生産、結晶化、および人間 IKK1/α の構造決定へのガイド

二量体転写因子の NF κ B 家族の転写活性は、炎症と免疫生存と死に至るまで多様な細胞機能に必要です。これらの活動は、細胞と自己免疫疾患や癌^1,2,3を含む様々 な病理学の条件に規制つながるの損失に厳しく制御されます。刺激がないと、NF-κ B の活性抑制 IκB (κ B の阻害剤) 蛋白質⁴で保持されます。IκB タンパク質特定 Ser 残基のリン酸化ユビキチン化とそれに続くプロテアソームまたは選択的処理⁵のマークを付けます。セリン/スレオニンの 2 つの高い相同性キナーゼ IKK2/β と IKK1/α はこれらのリン酸化イベント^6、7の遂行によって NF-κ B の活動の調節因子として機能します。

リガンドと受容体の相互作用は、一連の仲介因子 NF-κ B の活性化につながる信号をペリプラズムします。NF-κ B シグナル伝達プロセスは、2 つの異なる経路-正規と非正規 (代替)⁸に広く分類できます。IKK2/β の活動は主に、炎症性と生得免疫応答⁹に不可欠な標準的な経路の NF-κ B シグナル伝達を調節します。この経路の特徴はこれまで生化学メタボライト IKK 複雑な内 IKK2/β¹⁰の迅速かつ短時間活性化-IKK1、IKK2、規制成分、ネモ (NF-κ B 重要な変調器で構成されると推定)^11,12,13。IKK 複合体の 2 つの触媒 IKK サブユニット、間 IKK2 主担当です¹⁴原型 IκBs (α ・ β ・ γ) の特定の残基のリン酸化のため NF-κ B とも非定型の IκB 蛋白質にバインド NF-κB1/p105 である、NF-κ B p50 サブユニット⁵の前駆体。リン酸化によるユビキチンとプロテアソームの IκB (または p105 の処理) がリリースと NF-κ B 二量体¹⁵の特定のセットの活性化に 。IKK2 の誤規制機能による異常な NF-κ B 活性は、自己免疫疾患^2,3,16のように同様に多くの癌で観察されています。

IKK2/β と対照をなして IKK1/α の活動は、NF-κ B が開発と耐性のために不可欠である非正規の経路のシグナル伝達を調節します。IKK1 は、C 末端 IκBδ のセグメントについては、その処理と p52 の生成につながる NF-κB2/p100 の特定残基を廃止します。転写活性状態 p52:RelB ヘテロダイマーの形成発達信号^{7,17,18,19,20}をゆっくりと持続的な応答を開始します。興味深いことに、この経路の中央 NF-κ 係数 p52 の世代はもう一つの要因は、NF-κ B を誘発するキナーゼ (NIK)^21,22ではなく、IKK2 またはネモに大きく依存します。静止期細胞のニックのレベルがその一定のプロテアソーム依存低下^23,24,25により低いまま。'非正規' の配位子と特定の悪性の細胞で細胞の刺激、ニック化を採用して IKK1 をアクティブにするが安定/ニック ・ IKK1 α キナーゼ活動が p52⁷に p100 の効率的な処理に不可欠であります。IKK1 とニックはに対する 3 セリン (Ser866、870 と 872) NF-κB2/p100 の処理と p52 の世代につながる、C 末端 IκBδ セグメント上です。非正規の経路の異常な活性化は、多発性骨髄腫^26,27,28を含む多くの癌に関与しています。

IKK2/β のいくつかの非常に効率的かつ特定阻害剤が知られているが、どれもはこれまで有効な薬剤であると判明しています。対照的に、IKK1/α-特定の阻害剤は、まばら。これは、部分的に構造および生化学的 IKK1/α、セル、および合理的な薬剤設計の IKK1 によって NF-κ B の活性化の機構の基礎を理解することについての私達の欠如から幹があります。IKK2/β の x 線構造は、IKK2/β²⁹; の活性化機構への洞察を提供してくれましたしかし、これらの構造がどのように異なる上流の刺激を明らかに IKK1/α または IKK2/β NF-κ B 活動^30,31の異なるセットを規制するためのアクティブ化をトリガーします。IKK1/α の異なるシグナル伝達関数の基になる機構の基礎を理解して、合理的な薬剤設計のためのプラットフォームを確立するには、我々 は IKK1/α の構造決定に焦点を当てた。

1 大規模な IKK1/α 発現に適した遺伝子組換えウイルスの作製

1. P1 ウイルス作製³²
   1. 1 日目: プレート Sf9 細胞 (10 X 6 〜⁵) (通路番号 10 未満) 各 Sf900 III 昆虫細胞用培地 2 mL に 6 ウェル プレートのもし、27 ° c. で孵化させなさい6 〜 10 倍の密度で新鮮なメディアに希釈することによって懸濁液 mL あたり 2 に 3 X 10 の⁶セルの密度に達すると細胞の通路⁵。
   2. 2 日目: は、抗生物質や血清なし Sf900 III またはグレースの昆虫の中の 100 μ L の Sf9 トランスフェクション試薬の 8 μ L を希釈します。渦は簡潔に。
   3. 希釈 1 μ g (' 代表結果」で詳細に説明) キット精製組換えバクミドの別々 のチューブで、同じ媒体の 100 μ L 別に³² 。
   4. 希釈した DNA とトランスフェクション試薬 (総量 ~ 210 220 μ L)、結合し、15-30 分の室温で孵化させなさい。
   5. 井戸からメディアを削除します。抗生物質や血清せず新鮮な媒体の 1 つの mL を追加します。
   6. セルに滴下希薄 DNA トランスフェクション試薬の混合物を追加します。ドロップ サイズを調整して、それはない付着細胞を遊離させます。
   7. 〜 6 時間後上新鮮な媒体の 1.5 mL を追加または媒体を削除し、新鮮な媒体の 2.5 mL を追加します。加算の前に、25-27 ° c の暖かい新鮮な媒体。
   8. 27 ° C で細胞をインキュベートします。ウイルス感染の兆候を定期的にすべての 〜 12 h 井戸を確認します。すべての Sf9 メンテナンスと 27 ° C で式を行う
   9. 5 日目: セル 60 72 h ポスト感染を含む培地を取り出します。500 x g と 4 ° C で 5 分間遠心の上清を保存します。これは P1 ウイルス ストックです。-80 ° C で小さい因数を凍結します。
2. P1 ウイルス複製を表現する最高の選択。
   1. 手順 1.1 で記述として同様に細胞をプレート。
   2. メッキ、日 〜 6 h の次のポストは、さまざまな坑井の 20 μ L と異なる P1 ウイルス クローン株細胞の 50 μ L を追加します。
   3. 穏やかなピペッティングによる付着性のセルを追放し、500 x g と 4 ° C で 5 分間遠心分離によって感染させたセル 60 72 h ポスト感染を収穫上清を保存します。これは、P2 のウイルス ストックです。-80 ° C で在庫の小さい因数を格納します。
   4. 収穫した細胞ペレットに 100 μ L の 2 x Laemmli SDS バッファーを追加します。時の熱 > 95 の ° C で 10 分間遠心分離 (通常 > 10,000 x g) 5 分。
   5. 染料前ゲルの底に達するまで 120-160 V の 8-10 %sds ページの各サンプルの 10-15 μ L を実行します。
   6. 電気伝達標準セミドライによる解決の蛋白質転送プロトコル (20 V, 30-45 分) 硝酸セルロース/PVDF 膜に。
   7. 抗 IKK1 抗体を用いたしみ (希釈 〜 1:2, 000 最適化する必要があります) または抗 PentaHis 抗体 (希釈 〜 1:3, 000 最適化する必要があります) 式の。
   8. 組換え IKK1 の表現を比較することによって最高の P1 ウイルス複製を選択します。
3. 大規模 P3 ウイルス ストックの準備。
   1. 同様に手順 1.1 Sf900 III 媒体の 25-30 mL を含む 15 cm プレートに記載されている細胞。
   2. 〜 6 h ポストめっき、セルに最高表現する P1 ウイルス株の 150-300 μ L を追加します。
   3. 72 時間後の感染症を投稿、(滅菌)、適切な管のプレートから慎重に培地を吸引および 4 ° C で 10 分間 500-1000 X g でチューブを遠心分離(1 つが形成される) 場合、細胞ペレットを破棄し、上清を保存します。これは P3 ウイルス ストックです。
4. 大規模な蛋白質の表現のための最適なウイルス力価を決定します。
   1. 1.1 6 ウェル プレートでの説明に従って、Sf900 III 中の 2 mL の細胞。
   2. 20、30、40、および別のウイルス株井戸 〜 6 h ポストめっき P3 の 50 μ L を追加します。感染のコントロールが含まれます。
   3. それぞれよく 48 60 h ポスト感染から細胞を採取します。
   4. 2 X 塩化物イオンと SDS バッファーの 100 μ L を追加します。時の熱 > 95 ° C 10 分 (通常 14,000 x g) で 5 分間遠心します。
   5. 8-10 %sds ページのゲルの各サンプルの 10-15 μ L を解決します。
   6. 1.2.6 で述べたように、ニトロセルロース/PVDF 膜に解決の蛋白質を転送します。
   7. 抗 IKK1 抗体を用いたしみ (希釈 〜 配分を最適化する必要があります) または抗 PentaHis 抗体 (希釈 〜 1:3000 を最適化する必要があります)。
   8. 大規模な表現の力価を表現する最高のウイルスを使用します。

2 タグ付きの 6 x 彼の大規模な式人間 IKK1^29,33

1. 懸濁培養における大規模な表現を行います。1 l Sf900 III ベント キャップを 2 L の三角フラスコ中のセルを分割します。細胞密度は、5 〜 10⁵セル/mL x をする必要があります。
2. ~ 2 日間 1-2x 10⁶/mL の濃度に達するまでのシェーカーに 27 ° c ~ 100 rpm の懸濁液のこれらのセルを成長します。細胞密度に 2 x 10⁶/mL を超えることはできません。
3. 1.4 で評価した P3 ウイルスの希望の金額を追加します。
4. シェーカーに 27 ° c ~ 100 rpm で 48-60 h の感染の文化を育てます。
5. 遠心分離によって細胞を収穫 < 4 ° C で 1,500 × g
6. 細胞ペレットを保存し、培地を除去します。
7. 蛋白質の浄化に直接進みます。フラッシュは、液体窒素で将来使用するため-80 ° c ストア細胞ペレットを凍結します。

3. 彼 IKK1³³の浄化

1. 1 日 40 mL の溶解バッファーで細胞ペレットを再懸濁します (25 mM Tris pH 8.0、0.2% NP 40、200 mM の NaCl、10 mM のイミダゾール、10% グリセロール、5 mM β-メルカプトエタノール、およびプロテアーゼ抑制剤のカクテル)。
   注: ウェット細胞ペレット質量を特定できませんでした。通常、文化の ~ 2 L はこのステップの使用だった。
2. 60-70% デューティ サイクルの間隔で 30 秒の期間の 5-10 パルスで超音波処理によって、細胞を溶解 > 1 分、細胞懸濁液を保つチルド氷の上。
   注: この手順には、超音波発生装置の各モデルの最適化が必要です。サンプル 10 ° C 以上のウォーム アップをさせてください。
3. 4 ° C の 45 分の ≥ 28,000 × g で遠心分離によってライセートを明確します。
4. 4 mL の Ni NTA Agarose 樹脂換散バッファーと明らかにしミックス ライセート (清) 次の製造元のプロトコルを平衡します。
5. 4 ° C の部屋でロータリー ミキサー上で 2 時間インキュベートして樹脂をバインドするタンパク質を許可します。
6. 30 mM のイミダゾールを含む換散バッファーで樹脂を徹底的に洗います。ブラッドフォードの試金を使用して定期的に洗浄分数の蛋白質の集中を確認します。洗浄洗浄画分におけるこのタンパク質濃度 0.1 mg/mL に達するまで。通常このポイントに到達する > 20 ベッド洗浄バッファー量が必要です。
7. 20 mL の溶出バッファー (250 mM のイミダゾールを含む換散バッファー) を用いた重力流の下で IKK1/α の彼の付けられた蛋白質を溶離する。1 1.5 mL の一部分を収集します。
8. 塩化物イオンとバッファーと混合のすべての分数から 5-10 μ L のサンプルを読み込んで、8 または 10 %sds ページのゲルの溶出蛋白質の純度を確認してください。
9. ピーク画分 (濃度 ≥ 2 mg/mL)、プールし、ブラッドフォードの試金を使用して蛋白質の集中を測定します。
10. (1:30-50 (TEV プロテアーゼ: IKK1)) TEV プロテアーゼ一晩 (≥12 h) 4 ° C でのダイジェストします。
    注: 最適化に必要な TEV プロテアーゼの量の 6 X 彼タグ先験的(≥ 95%) 消化を完了します。TEV プロテアーゼは、家の中で浄化されました。
11. 2 日目の朝、27 ° C で 1 時間 1 mM ナトリウム バナジン NaF、10 mM、20 mM の β-グリセロリン酸 20 mM MgCl₂の存在下で 1 mM ATP をもつタンパク質を孵化させなさい。
12. 0.45 または 0.22 μ m のフィルターを通して蛋白質の解決をフィルターします。
13. 自動液体クロマトグラフィー システムに接続されている 〜 120 mL 分取サイズ排除カラムにサンプルの 6 mL をロードします。バッファー A のコラムを平衡させ (20 mM トリス-HCl (pH 7.5) 150 mM の NaCl、5 mM DTT、5% グリセロール)、蛋白質のサンプルを適用する前に。
    注: 小さい列は、Ni NTA アフィニティ精製ステップの後タンパク質の収量によって提示される可能性があります。調整/列ボリュームの 5% に負荷量を計算)。
14. 1 mL/分の流量でサイズ排除クロマトグラフィーを実行し、280 と 254 nm で溶出を監視します。2 mL サイズの分数を収集します。
15. ピーク画分の純度を確認してください (通常約 60 〜 70 mL) 8-10 %sds ページのゲルの。
16. 純粋な分数 (≥0.5 mg/mL の濃度と純度 ≥95%) をプール、10 kDa または製造元の指示に従って 30 kDa 分子量カットオフ遠心タンパク質コンセントレーターに集中。
17. 定期的にブラッドフォード法による濃縮物のタンパク質濃度をチェックし、8-12 mg/mL までサンプルを集中します。
18. 25 μ 因数および液体窒素中で凍結を分配します。-80 ° C のフリーザーにこれらのフラッシュの凍結試料を保存します。

4. IKK1 の結晶化条件の画面

1. 画面の結晶は以下の以下の手順に必要なタンパク質の (ボリューム) で合計金額を計算します。
2. 異なる阻害剤を試す (一般的なキナーゼ阻害剤: AMPPNP、およびスタウロスポリン;IKK-specific 阻害剤: MLN120B、化合物 A 及び IKK 阻害剤 XII) 結晶のスクリーニングを実行します。製造元の指示に従ってこれらの化合物の溶液を作る。その原液の化合物の最大の濃度が 20 μ M を超えていないことを確認します。
3. 200 μ M の阻害剤、IKK1 の混合の 100 μ M で結晶化画面の複雑な IKK:inhibitor を準備し、30-40 分でこの混合物を遠心分離機の 18-20 ° C で孵化させなさい > 常温で 2 分間 15,000 × g。結晶化画面の上清を保存します。
4. (材料の表を参照してください) 市販結晶化画面を使います。
5. 96 ウェル プレートの貯水池にマルチ チャンネル ピペットやロボットなどを使用して各結晶化試薬 (液)、80-100 μ L をピペットします。プレートは、滴を設定する準備が整いました。プレートが結晶化 2 に 3 滴を収容する、2 に 3 の阻害剤は単板で上映されることができますを確認します。
6. 0.2 – 0.25 をミックスし、結晶化ロボットを使用して、複雑な IKK1:inhibitor の貯留層ソリューションの同じボリュームの μ L。
   注: スクリーニングは大量のドロップを使用して手動でを実行することができます (0.5 〜 1.0 μ IKK1:inhibitor 複雑な貯留層ソリューションの同じボリュームで)。ただし、ロボットの使用は、貴重な試薬保存に役立つでしょう。
7. 蒸発を避けるために光学的に透明フィルムと滴を設定した後すぐにプレートをシールします。正しく適切なアプリケーターを使用してシールします。各阻害剤セットのレプリカ プレートを作る。18 の ° C と冷蔵室 (温度範囲 〜 4-6 ° C) で他に 1 つのプレートを孵化させなさい。インキュベーターは、振動の影響を受けないことを確認します。
8. 偏光顕微鏡を使用して、外観の各ドロップで結晶の毎日最初の 7 日間、長い間隔でチェックします。体系的に注意してください、これらの観察結果をスコアします。
   注: では、顕微鏡を使用して偏光板と、結晶の成長欠陥を視覚的に評価することができます。ここでは、結晶が現れた状態で貯留層のソリューションが 3 w/v デキストラン硫酸ナトリウム塩 M_r 5,000、0.1 M を含まれるビシン pH 8.5、15 w/ポリエチレング リコール 20,000 v。IKK1 結晶成長 XII IKK 阻害剤の存在下でのみ。

5. 結晶成長最適化^29,33

1. 貯蔵液の準備。
   1. 異なる分子量 (平均 MW 5,000、8,000、15,000、40,000 Da) 脱イオン H₂o. フィルター ソリューション 0.22 μ m のフィルターを使用してのデキストラン硫酸の 30 %w/v ソリューションを準備します。
   2. 6.5 に 9 の pH の範囲の異なるバッファーの 1 M と 0.5 M の在庫を準備します。0.22 μ m のフィルターを使用して、ソリューションをフィルター処理します。
   3. 異なる分子量の PEG 溶液の 25% または 50% (w/v) を準備 (平均 MW:1000、1,500、3,350、4,000、6,000、8,000、10,000、12,000、20,000 Da)。0.22 μ m のフィルターを使用して、ソリューションをフィルター処理します。
   4. 体系的に pH、バッファーの種類、濃度、およびペグとデキストラン硫酸の両方の種類を変えることによってグリッド画面を実行します。
2. 18 ° c と (温度範囲 4 ~ 6 ° C) の低温の室内でのスクリーニングを最適化します。
3. 複雑な IKK1:Inhibitor の同量を混ぜてよくソリューションと密封された環境でよくソリューションを孵化させなさい。この手順を手動で実行することができますまたはディスペンス ロボットを使用しています。
   注: ここでは、最大かつ明確に定義された結晶 (均一な成長を示されている偏光板の下で均一な色によって評価される)、次の条件下で得られた: 100 mM BisTris pH 7.0, デキストラン硫酸 (平均 MW 15 kDa) 8.5 10% ペグ 20 2.8 3.5%部屋が寒い kDa。

6. 多数の結晶の成長

1. 次の貯蔵液の準備し、0.22 μ m フィルターを通過。
   1. 0.5 M BisTris pH 7.0 と BisTris プロパン pH 7.0 および 7.5 を準備します。
   2. 30% (w/v) デキストラン硫酸 (平均 MW ~ 15 kDa) を準備します。4 ° C でのストア
   3. 50% を準備ペグ (平均 MW ~ 12 kDa)。
2. 使用も 24 には、ドロップ プレートがぶら下がっています。
3. 各ウェルの上げられたリングにグリース シール剤を適用します。
4. (最終濃度) 次のようにもソリューションの準備: 100 mM BisTris pH 7.0-7.5、2.8-3.5% デキストラン硫酸 〜 15 kDa 8.5-10% 〜 12 kDa のペグします。1.5 mL チューブに 1 mL もソリューションを準備します。
   注: 結晶化条件のマイナーなバリエーションは、蛋白質、および/またはデキストラン硫酸のバッチによって観察された、従って狭い範囲の試みをお勧め。BisTris と BisTris の両方同じ pH 範囲のプロパン バッファー単結晶の降伏。
5. 少なくとも 1 時間冷蔵室でよくソリューションと油を塗ったプレートを維持します。
6. 4.3 で説明されているように複雑な IKK1:Inhibitor を準備します。1.5 mL チューブから 24 well プレートの個々 の井戸にもソリューションを転送します。
7. きれいなケイ化 (市販または社内 (ケイ/シリル化)) 糸くずのワイプを使用してカバー スリップをガラスし、市販のエアゾール ダスターを使用して正確に高圧空気噴流を適用します。
8. きれいなカバー スリップにもソリューションの 1 – 1.5 μ L を配置します。複雑な IKK1:inhibitor の等量のピペット、上下にピペットで穏やかに混合 3-4 回。ガラス製カバー スリップを回すし、鉗子でもそれぞれにグリースの押すことによって井戸を封印します。
9. 24 ウェル プレートのすべての滴を設定した後は、暗闇の中で冷蔵室でプレートを孵化させなさい。時折外観と結晶の成長のための顕微鏡下でドロップを確認してください。
   注: それはテストされていない結果を変えると光の下で結晶板を孵化するかどうか。しかし、プレートが最小/いいえ振動がある環境で培養が重要です。

7. 低温結晶の保護

1. 低温溶液の調製。
   1. クライオ A を用意 (~ 2% デキストラン硫酸、~ 10% PEG 12000、60 mM (同じ pH の目的もソリューションとして)、BisTris プロパン 5 mM Tris pH 7.5、40-50 mM NaCl、2.5% グリセロール)。
   2. クライオ B を準備 (~0.3% ~ 10% デキストラン硫酸ペグ 12000、60 mM (同じ pH の目的もソリューションとして)、BisTris プロパン 5 mM Tris pH 7.5、40-50 mM NaCl、20 または 25% グリセロールまたは 20 または 25% エチレング リコール)。
      注: は、グリセリン、エチレング リコール (例えば200 のペグ、ペグ 400、MME 550 のペグ、ペグ 1000) に加えて別低温保護をテストします。
2. 優しく、クリスタルを含むガラス製カバー スリップを取り出し、上向きクリスタル ドロップと固体表面上にそれを置きます。ゆっくりのドロップの上に低温の溶液 10 μ L を追加し、軽くピペッティング水晶は手がつけられないので、ミックスします。
   注: この破片の結晶表面をきれいにし初期低温バッファーと結晶の平衡を助けます。結晶に機械的および熱的ストレスを避けます。結晶への損傷を避けるために顕微鏡下でのすべての後続の手順を実行します。
3. ゆっくりと結晶からいくつかの液体を削除し、について維持ソリューションの 5-8 μ L。結晶の脱水症状を避けます。機械的ストレスと後続のすべての手順で結晶の脱水症状を避けるために細心の注意を取る。
4. ゆっくりとドロップにクライオ B 液の 2.5-4 μ L を追加、ピペッティングでとてもやさしく混ぜます。結晶の上直接空気の流れを避けるために小さいペトリ皿でカバーします。5 分の待機は、常に慎重クリスタル浸透圧あるいは脱水症状の急速な変化に苦しむしていません。
5. ゆっくりと低温の溶液に結晶を慣らす 7.4 手順を繰り返します 4 回します。
6. この段階では低温電子顕微鏡ソリューションの 10-20 μ L を維持 (すなわち、約 20-25% を浴びるにクリスタルを許可する低温保護剤含んでいるソリューション)。時間 (1 時間 5 分) 最終低温溶液中の異なった期間の間浸漬します。
7. 異なる時点で複数の結晶を凍結します。
8. 慎重に適切なベースとプランジ-凍結液体 N₂にマウントされている適切なクライオ ループでドロップから単結晶を選ぶ。この手順はスムーズにかつ迅速に氷結晶の形成を避けるために。
   注: は、水晶結晶の最も長い軸よりわずかに大きいループ径を使用して高度な光子源、アルゴンヌ国立研究所で使用されるロボットのゴニオメータでマウントすることができますを選択します。
9. 浸漬液 N₂のいたずら小僧でクライオ ループを含む結晶を格納します。シンクロトロンの x 線回折のための出荷の準備ができるまで、リキッド N₂デュワー フラスコにこれらのいたずら小僧を格納します。X 線回折データ収集と処理 (セクション 8 と 9) に進みます。
   注: ホームの x 線源から IKK1 結晶の回折データはなかった構造定量試験は、十分に高い解像度のシンクロトロンで上映されると結晶の品質が示されているが。すべての回折データを事前光子源、アルゴンヌ国立研究所、アメリカ合衆国の異なるビームライン (主に 19ID) で採取。

8. x 線データの収集

1. リモート データ収集ソフトウェア³⁴を用いた APS のシンクロトロン源の ID19 ビームラインでの x 線回折データを収集します。
   注: 以上 100 の結晶の回折特性のテストされました。5 以外に回折結晶が 7-11 Å、稀だけの解像度に結晶が日常的に回折 Å 4.5 を超えて回折観測、そして唯一の 1 つ大きな結晶をされた Å。結晶は、データ収集中に急速に腐敗、以来同じ結晶のさまざまな部分でデータセットを集めました。結晶が大きいのでこれが可能だった (400 μ m より大きい)、使用されるビーム径が 100 μ m と。

9. x 線データ処理

1. 同じクリスタル³⁴のさまざまな部分で収集されたすべてのデータセットをマージします。
   注: 7 つのデータセットは、最高の結晶からマージされた結果のデータ完全な 93% であった.全体的な私/σ でした 〜 6.8) Rmerge 最高解像度箱 (5.4 4.5 Å) で 89% であった。
2. 空間群、単位セルの大きさ、溶剤含有量、および非対称単位の説得力のある構成を取得する HKL2000³⁴によるデータセットのプロセス。

10. 構造ソリューション

1. 検索モデルの準備
   1. HIKK2 の利用可能な構造モデルに基づく (pdb id 4E3C と 4KIK³⁵)、N 末端 KD のさまざまな方向を持つ二量体の系列を生成 (30 と 62 のオープニングをレンダリングする Å、二量体の 2 KD の P578 間)。これらのモデルのどれもは、広汎な試験の後分子置換検索ソリューションを取得します。
   2. 単一粒子の低温電子顕微鏡データ³³から IKK1 のマップを生成します。
   3. IKK2 の最高の解像度の構造から人間の IKK1 のモデルの生成 (pdb id 4KIK)。
   4. クライオ EM 密度マップに人間 IKK1 のオオバン³⁶を使用して人間の IKK1 モデルの個々 のドメインをドッキングします。これは KD 向き約 24 度を回転、N 末端 〜 58 Å に開くを変更します。
   5. 10.1.1 で生成されたすべてのダイマーに 70S 装着モデル (単量体) の KD 向きを適用します。
2. 分子置換
   1. プログラム フェイザー³⁷、MOLREP³⁸と中枢神経系^39,40の検索モデルとして 10.1.1 10.1.5 からダイマーを使用します。
      注: ここでは、検索モデルとして 10.1.5 (52 Å オープン) から二量体のいずれかを使用して、6 二量体 (2 hexamers) された非対称単位を使用して配置 MOLREP。検索モデルで開く 52 Å は、洗練された構造の二量体 (すべて 6 二量体) の 49-50 Å 開口部に似ています。

11. 構造精密化

1. 構造改良の手順
   1. 中枢神経系 (cns_solve_1.3)^39,40のリジット ボディの洗練されたによってこの初期モデルの位置や向きを修正します。
   2. さらに最小と最大尤度ターゲット関数と中枢神経系システム^39,40を使用してフラット バルク溶媒補正シミュレーテッドアニー リングを用いた構造を絞り込みます。
   3. 2 f_OF_Cと Xtalview⁴¹を使用して Fo Fc マップに基づいてモデルを構築します。
      注: 適用電による洗練された⁴² NCS 抑制モデルの精度を高めるため改良中。確かに、形状と構造の R 要因デン絞り込みが大幅に向上、R 因子 22.2% であったし、無料の R 要因最終的なモデルの 27.8% であった。無料の R の劇的な改善は、IKK2 モデル (4KIK) から生成された IKK1 ドメインの高精度モデルのためする必要があります。

IKK1/α の異なる構造体のクローニングと発現
タグ付き IKK1 の N 末端ヘキサ ヒスチジンを取得するその EcoRI とノッティ制限サイト内バキュロ ウイルス発現ベクター pFastBacHTa に人間 IKK1/α のクローンだった完全な長さ。タグは、TEV プロテアーゼ消化によって削除でした。全長 IKK1/α に両端に柔軟な地域が含まれているので、柔軟な地域によってレンダリングに蛋白質通常結晶化することは困難私達 IKK1/α pFastBacHTa ベクトルの上記サイト内の様々 な切り捨てられた断片のクローン作成。IKK1/α のトランケーション変異は、野生型 (wt) と S176E、180E 生成された (EE) バックボーン。IKK1/α EE はリン酸キナーゼの恒常活性フォームの擬態を指します。組換えバキュロ ウイルスの生産と蛋白質の表現をマイナーな修正43 (図 1) で以前に公開されたプロトコルを使用して行った。

IKK1/α 結晶化の難しさ
人間の IKK2/β と IKK1 は、いくつかの異なる条件の下で人間の IKK2/β の異なるバージョンを結晶化すること、私たち期待 IKK1/α 同様の戦略を使用して同じような条件の下で結晶化します。ただし、いくつかの異なる IKK1 亜種で広汎な試験の後、1 つだけ切り捨てられたコンストラクト (IKK1 10 667 EE) 結晶を用いて (図 2) とだけまた適して表示されます IKK 阻害剤 XII44の存在下でX 線回折特性。

構造ソリューション
IKK1/α 結晶に苦しんだ多数の成長問題、データはしばしば非常に高い非常を表示されます。大型の溶剤含有量に関連付けられている弱い結晶の充填と IKK1 モノマー/ダイマーの動的な性質は、この背後にある可能性が高い理由。これらの問題を回避するために骨の折れる努力が最高の可能な結晶を得る撮影された、様々 な条件の下で細心の注意とさまざまなクライオ防腐剤バッファー低温保存プロシージャを行った。データも梁の損傷を最小限に抑えるための究極の精度で収集されました。結晶が大きい (最大寸法 400 ミクロンを超え) 頃、同じ結晶の異なる領域は複数のデータセットを収集するために x 線ビームにさらされました。これは、別のデータセットが拡大縮小して高い冗長性を合理的に完全なデータセットを取得するを有効にし、エラーを最小限に抑えます。不十分な回折を結晶の原因 (例えばTaBr とタム)、クラスターを重原子または重原子で浸します。我々 は、派生データの TaBr クラスターの位置を見つけることができませんが非 isomorphocity に加えてデータの質の悪さは、ほとんどの位相情報を しました。

我々 は HKL2000 によるデータセットのさまざまな利用可能なパラメーターを使用して処理されます。回折パターンは、結晶は単位セルの大きさと空間のグループ P21に属することを明らかにした、= 174.51、b = 186.94、c = 275.83 Å と β = 98.84 度。私たちは主に使用される/カットオフを推定する σ とテスト データセットのさまざまなカットオフ。4.5 Å 分解能回折データの 7 セットの 4 が一つの結晶の収集のマージされたデータ セットを得た。我々 は最終密度マップの目視検査から 4.5 Å までデータを維持することを決めた。それは CC CC *45を使用して true (通常計測) 強度に対して結合されたデータセットの解析的推定できるので、CC1/2 を使用する価値がある可能性があります。空間群の低対称性と組み合わせて大型ユニット セルのため溶剤含有量 70% から 40% に基づく 12 に 24 分子を含む非対称ユニットを予想されます。

低解像度 (すなわちデータの重要なエラー) 強度も弱い x 線データの併用効果 (図 3)、IKK1 分子の非対称ユニットと IKK1 モノマー/ダイマー模型の立体配座の変化の多数 (12)モデルは最初分子置換ソリューション IKK1 を取得し、このようにその構造を決定するから私たちを防ぐ知られている IKK2 と比較しています。

キナーゼ ドメイン (KD)、ユビキチン様ドメイン (ウルド) と α-ヘリックス構造足場二量体化ドメイン (SDD) IKK1/α と IKK2/β の両方が含まれます。IKK1 の構造は、SDD の遠位領域のほぼ同じ間サブユニット界面を利用した IKK2 と同様に二量体を形成することを明らかにしました。ただし、IKK1 ダイマーは SDD + ULD と比較して知られている IKK2 ダイマー基準 N ターミナル KD の大幅に異なる相対位置を表示しました。以前、IKK2 構造の異なるはその二量体 (図 4、パネル) の内で異なる intermonomer 方向を明記して、39 と 61 Å の間様々 な 4 つの異なる二量体モデルの 2 KD で P578 のアルファ炭素間の距離。これら 2 つのキナーゼのシーケンスが非常に似ているので、二量体の界面残基が同一であるような二量体を形成する IKK1/α 予想ただし、KD SDD インターフェイスの残基に差があるので (例えば、W424 および IKK2 の F111 は、V、P それぞれ)、IKK1 のまだ別の KD 向きおそらく予想します。確かに、IKK1/α 構造には、SDD に KD の関連の向きは独特であり、IKK2/β のすべての知られているモデルから外れていることが示されます。100 ダイマーを超えるモデルはプログラム フェイザー、MOLREP、および中枢神経系ではなく正確な検索モデル分子置換試験、特に低解像度データの成功のための必要性を示す、任意の成功なしで検索モデルとして使用されました。モノマーのモデルは、12 のモノマーを含む大規模な非対称単位の弱い回折データの任意のソリューションをピックアップして少なすぎる質量を持ちます。また、包含または不作為検索モデルの水の違いはありませんした分子置換検索で特に弱い回折データのため。CC1/2 と CC * 4.5 Å までのデータがかなり正確であることを示します。4.5 のカットオフに保守的な解決を使いました私 Å のベース/1.5 σ。解像度の異なるカットオフを持つデータセットは分子置換検索操作中に際立った違いを示さなかったし、これらのデータセットに対して洗練された最終マップは解像度を拡張する時に地図機能で任意の著しい改善を示さなかったカットオフ。モデルの最終ビルドは非常に正確、以上のものは、単独での密度から造ることができる高解像度データを派生して初期分子置換のモデルは、モデルから造られた可能性が高いと低温電子顕微鏡マップ/密度を利用クロス チェック マップ明確ではなかった地域を中心に、地図表示の機能。

後知恵で、役に立つ検索モデルの入手は低分解能の低温電子顕微鏡マップの可用性と高解像度 IKK2 構造 (図 4に基づく生成でした、IKK1 のドメインではなく高精度モデルのためにだけ可能パネル B)我々 は合理的に近い二量体モデルを取得する IKK1 の低温電子顕微鏡マップに IKK1 ドメインがドッキング。初期モデルは KD の方向回転約 24 度に IKK2 モノマーおよび 58 の N 末端の開口部を基準として示されている Å (二量体の 2 つの KDs の P578) 間。異なる IKK2/β 二量体構造の事前知識 (とその変化) 検索モデルとして 30 62 Å。 使用二量体 (開く 52 Å) の 1 つの間の開口部を変更して検索モデルを微調整する私たちを有効を使用して非対称単位 6 ダイマー我々 に位置してプログラムは、MOLREP46。これらの六つの二量体は非対称単位で 2 つの hexamers に、計算された溶媒は 68% のボリューム。

図 1: IKK1 の精製します。(A)式の IKK1 (10-667) 昆虫細胞で。(B) IKK1; の浄化のためのフロー ・ チャート(C)の SDS-PAGE のゲルが Ni NTA 親和性クロマトグラフィー ステップの後 IKK1 の純度を示します。(D)サイズ排除プロファイル IKK1 の二量体を示します。(E) SDS ページのゲルがピーク サイズ排除の一部分から IKK1 の純度を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: IKK1 結晶の形態およびサイズ。(A) IKK1 の結晶構造物 10-667;結晶化ドロップもよく回折はない別形態 (薄板) の結晶を示しています。(B) 5 以外に回折結晶ビューで拡大 Åこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。

図 3:。IKK1 結晶から得られた結晶構造データ。の典型的な IKK1 結晶の貧しい回折特性を示す IKK1 クリスタル(A) x 線回折プロファイル。(B) HKL2000 スケール IKK1 の構造決定とデータの冗長性を使用する結合されたデータセットの統計情報です。R 線形 = 合計 (ABS (-< i >))/合計 (I) R スクエア = SUM ((-< i >) * * 2) 合計/(私 * * 2)、Chi * * 2 = 合計 ((-< i >) * * 2)/(エラー * * 2 * N (N-1)/))、CC1/2 = CC * 相関係数 = true 強度に対して結合されたデータセットの相関係数。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: 検索モデルの準備。(A) (2 KD の間異なる分離に上昇を与える); SDD を基準にして KD のさまざまな方向を示す IKK2 ダイマーの異なるモデルこれらのモデルは、任意の成功なし分子置換解決策を見つけるに最初テストされました。(B) IKK1 世代検索モデル - 11 Å の解像度で IKK1 二量体の低温電子顕微鏡マップEM 地図装着初期の IKK1 検索モデル、IKK2 モデル (4KIK); に基づいて個々 のドメインIKK1 検索モデルさらに細かい調整 (適切な KD 向き) IKK2 モデルから判断されるよう、様々 な可能性に基づく説明上記4 a;EM 地図の重ね合わせは、モデル得られた分子置換ソリューション検索モデルからを装着しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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