ここでは、組換えタンパク質、その結晶の x 線結晶構造解析を生成する詳細な手順について述べる。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

二量体転写因子の NF κ B 家族の転写活性は、炎症と免疫生存と死に至るまで多様な細胞機能に必要です。これらの活動は、細胞と自己免疫疾患や癌1,2,3を含む様々 な病理学の条件に規制つながるの損失に厳しく制御されます。刺激がないと、NF-κ B の活性抑制 IκB (κ B の阻害剤) 蛋白質4で保持されます。IκB タンパク質特定 Ser 残基のリン酸化ユビキチン化とそれに続くプロテアソームまたは選択的処理5のマークを付けます。セリン/スレオニンの 2 つの高い相同性キナーゼ IKK2/β と IKK1/α はこれらのリン酸化イベント6、7の遂行によって NF-κ B の活動の調節因子として機能します。

リガンドと受容体の相互作用は、一連の仲介因子 NF-κ B の活性化につながる信号をペリプラズムします。NF-κ B シグナル伝達プロセスは、2 つの異なる経路-正規と非正規 (代替)8に広く分類できます。IKK2/β の活動は主に、炎症性と生得免疫応答9に不可欠な標準的な経路の NF-κ B シグナル伝達を調節します。この経路の特徴はこれまで生化学メタボライト IKK 複雑な内 IKK2/β10の迅速かつ短時間活性化-IKK1、IKK2、規制成分、ネモ (NF-κ B 重要な変調器で構成されると推定)11,12,13。IKK 複合体の 2 つの触媒 IKK サブユニット、間 IKK2 主担当です14原型 IκBs (α ・ β ・ γ) の特定の残基のリン酸化のため NF-κ B とも非定型の IκB 蛋白質にバインド NF-κB1/p105 である、NF-κ B p50 サブユニット5の前駆体。リン酸化によるユビキチンとプロテアソームの IκB (または p105 の処理) がリリースと NF-κ B 二量体15の特定のセットの活性化に 。IKK2 の誤規制機能による異常な NF-κ B 活性は、自己免疫疾患2,3,16のように同様に多くの癌で観察されています。

IKK2/β と対照をなして IKK1/α の活動は、NF-κ B が開発と耐性のために不可欠である非正規の経路のシグナル伝達を調節します。IKK1 は、C 末端 IκBδ のセグメントについては、その処理と p52 の生成につながる NF-κB2/p100 の特定残基を廃止します。転写活性状態 p52:RelB ヘテロダイマーの形成発達信号7,17,18,19,20をゆっくりと持続的な応答を開始します。興味深いことに、この経路の中央 NF-κ 係数 p52 の世代はもう一つの要因は、NF-κ B を誘発するキナーゼ (NIK)21,22ではなく、IKK2 またはネモに大きく依存します。静止期細胞のニックのレベルがその一定のプロテアソーム依存低下23,24,25により低いまま。'非正規' の配位子と特定の悪性の細胞で細胞の刺激、ニック化を採用して IKK1 をアクティブにするが安定/ニック ・ IKK1 α キナーゼ活動が p527に p100 の効率的な処理に不可欠であります。IKK1 とニックはに対する 3 セリン (Ser866、870 と 872) NF-κB2/p100 の処理と p52 の世代につながる、C 末端 IκBδ セグメント上です。非正規の経路の異常な活性化は、多発性骨髄腫26,27,28を含む多くの癌に関与しています。

IKK2/β のいくつかの非常に効率的かつ特定阻害剤が知られているが、どれもはこれまで有効な薬剤であると判明しています。対照的に、IKK1/α-特定の阻害剤は、まばら。これは、部分的に構造および生化学的 IKK1/α、セル、および合理的な薬剤設計の IKK1 によって NF-κ B の活性化の機構の基礎を理解することについての私達の欠如から幹があります。IKK2/β の x 線構造は、IKK2/β29; の活性化機構への洞察を提供してくれましたしかし、これらの構造がどのように異なる上流の刺激を明らかに IKK1/α または IKK2/β NF-κ B 活動30,31の異なるセットを規制するためのアクティブ化をトリガーします。IKK1/α の異なるシグナル伝達関数の基になる機構の基礎を理解して、合理的な薬剤設計のためのプラットフォームを確立するには、我々 は IKK1/α の構造決定に焦点を当てた。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 大規模な IKK1/α 発現に適した遺伝子組換えウイルスの作製

  1. P1 ウイルス作製32
    1. 1 日目: プレート Sf9 細胞 (10 X 6 〜5) (通路番号 10 未満) 各 Sf900 III 昆虫細胞用培地 2 mL に 6 ウェル プレートのもし、27 ° c. で孵化させなさい6 〜 10 倍の密度で新鮮なメディアに希釈することによって懸濁液 mL あたり 2 に 3 X 10 の6セルの密度に達すると細胞の通路5。
    2. 2 日目: は、抗生物質や血清なし Sf900 III またはグレースの昆虫の中の 100 μ L の Sf9 トランスフェクション試薬の 8 μ L を希釈します。渦は簡潔に。
    3. 希釈 1 μ g (' 代表結果」で詳細に説明) キット精製組換えバクミドの別々 のチューブで、同じ媒体の 100 μ L 別に32 。
    4. 希釈した DNA とトランスフェクション試薬 (総量 ~ 210 220 μ L)、結合し、15-30 分の室温で孵化させなさい。
    5. 井戸からメディアを削除します。抗生物質や血清せず新鮮な媒体の 1 つの mL を追加します。
    6. セルに滴下希薄 DNA トランスフェクション試薬の混合物を追加します。ドロップ サイズを調整して、それはない付着細胞を遊離させます。
    7. 〜 6 時間後上新鮮な媒体の 1.5 mL を追加または媒体を削除し、新鮮な媒体の 2.5 mL を追加します。加算の前に、25-27 ° c の暖かい新鮮な媒体。
    8. 27 ° C で細胞をインキュベートします。ウイルス感染の兆候を定期的にすべての 〜 12 h 井戸を確認します。すべての Sf9 メンテナンスと 27 ° C で式を行う
    9. 5 日目: セル 60 72 h ポスト感染を含む培地を取り出します。500 x g と 4 ° C で 5 分間遠心の上清を保存します。これは P1 ウイルス ストックです。-80 ° C で小さい因数を凍結します。
  2. P1 ウイルス複製を表現する最高の選択。
    1. 手順 1.1 で記述として同様に細胞をプレート。
    2. メッキ、日 〜 6 h の次のポストは、さまざまな坑井の 20 μ L と異なる P1 ウイルス クローン株細胞の 50 μ L を追加します。
    3. 穏やかなピペッティングによる付着性のセルを追放し、500 x g と 4 ° C で 5 分間遠心分離によって感染させたセル 60 72 h ポスト感染を収穫上清を保存します。これは、P2 のウイルス ストックです。-80 ° C で在庫の小さい因数を格納します。
    4. 収穫した細胞ペレットに 100 μ L の 2 x Laemmli SDS バッファーを追加します。時の熱 > 95 の ° C で 10 分間遠心分離 (通常 > 10,000 x g) 5 分。
    5. 染料前ゲルの底に達するまで 120-160 V の 8-10 %sds ページの各サンプルの 10-15 μ L を実行します。
    6. 電気伝達標準セミドライによる解決の蛋白質転送プロトコル (20 V, 30-45 分) 硝酸セルロース/PVDF 膜に。
    7. 抗 IKK1 抗体を用いたしみ (希釈 〜 1:2, 000 最適化する必要があります) または抗 PentaHis 抗体 (希釈 〜 1:3, 000 最適化する必要があります) 式の。
    8. 組換え IKK1 の表現を比較することによって最高の P1 ウイルス複製を選択します。
  3. 大規模 P3 ウイルス ストックの準備。
    1. 同様に手順 1.1 Sf900 III 媒体の 25-30 mL を含む 15 cm プレートに記載されている細胞。
    2. 〜 6 h ポストめっき、セルに最高表現する P1 ウイルス株の 150-300 μ L を追加します。
    3. 72 時間後の感染症を投稿、(滅菌)、適切な管のプレートから慎重に培地を吸引および 4 ° C で 10 分間 500-1000 X g でチューブを遠心分離(1 つが形成される) 場合、細胞ペレットを破棄し、上清を保存します。これは P3 ウイルス ストックです。
  4. 大規模な蛋白質の表現のための最適なウイルス力価を決定します。
    1. 1.1 6 ウェル プレートでの説明に従って、Sf900 III 中の 2 mL の細胞。
    2. 20、30、40、および別のウイルス株井戸 〜 6 h ポストめっき P3 の 50 μ L を追加します。感染のコントロールが含まれます。
    3. それぞれよく 48 60 h ポスト感染から細胞を採取します。
    4. 2 X 塩化物イオンと SDS バッファーの 100 μ L を追加します。時の熱 > 95 ° C 10 分 (通常 14,000 x g) で 5 分間遠心します。
    5. 8-10 %sds ページのゲルの各サンプルの 10-15 μ L を解決します。
    6. 1.2.6 で述べたように、ニトロセルロース/PVDF 膜に解決の蛋白質を転送します。
    7. 抗 IKK1 抗体を用いたしみ (希釈 〜 配分を最適化する必要があります) または抗 PentaHis 抗体 (希釈 〜 1:3000 を最適化する必要があります)。
    8. 大規模な表現の力価を表現する最高のウイルスを使用します。

2 タグ付きの 6 x 彼の大規模な式人間 IKK129,33

  1. 懸濁培養における大規模な表現を行います。1 l Sf900 III ベント キャップを 2 L の三角フラスコ中のセルを分割します。細胞密度は、5 〜 105セル/mL x をする必要があります。
  2. ~ 2 日間 1-2x 106/mL の濃度に達するまでのシェーカーに 27 ° c ~ 100 rpm の懸濁液のこれらのセルを成長します。細胞密度に 2 x 106/mL を超えることはできません。
  3. 1.4 で評価した P3 ウイルスの希望の金額を追加します。
  4. シェーカーに 27 ° c ~ 100 rpm で 48-60 h の感染の文化を育てます。
  5. 遠心分離によって細胞を収穫 < 4 ° C で 1,500 × g
  6. 細胞ペレットを保存し、培地を除去します。
  7. 蛋白質の浄化に直接進みます。フラッシュは、液体窒素で将来使用するため-80 ° c ストア細胞ペレットを凍結します。

3. 彼 IKK133の浄化

  1. 1 日 40 mL の溶解バッファーで細胞ペレットを再懸濁します (25 mM Tris pH 8.0、0.2% NP 40、200 mM の NaCl、10 mM のイミダゾール、10% グリセロール、5 mM β-メルカプトエタノール、およびプロテアーゼ抑制剤のカクテル)。
    注: ウェット細胞ペレット質量を特定できませんでした。通常、文化の ~ 2 L はこのステップの使用だった。
  2. 60-70% デューティ サイクルの間隔で 30 秒の期間の 5-10 パルスで超音波処理によって、細胞を溶解 > 1 分、細胞懸濁液を保つチルド氷の上。
    注: この手順には、超音波発生装置の各モデルの最適化が必要です。サンプル 10 ° C 以上のウォーム アップをさせてください。
  3. 4 ° C の 45 分の ≥ 28,000 × g で遠心分離によってライセートを明確します。
  4. 4 mL の Ni NTA Agarose 樹脂換散バッファーと明らかにしミックス ライセート (清) 次の製造元のプロトコルを平衡します。
  5. 4 ° C の部屋でロータリー ミキサー上で 2 時間インキュベートして樹脂をバインドするタンパク質を許可します。
  6. 30 mM のイミダゾールを含む換散バッファーで樹脂を徹底的に洗います。ブラッドフォードの試金を使用して定期的に洗浄分数の蛋白質の集中を確認します。洗浄洗浄画分におけるこのタンパク質濃度 0.1 mg/mL に達するまで。通常このポイントに到達する > 20 ベッド洗浄バッファー量が必要です。
  7. 20 mL の溶出バッファー (250 mM のイミダゾールを含む換散バッファー) を用いた重力流の下で IKK1/α の彼の付けられた蛋白質を溶離する。1 1.5 mL の一部分を収集します。
  8. 塩化物イオンとバッファーと混合のすべての分数から 5-10 μ L のサンプルを読み込んで、8 または 10 %sds ページのゲルの溶出蛋白質の純度を確認してください。
  9. ピーク画分 (濃度 ≥ 2 mg/mL)、プールし、ブラッドフォードの試金を使用して蛋白質の集中を測定します。
  10. (1:30-50 (TEV プロテアーゼ: IKK1)) TEV プロテアーゼ一晩 (≥12 h) 4 ° C でのダイジェストします。
    注: 最適化に必要な TEV プロテアーゼの量の 6 X 彼タグ先験的(≥ 95%) 消化を完了します。TEV プロテアーゼは、家の中で浄化されました。
  11. 2 日目の朝、27 ° C で 1 時間 1 mM ナトリウム バナジン NaF、10 mM、20 mM の β-グリセロリン酸 20 mM MgCl2の存在下で 1 mM ATP をもつタンパク質を孵化させなさい。
  12. 0.45 または 0.22 μ m のフィルターを通して蛋白質の解決をフィルターします。
  13. 自動液体クロマトグラフィー システムに接続されている 〜 120 mL 分取サイズ排除カラムにサンプルの 6 mL をロードします。バッファー A のコラムを平衡させ (20 mM トリス-HCl (pH 7.5) 150 mM の NaCl、5 mM DTT、5% グリセロール)、蛋白質のサンプルを適用する前に。
    注: 小さい列は、Ni NTA アフィニティ精製ステップの後タンパク質の収量によって提示される可能性があります。調整/列ボリュームの 5% に負荷量を計算)。
  14. 1 mL/分の流量でサイズ排除クロマトグラフィーを実行し、280 と 254 nm で溶出を監視します。2 mL サイズの分数を収集します。
  15. ピーク画分の純度を確認してください (通常約 60 〜 70 mL) 8-10 %sds ページのゲルの。
  16. 純粋な分数 (≥0.5 mg/mL の濃度と純度 ≥95%) をプール、10 kDa または製造元の指示に従って 30 kDa 分子量カットオフ遠心タンパク質コンセントレーターに集中。
  17. 定期的にブラッドフォード法による濃縮物のタンパク質濃度をチェックし、8-12 mg/mL までサンプルを集中します。
  18. 25 μ 因数および液体窒素中で凍結を分配します。-80 ° C のフリーザーにこれらのフラッシュの凍結試料を保存します。

4. IKK1 の結晶化条件の画面

  1. 画面の結晶は以下の以下の手順に必要なタンパク質の (ボリューム) で合計金額を計算します。
  2. 異なる阻害剤を試す (一般的なキナーゼ阻害剤: AMPPNP、およびスタウロスポリン;IKK-specific 阻害剤: MLN120B、化合物 A 及び IKK 阻害剤 XII) 結晶のスクリーニングを実行します。製造元の指示に従ってこれらの化合物の溶液を作る。その原液の化合物の最大の濃度が 20 μ M を超えていないことを確認します。
  3. 200 μ M の阻害剤、IKK1 の混合の 100 μ M で結晶化画面の複雑な IKK:inhibitor を準備し、30-40 分でこの混合物を遠心分離機の 18-20 ° C で孵化させなさい > 常温で 2 分間 15,000 × g。結晶化画面の上清を保存します。
  4. (材料の表を参照してください) 市販結晶化画面を使います。
  5. 96 ウェル プレートの貯水池にマルチ チャンネル ピペットやロボットなどを使用して各結晶化試薬 (液)、80-100 μ L をピペットします。プレートは、滴を設定する準備が整いました。プレートが結晶化 2 に 3 滴を収容する、2 に 3 の阻害剤は単板で上映されることができますを確認します。
  6. 0.2 – 0.25 をミックスし、結晶化ロボットを使用して、複雑な IKK1:inhibitor の貯留層ソリューションの同じボリュームの μ L。
    注: スクリーニングは大量のドロップを使用して手動でを実行することができます (0.5 〜 1.0 μ IKK1:inhibitor 複雑な貯留層ソリューションの同じボリュームで)。ただし、ロボットの使用は、貴重な試薬保存に役立つでしょう。
  7. 蒸発を避けるために光学的に透明フィルムと滴を設定した後すぐにプレートをシールします。正しく適切なアプリケーターを使用してシールします。各阻害剤セットのレプリカ プレートを作る。18 の ° C と冷蔵室 (温度範囲 〜 4-6 ° C) で他に 1 つのプレートを孵化させなさい。インキュベーターは、振動の影響を受けないことを確認します。
  8. 偏光顕微鏡を使用して、外観の各ドロップで結晶の毎日最初の 7 日間、長い間隔でチェックします。体系的に注意してください、これらの観察結果をスコアします。
    注: では、顕微鏡を使用して偏光板と、結晶の成長欠陥を視覚的に評価することができます。ここでは、結晶が現れた状態で貯留層のソリューションが 3 w/v デキストラン硫酸ナトリウム塩 Mr 5,000、0.1 M を含まれるビシン pH 8.5、15 w/ポリエチレング リコール 20,000 v。IKK1 結晶成長 XII IKK 阻害剤の存在下でのみ。

5. 結晶成長最適化29,33

  1. 貯蔵液の準備。
    1. 異なる分子量 (平均 MW 5,000、8,000、15,000、40,000 Da) 脱イオン H2o. フィルター ソリューション 0.22 μ m のフィルターを使用してのデキストラン硫酸の 30 %w/v ソリューションを準備します。
    2. 6.5 に 9 の pH の範囲の異なるバッファーの 1 M と 0.5 M の在庫を準備します。0.22 μ m のフィルターを使用して、ソリューションをフィルター処理します。
    3. 異なる分子量の PEG 溶液の 25% または 50% (w/v) を準備 (平均 MW:1000、1,500、3,350、4,000、6,000、8,000、10,000、12,000、20,000 Da)。0.22 μ m のフィルターを使用して、ソリューションをフィルター処理します。
    4. 体系的に pH、バッファーの種類、濃度、およびペグとデキストラン硫酸の両方の種類を変えることによってグリッド画面を実行します。
  2. 18 ° c と (温度範囲 4 ~ 6 ° C) の低温の室内でのスクリーニングを最適化します。
  3. 複雑な IKK1:Inhibitor の同量を混ぜてよくソリューションと密封された環境でよくソリューションを孵化させなさい。この手順を手動で実行することができますまたはディスペンス ロボットを使用しています。
    注: ここでは、最大かつ明確に定義された結晶 (均一な成長を示されている偏光板の下で均一な色によって評価される)、次の条件下で得られた: 100 mM BisTris pH 7.0, デキストラン硫酸 (平均 MW 15 kDa) 8.5 10% ペグ 20 2.8 3.5%部屋が寒い kDa。

6. 多数の結晶の成長

  1. 次の貯蔵液の準備し、0.22 μ m フィルターを通過。
    1. 0.5 M BisTris pH 7.0 と BisTris プロパン pH 7.0 および 7.5 を準備します。
    2. 30% (w/v) デキストラン硫酸 (平均 MW ~ 15 kDa) を準備します。4 ° C でのストア
    3. 50% を準備ペグ (平均 MW ~ 12 kDa)。
  2. 使用も 24 には、ドロップ プレートがぶら下がっています。
  3. 各ウェルの上げられたリングにグリース シール剤を適用します。
  4. (最終濃度) 次のようにもソリューションの準備: 100 mM BisTris pH 7.0-7.5、2.8-3.5% デキストラン硫酸 〜 15 kDa 8.5-10% 〜 12 kDa のペグします。1.5 mL チューブに 1 mL もソリューションを準備します。
    注: 結晶化条件のマイナーなバリエーションは、蛋白質、および/またはデキストラン硫酸のバッチによって観察された、従って狭い範囲の試みをお勧め。BisTris と BisTris の両方同じ pH 範囲のプロパン バッファー単結晶の降伏。
  5. 少なくとも 1 時間冷蔵室でよくソリューションと油を塗ったプレートを維持します。
  6. 4.3 で説明されているように複雑な IKK1:Inhibitor を準備します。1.5 mL チューブから 24 well プレートの個々 の井戸にもソリューションを転送します。
  7. きれいなケイ化 (市販または社内 (ケイ/シリル化)) 糸くずのワイプを使用してカバー スリップをガラスし、市販のエアゾール ダスターを使用して正確に高圧空気噴流を適用します。
  8. きれいなカバー スリップにもソリューションの 1 – 1.5 μ L を配置します。複雑な IKK1:inhibitor の等量のピペット、上下にピペットで穏やかに混合 3-4 回。ガラス製カバー スリップを回すし、鉗子でもそれぞれにグリースの押すことによって井戸を封印します。
  9. 24 ウェル プレートのすべての滴を設定した後は、暗闇の中で冷蔵室でプレートを孵化させなさい。時折外観と結晶の成長のための顕微鏡下でドロップを確認してください。
    注: それはテストされていない結果を変えると光の下で結晶板を孵化するかどうか。しかし、プレートが最小/いいえ振動がある環境で培養が重要です。

7. 低温結晶の保護

  1. 低温溶液の調製。
    1. クライオ A を用意 (~ 2% デキストラン硫酸、~ 10% PEG 12000、60 mM (同じ pH の目的もソリューションとして)、BisTris プロパン 5 mM Tris pH 7.5、40-50 mM NaCl、2.5% グリセロール)。
    2. クライオ B を準備 (~0.3% ~ 10% デキストラン硫酸ペグ 12000、60 mM (同じ pH の目的もソリューションとして)、BisTris プロパン 5 mM Tris pH 7.5、40-50 mM NaCl、20 または 25% グリセロールまたは 20 または 25% エチレング リコール)。
      注: は、グリセリン、エチレング リコール (例えば200 のペグ、ペグ 400、MME 550 のペグ、ペグ 1000) に加えて別低温保護をテストします。
  2. 優しく、クリスタルを含むガラス製カバー スリップを取り出し、上向きクリスタル ドロップと固体表面上にそれを置きます。ゆっくりのドロップの上に低温の溶液 10 μ L を追加し、軽くピペッティング水晶は手がつけられないので、ミックスします。
    注: この破片の結晶表面をきれいにし初期低温バッファーと結晶の平衡を助けます。結晶に機械的および熱的ストレスを避けます。結晶への損傷を避けるために顕微鏡下でのすべての後続の手順を実行します。
  3. ゆっくりと結晶からいくつかの液体を削除し、について維持ソリューションの 5-8 μ L。結晶の脱水症状を避けます。機械的ストレスと後続のすべての手順で結晶の脱水症状を避けるために細心の注意を取る。
  4. ゆっくりとドロップにクライオ B 液の 2.5-4 μ L を追加、ピペッティングでとてもやさしく混ぜます。結晶の上直接空気の流れを避けるために小さいペトリ皿でカバーします。5 分の待機は、常に慎重クリスタル浸透圧あるいは脱水症状の急速な変化に苦しむしていません。
  5. ゆっくりと低温の溶液に結晶を慣らす 7.4 手順を繰り返します 4 回します。
  6. この段階では低温電子顕微鏡ソリューションの 10-20 μ L を維持 (すなわち、約 20-25% を浴びるにクリスタルを許可する低温保護剤含んでいるソリューション)。時間 (1 時間 5 分) 最終低温溶液中の異なった期間の間浸漬します。
  7. 異なる時点で複数の結晶を凍結します。
  8. 慎重に適切なベースとプランジ-凍結液体 N2にマウントされている適切なクライオ ループでドロップから単結晶を選ぶ。この手順はスムーズにかつ迅速に氷結晶の形成を避けるために。
    注: は、水晶結晶の最も長い軸よりわずかに大きいループ径を使用して高度な光子源、アルゴンヌ国立研究所で使用されるロボットのゴニオメータでマウントすることができますを選択します。
  9. 浸漬液 N2のいたずら小僧でクライオ ループを含む結晶を格納します。シンクロトロンの x 線回折のための出荷の準備ができるまで、リキッド N2デュワー フラスコにこれらのいたずら小僧を格納します。X 線回折データ収集と処理 (セクション 8 と 9) に進みます。
    注: ホームの x 線源から IKK1 結晶の回折データはなかった構造定量試験は、十分に高い解像度のシンクロトロンで上映されると結晶の品質が示されているが。すべての回折データを事前光子源、アルゴンヌ国立研究所、アメリカ合衆国の異なるビームライン (主に 19ID) で採取。

8. x 線データの収集

  1. リモート データ収集ソフトウェア34を用いた APS のシンクロトロン源の ID19 ビームラインでの x 線回折データを収集します。
    注: 以上 100 の結晶の回折特性のテストされました。5 以外に回折結晶が 7-11 Å、稀だけの解像度に結晶が日常的に回折 Å 4.5 を超えて回折観測、そして唯一の 1 つ大きな結晶をされた Å。結晶は、データ収集中に急速に腐敗、以来同じ結晶のさまざまな部分でデータセットを集めました。結晶が大きいのでこれが可能だった (400 μ m より大きい)、使用されるビーム径が 100 μ m と。

9. x 線データ処理

  1. 同じクリスタル34のさまざまな部分で収集されたすべてのデータセットをマージします。
    注: 7 つのデータセットは、最高の結晶からマージされた結果のデータ完全な 93% であった.全体的な私/σ でした 〜 6.8) Rmerge 最高解像度箱 (5.4 4.5 Å) で 89% であった。
  2. 空間群、単位セルの大きさ、溶剤含有量、および非対称単位の説得力のある構成を取得する HKL200034によるデータセットのプロセス。

10. 構造ソリューション

  1. 検索モデルの準備
    1. HIKK2 の利用可能な構造モデルに基づく (pdb id 4E3C と 4KIK35)、N 末端 KD のさまざまな方向を持つ二量体の系列を生成 (30 と 62 のオープニングをレンダリングする Å、二量体の 2 KD の P578 間)。これらのモデルのどれもは、広汎な試験の後分子置換検索ソリューションを取得します。
    2. 単一粒子の低温電子顕微鏡データ33から IKK1 のマップを生成します。
    3. IKK2 の最高の解像度の構造から人間の IKK1 のモデルの生成 (pdb id 4KIK)。
    4. クライオ EM 密度マップに人間 IKK1 のオオバン36を使用して人間の IKK1 モデルの個々 のドメインをドッキングします。これは KD 向き約 24 度を回転、N 末端 〜 58 Å に開くを変更します。
    5. 10.1.1 で生成されたすべてのダイマーに 70S 装着モデル (単量体) の KD 向きを適用します。
  2. 分子置換
    1. プログラム フェイザー37、MOLREP38と中枢神経系39,40の検索モデルとして 10.1.1 10.1.5 からダイマーを使用します。
      注: ここでは、検索モデルとして 10.1.5 (52 Å オープン) から二量体のいずれかを使用して、6 二量体 (2 hexamers) された非対称単位を使用して配置 MOLREP。検索モデルで開く 52 Å は、洗練された構造の二量体 (すべて 6 二量体) の 49-50 Å 開口部に似ています。

11. 構造精密化

  1. 構造改良の手順
    1. 中枢神経系 (cns_solve_1.3)39,40のリジット ボディの洗練されたによってこの初期モデルの位置や向きを修正します。
    2. さらに最小と最大尤度ターゲット関数と中枢神経系システム39,40を使用してフラット バルク溶媒補正シミュレーテッドアニー リングを用いた構造を絞り込みます。
    3. 2 fOFCと Xtalview41を使用して Fo Fc マップに基づいてモデルを構築します。
      注: 適用電による洗練された42 NCS 抑制モデルの精度を高めるため改良中。確かに、形状と構造の R 要因デン絞り込みが大幅に向上、R 因子 22.2% であったし、無料の R 要因最終的なモデルの 27.8% であった。無料の R の劇的な改善は、IKK2 モデル (4KIK) から生成された IKK1 ドメインの高精度モデルのためする必要があります。

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結果

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IKK1/α の異なる構造体のクローニングと発現
タグ付き IKK1 の N 末端ヘキサ ヒスチジンを取得するその EcoRI とノッティ制限サイト内バキュロ ウイルス発現ベクター pFastBacHTa に人間 IKK1/α のクローンだった完全な長さ。タグは、TEV プロテアーゼ消化によって削除でした。全長 IKK1/α に両端に柔軟な地域が含まれているので、柔軟な地域によってレンダリングに蛋白質通常結晶化することは困難私達 IKK1/α pFastBacHTa ベクトルの上記サイト内の様々 な切り捨てられた断片のクローン作成。IKK1/α のトランケーション変異は、野生型 (wt) と S176E、180E 生成された (EE) バックボーン。IKK1/α EE はリン酸キナーゼの恒常活性フォームの擬態を指します。組換えバキュロ ウイルスの生産と蛋白質の表現をマイナーな修正43 (図 1) で以前に公開されたプロトコルを...

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ディスカッション

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2 つの関連する IKK タンパク質の生産、結晶化・構造ソリューション
IKK2/β タンパク生産、結晶化、構造決定と私たちの経験を与えられる比較的簡単な運動であろう概念と IKK1/α の x 線結晶構造を決定するのに着手しました。ただし、我々 はこれら 2 つの関連蛋白質は結晶化のしやすさに関する非常に異なる振る舞いこと非常に驚いていた。いくつかの知名度の高い所から努力にもかかわらず、IKK1 構造の決定はほぼ 2 年を取った。これは主にいくつかのキーのボトルネックから生じた。

最初の難関は、高純度、可溶性タンパク質のフォームを入手していた。昆虫細胞発現系には、合理的に水溶性だった純粋な蛋白質の mg 量を得ることが有効になります。表現のレベルに関してすべての IKK1/α 構造を IKK2/β を昆虫細胞発現系の構築よりもはるかに低いレベルで表明しました。可溶性で, 大腸菌で発現と機能性どちらもタンパク質であることに注意してください。昆虫の細胞表現システム、IKK2/β 断片 10 〜 30 mg/L、構造に応じて文化...

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開示事項

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著者はない競合する金銭的な利益やその他の利害の関係を宣言します。

謝辞

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ビームライン 19ID、24ID、および様々 な結晶でのデータ収集の間にサポートのための高度な光子源、レモント、イリノイ州で 13ID でスタッフに感謝いたします。EM 地図/モデルの構築、初期 IKK1 分子置換検索モデルの作成に使用された初期の段階での低分解能の低温電子顕微鏡マップを取得私たちのドミトリー ・ Lyumkis、ソーク研究所に感謝しております。これらの結果につながる研究は、GG に NIH 助成金 AI064326、CA141722、および GM071862 から資金を受けています。SP は、Wellcome の信頼 DBT インド中間。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Cellfectin/Cellfectin IIThermo Fisher Scientific10362100Cellfectinは現在製造中止となり、Cellfectin II
Sf900 III昆虫細胞培地Thermo Fisher Scientific12658-027
SF9Thermo Fisher ScientificScientific 12659017
抗IKK1抗体Novus BiologicalsNB100-56704以前はImgenexが販売していました
抗ペンタHis 抗体キアゲン34460
PVDF 膜ミリポアIPVH00010ニトロセルロース ニトロセルロース ニトロセルロース
Ni-NTA アガロースキアゲン30210
ブラッドフォード アッセイ試薬BioRad500001
Superdex 200 カラムGE ヘルスケア28989335
アミコン コンセントレーターミリポアUFC801008、UFC803008、UFC201024、UFC203024
化合物Aバイエル
カルビオケム IKK-inhibitor XIIカルビオケム401491
スタウロスポリンSIGMAS4400
MLN120Bミレニアムギフトアイテム
AMPPNPSIGMAA2647
デキストラン硫酸塩SIGMA51227、42867、31404、
Dextran sulfateAlfa AesarJ62101
PEGSIGMA93593、81210、88276、95904、81255、89510、92897、81285、95172それらのいくつかは、SIGMAカタログの新しいCat#です。私たちが持っていたのは、もともと猫#が違うフルカからのものでした。
結晶化スクリーン
クリスタルスクリーンIおよびII(クリスタルスクリーンHT)ハンプトンリサーチHR2-130
SaltRx 2 (SaltRx HT)ハンプトンリサーチHR2-136
クリスタルマウントハンプトンリサーチHR8-188、190、192、194
シンクロトロン米国エネルギー省の高度な光子源(APS)s アルゴンヌ国立研究所ビームライン 19 IDThe Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy'アルゴンヌ国立研究所は、ほぼすべての科学分野の研究に、超高輝度で高エネルギーの蓄積リング生成X線ビームを提供しています。
細胞 インデックスHTハンプトンリサーチHR2-134 PEG /イオンおよびPEG/イオン2(PEG /イオンHT)ハンプトンリサーチHR2-139 PEGRX 1およびPEGRx 2(PEGRx HT)ハンプトンリサーチHR2-086 SaltRx 1およびハンプトンリサーチHR2-139 PEGRX 1およびPEGRx 2(PEGRx HT)ハンプトンリサーチHR2-086 SaltRx 1およびハンプトンリサーチHR2-130インデックスHT

参考文献

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