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方法論記事

生体内培養-高速、シンプルで、安価な AWESAM プロトコルを使用してマウスのアストロ サイトのように

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DOI：

10.3791/56092

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2018年1月10日

 , 
1Chemical Biology, Chemistry Research Laboratory, University of Oxford, 2Department of Physiology, Anatomy, and Genetics, University of Oxford, 3Trans-synaptic signaling, European Neuroscience Institute

この記事について

サマリー

ここで記述されている AWESAM プロトコルは、高速、簡単、かつ安価な方法で他の脳細胞から分離してマウスアストロを培養に最適です。AWESAM アストロ サイトを示す自発的 Ca2 +シグナリング、形態、遺伝子発現プロファイル体内のアストロ サイトに似ています。

要約

AWESAM (、 low-コストeasy stellate 、strocyte「ウィズダム) プロトコルは生体内での大量を生成する高速シンプルで、安価な方法を伴います-マウスおよびラットのグリア モノカルチャーのような: 脳細胞は異なる脳の領域から分離することができ、細胞培養の週後非アストロ サイト細胞はインキュベーターで 6 h のシェーカーに培養皿を置くことによって振り落とさ。残りのアストロ サイトが (NB + H と呼ばれる) アストロ サイト固有の培地で継代新しいプレートにし。NB + H には、低濃度培地に血清の代わりに使用されているヘパリン結合 EGF 様増殖因子 (HBEGF) にはが含まれています。NB + H で成長して後、AWESAM アストロ サイトがある星状の形態と機能の細かいプロセス。さらに、これらのアストロ サイトがより多く体内ある-アストロ サイト以前に発行されたメソッドで生成されたよりも遺伝子発現のように。Ca2 +イメージング、小胞ダイナミクスと細胞膜の近くに他のイベントは、罰金のアストロ サイト プロセスの in vitro、例えば、生きているセルの共焦点または全反射型顕微鏡を使用して研究できることは従って。特に、AWESAM アストロ サイトも示す自発的 Ca2 +シグナリング体内のアストロ サイトに似ています。

概要

アストロ サイト栄養サポート、血流、シナプス シグナルと可塑性の細胞間コミュニケーション - 薄いアストロ サイト プロセスの中心機構である脳機能に影響を与えます。ここで記述されている AWESAM プロトコルにより、ニューロンと、役に立つなど、異なる脳細胞間の多くの蛋白質とも Ca2 +シグナル伝達式が重なるため他のグリアからの干渉なしにこれらのプロセスに関する研究タイプ。さらに、このメソッドは、以前利用可能な技術の限界を克服します。体内特に私たちのプロトコルを提供します-形態 (薄膜プロセスと星状アストロ サイト) とクイック, 簡単, 遺伝子発現と安価な方法のようです。

細胞の形態、遺伝子発現、および他の多くの規制プロセスは環境によって直接影響します。培養皿の周囲の細胞も細胞が成長して媒体によって解放の要因を指します。アストロ サイト、HBEGF 以前星状の形態1を誘導するために報告されたが、解除アストロ サイト2を区別することが分かった。ただし、低濃度 HBEGF の後より生体内で生成するため使用された-アストロ サイトのように 2 つの異なるプロトコル3,4の RNA シーケンスで識別されます。さらに、アストロ サイトの形態変化4プロトコルに関係なく、ミディアムの組成: HBEGF の低濃度 Neurobasal 媒体 (例えば他の培地の成分中の星状のアストロ サイトを成長に最適です血清を含む DMEM) (さらに新鮮な immunopanning によって分離されたアストロ サイト) 多角形の細胞を作り出します。

AWESAM プロトコルは、アストロ サイト モノカルチャー4成長のための前の技術の欠点を克服します。アストロ モノカルチャーの成長のための前の技術次の欠点があります: は体内(MD 法) 星状アストロ サイト5; の特徴的な多角形の形態長さとプロトコル (3ヶ月誘導多能性幹細胞からアストロ サイトの準備と高価な成長因子を含む多くの試薬が必要です) のコスト6;少量の素材 (immunopanning 法)3アストロ サイトの解消の分化と 3 D マトリックス (Puschmannら) の要件1,2対照的に、AWESAM プロトコルを提供します:生体内で-形態 (薄膜プロセスと星状アストロ サイト); のような。迅速、簡単、および安価な方法;大量の素材。生体内最も-遺伝子発現 immunopanned と MD アストロ サイトと比較してのように。さらに、2 D の文化は、Ca2 +シグナル伝達と薄膜プロセスや膜に近いイベントをリサイクルの研究 (例えば、全反射型顕微鏡では不可能です 3 D 文化)。

MD 法は、1980年5、多角形のアストロ サイト モノカルチャーのシンプルで高速な手法を提供するの出版以来広く使用されています。簡単に言えば、MD 法を伴なう牛胎児血清 (FCS) の成長の混合脳細胞-(型デタッチお皿から他のすべての脳細胞) としてアストロ サイトを豊かにし、さらに同じ培地で培養する手順を揺れが続く、DMEM を含みます。DMEM FCS とは、線維芽細胞と脂肪細胞から異なるがん細胞、すべての共有の文化における MD アストロ サイトが出展した多角形の形態に至るまで他の多くの細胞型に使用されます。初期の 2000 年代の7時まで少し考えていたアストロ サイトに合わせたメディアに与え、彼らの典型的な星状の形態を支持する具体的にはin vivoを発見します。2011 年に公開された 1 つのプロトコルがこのような星状の形態を達成する: immunopanning メソッドが呼び出されると、それは無血清培地培養アストロ サイト3用に最適化を採用しています。このメソッドを使用して、新鮮な分離脳細胞料理アストロ サイトを豊かにするため、セルの型固有のセル表面蛋白質を対象とする抗体でコーティングのシリーズにさらされています。生体内でより多くにもかかわらず-immunopanned アストロ サイトの形態と発現プロファイルのような生体外の研究の大半は、まだ MD アストロ サイト メソッドに依存します。MD 法はシンプルかつ高速で、immunopanning メソッドは、文化の最初の日により複雑な時間のかかる手順を装備されている (長い酵素消化期間など別の密度、自体は、immunopanning の解の慎重なレイヤーといくつか遠心分離の手順 - めっき前にすべて)。しかしより専門的な媒体を使用して、AWESAM メソッド提供速度分子動力学法と生体内で-immunopanning プロトコルの形態のような。

全体的に、AWESAM プロトコルは生体内でより多くを学ぶ-(immunostainings、immunoblots、RNA シーケンス、以前特徴4 ) としてニューロンとグリア他から分離された 2次元模型林分におけるアストロ サイトのように。それシンのアストロ サイト プロセスの研究のためと自発的 Ca2 +シグナル伝達とイベント (例えば、全反射顕微鏡を用いたイメージング) 膜に近い可視化する偉大なアクセシビリティを提供できます。

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プロトコル

ここで説明したすべての動物実験は、ドイツの動物福祉に関する指針に従って行われました。

注: タイムラインとプロトコルの主な手順は図 1に示します。

1. 準備

  1. 以下のソリューションを準備します。
    1. 培養アストロ サイト MD 多角形の DMEM + 準備: 10 %fcs、100 U ペニシリン 100 μ g/mL ストレプトマイシンと DMEM。
    2. 培養アストロ サイトの星状の NB + H の準備: 5 ng/ml の HBEGF、B-27 サプリメント、1 x グルタミン、100 U ペニシリンおよび 100 μ g/mL ストレプトマイシン × 1 neurobasal 中。
      注: HBEGF の高濃度の因数を作成し、必要な時に培地に添加するのに-20 ° C で保存します。
    3. 解剖中 (10 mM HEPES HBSS で) を準備します。
    4. 0.05% トリプシン-EDTA と 6-7 ミリリットル 0.25% トリプシン-EDTA 15 mL チューブに 6-7 mL の因数を準備します。これらは、-20 ° C で保存し、37 ° C の水浴で解凍できます。
  2. プロトコルを開始する前に日はコートの 0.04% ポリエチレンイミン (PEI) 各 5 ml 10 cm 培養処理料理です。
  3. 次の日は、プリンスエド ワード島を削除し、2 回蒸留脱イオン水で食器を洗います。各プレートに DMEM + 12 mL を追加し、中古セルをメッキする前に少なくとも 30 分の 37 ° C、5% CO2でインキュベーターで平衡します。
  4. 郭清範囲を準備: 層流剥離フード解剖中氷の上でいっぱいに場所 2 10 cm シャーレ。各脳領域の分離 (例えば皮質、海馬)、14 mL 解剖中でいっぱい 15 チューブを準備し、氷の上を保ちます。70% のエタノールとボンネットの解剖顕微鏡の横にある場所で郭清ツール (高級はさみ、デュモン #3 #5 鉗子) をスプレーします。

2. ラットまたはマウス脳解剖

注: 両方のマウス、ラットを使用できます。P8 はまた使用するかもしれないより古い動物 (我々 は P12 までテスト)、髄膜の取り外しはますます困難になるが。さらに、細胞収率と健康が低下し、複雑なプロセス、および組織の解離、細胞死に至る間壊れるかもしれない接続より古い動物から脳細胞が形成しているので。ここでは、皮質の準備を説明しますが他の頭脳領域も使用できます。

  1. 37 ° C の水浴中 0.05% トリプシン-EDTA を配置します。
  2. 安楽死 (E19 子犬または P0 P8 動物の妊娠ラット) ゆっくりと CO2濃度を上げることによって、脳を隔離します。次の手順では、生殖不能の技術を必要があります。
  3. 萌芽期ティッシュの場合は、まず胚を子宮から削除し胚嚢を開き、すぐに頭をハサミでカットします。すべてのヘッドが途中で切れているときは、予冷の解剖中に転送します。
    1. ヘッドは媒体に沈んでいる、一度、小脳をピンチと鉗子皮膚と頭蓋骨 (両方とも若い動物で非常に柔らかい) を開きます。慎重にレバーを持ち上げて、頭蓋骨の脳の残りの部分。
      注: 2 ~ 4 E19 胚解剖の日にメッキ皿あたりの 500,000 の細胞は皮質アストロ サイトの少なくとも 8 10 cm 皿のため十分な組織が得られます。
  4. 新生児やそれ以上の年齢の子犬の頭をはさみでカットし、内側頭の後ろから鼻の先端までの直線で皮膚を切断することによって脳を分離します。さておき、慎重にカット頭蓋骨の左し、右頭蓋骨骨までリフト肌を引き出します。小脳を切断し、頭蓋骨から脳の残りの部分のレバーします。
    注: 2 ~ 3 P0 P8 子犬解剖の日にメッキ皿あたりの 500,000 の細胞は皮質アストロ サイトの少なくとも 8 10 cm 皿のため十分な組織が得られます。
  5. 中脳の基になる構造体から大脳皮質を区切ります。無料それぞれの半球をピンチに (縦の割れ目に垂直な) 1 つの半球の皮質、中脳の構造の間に鉗子を移動半球間縦裂内で鉗子を配置します。
  6. 鉗子を使用して、それぞれの半球 (とその海馬) からすべての髄膜を削除し、別のなった。海馬アストロ サイトが必要な場合は、氷の上 14 mL 郭清培地 15 mL チューブに各海馬を移動します。
  7. 領域を削除さらにそれぞれの大脳半球の皮質から特定領域が必要 (例えば前頭葉) 場合。1 mm3を超える作品にアストロ サイトを生成するために使用する任意の大脳皮質組織をカットします。氷の上の郭清培地別 15 mL チューブで大脳皮質組織のすべての部分を収集します。

3. 組織の消化と解離

  1. すべての組織の部分が収集されると、管の底に沈殿するまで待機し、できるだけ多くの媒体を吸引します。
  2. 0.05% トリプシン-EDTA 血清ピペットを使用して 2-3 mL を追加し、20 分間 37 ° C の水浴のチューブを孵化させなさい。
    注: は、迅速組織部分をミックスして再度解決を許可するピペットからすべてトリプシン-EDTA を解放します。
  3. 慎重にチューブの下部に、可能な限り小さな液体としての組織部分を残して、トリプシン EDTA を吸い出しなさい。
  4. 残存トリプシン-EDTA を洗浄する予冷郭清培地 5 mL を追加します。ティッシュ部分の混合を達成するために管の上部の側にピペットします。
  5. 郭清培地を吸引し、できるだけ少量の液体としての組織の部分を残してください。予冷の解剖中 2 回以上洗濯を繰り返します。
  6. 最終的な洗浄ステップの後 DMEM + (部屋の温度に温め) 気泡を導入することがなくの 1,000 μ L ピペット チップとカップ刻んだピペッティングによる組織の上下を使用しての 1 つの mL を追加します。
    これはアストロ サイトが非常に敏感な液の pH を変更可能性があります、注意: 生産の泡を避けるために重要です。
  7. 50 mL チューブの開口部に 100 μ m セル ストレーナーを置き、前の予冷 DMEM + 4.5 ml フィルターをウェットします。
  8. セル ストレーナーに解離組織懸濁液の 1 mL のピペットし、別の 4.5 mL を追加事前冷却 DMEM + セル ストレーナーを介して、細胞を洗浄します。

4 継によるアストロ サイト濃縮用セルめっき

  1. 10 μ L トリパン ブルー色素の細胞懸濁液の 10 μ L を希釈して、検定にミックスをピペッティング、例えばのセルをカウントします。
  2. 12 mL DMEM + 10 cm 皿あたりの 500,000 の細胞をプレートします。
    注: DMEM + はアストロ サイトの成長に役立つニューロンまたはミクログリアのよりもっとそう。揺れ、中にウエル内でガラス coverslips に作用する物理的な力、(coverslips) なし 10 cm 皿に作用よりもはるかに強い。セルは、24 ウェル プレートに揺さぶられる場合、彼らは不健康になるか死にます。揺れの後 24 ウェル プレートにアストロ サイトをプレートのみです。
  3. 7 日間のインキュベーターで 37 ° C、5% CO2での細胞培養を維持します。
  4. 6 日目、揺れと細胞を継前日準備ペイ コート培養皿手順 5 で説明したよう。

5. 細胞の継

  1. 通過、前日 0.04 %pei と細胞培養皿をコートします。
    1. 免疫細胞化学、ウイルス伝達プラスミド トランスフェクションの 24 ウェルまたは 6 ウェル プレート (各を含む滅菌 12 mm または 25 mm ガラス基板、それぞれ) を使用します。
    2. ガラス coverslips を少なくとも 1 時間を 70% エタノールで消毒して、井戸、coverslips を配置する前に脱イオン蒸留水水で 3 回を洗ってください。
    3. 24 ウェル プレートで 12 mm coverslip あたり 0.04 %pei と 600 μ L 0.04 %6 ウェル プレートで 25 mm coverslip あたり少なくとも 70 μ L を追加します。
    4. 西部のしみまたは RNA シーケンス解析、解剖後セルを既に含む 10 cm 皿は使用を続行できます。動揺するだけで料理し、セルを 1 × PBS で洗浄して NB + H で扱われる (新しい料理への転送しない)。
  2. 日の in vitro (DIV) 7 郭清後、インキュベーターで研究室のシェーカーを DMEM + 細胞で 10 cm 皿に配置、6 時間 110 rpm で料理を振る。
  3. 脱イオン蒸留水水でコーティング coverslips からプリンスエド ワード島を 2 回洗浄します。NB + H の中を板 (500 μ L/ウェル 24 ウェル プレートと 6 ウェル プレートのウェルあたり 2 mL) に追加します。37 ° C と 5% CO2 10 cm 皿、揺れている間、少なくとも 30 分のためのインキュベーターでプレートを平衡事前。
  4. 6 h の揺れの終わりの前に 20-30 分前 1 x PBS、DMEM +、NB + H、および 0.25% トリプシン-EDTA 水浴中の 37 ° c を温めます。
  5. 6 h、揺れのシェーカーを培養皿を取るし、すぐに 10 ml (を含む動揺をニューロン、オリゴデンドロ サイト、ミクログリア) 媒体を交換後皿あたり 1x PBS で加温します。
    注: それはすぐに再アタッチ非アストロ サイト細胞を避けるために独立した細胞を含む古い培地を吸引することが重要です。
  6. PBS を削除し、皿あたり 3 mL に予め温めておいたトリプシン-EDTA を追加します。各皿 37 ° C、5% CO2でインキュベーターで 4 分間、インキュベートします。
    注: 西部のしみまたは RNA シーケンスのサンプルの準備している場合、トリプシン-EDTA を追加しないでください。代わりに、置換、PBS 12 mL NB + H の文化インキュベーターに配置することができますで加温。
  7. 5 mL 各 3 mL のトリプシン-EDTA + DMEM に予め温めておいた皿、ピペット 5 mL の血清ピペットを使用して皿からセル、50 mL のチューブに細胞懸濁液を収集を追加します。
    注: ピペット - 皿の底から直接料理の床はセルをデタッチと明確になるはず。のみ血清トリプシンを不活化 (代わりに DMEM +)、血清含有培地を使用します。
  8. 4 分 20 ° C で 3,220 × g の細胞懸濁液を遠心します。
  9. 上澄みを除去し、NB + H で加温 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します。

6 最後のアストロ サイト文化のセルめっき

  1. セルをカウントします。
  2. (ウェルあたり 2 mL NB + H 中) で 6 ウェル プレートのウェルあたり 20,000 セルまたは (の井戸あたり 500 μ L NB + H 中) 24 ウェル プレートのウェルあたり 5,000 の細胞をプレートします。
  3. インキュベーターでの培養細胞を 37 ° C、5% CO2でさらに処理または分析までにしてください。
  4. 週に一度半分の媒体を交換します。
    注: 低栄養環境でアストロ サイトの増殖を停止、任意の残りのミクログリアが増殖する (ただし、私たちの経験ではミクログリアの AWESAM 文化に掲載なし)。一週間を豊かな可能性のある残りミクログリア8、防ぎ、モノカルチャーは、少なくとも 3 週間は健康維持と半分の培地交換すること。

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結果

文化 (図 2) の 2 週間後の星状神経細胞と共培養、NB + 培地で成長しているアストロ サイトが表示されます。NB + 媒体に加えて、共培養アストロ サイトは彼らの生存と形態に貢献する可能性の高い未知のニューロン由来因子にさらされています。対照的に、(通路の前に他のセルタイプをふっ飛ばす) 後、DMEM + でモノカルチャーとして成長した MD アストロ サイトは 2 週間後に多角形表示されます。培養 2 週間後の細かい工程が多い星状後揺れ、NB + H で栽培 AWESAM アストロ サイトが表示されます。

我々 は以前 AWESAM アストロ サイトの RNA 発現プロファイルはアストロ サイト生体内でMD と immunopanned アストロ サイト4と比較した場合のそれに近いことを示した。アストロ サイト特異蛋白...

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ディスカッション

プロトコル内で 4 つのステップが重要です: 1) 濃度の小さい増加が未熟な文化、例えばにつながることができますので、正確に 5 ng/ml、HBEGF 濃度を準備、10 ng/mL HBEGF は解除アストロ サイト4に区別組織または pH を変化でき、アストロ サイトの健康を阻害する細胞を含むソリューションで 2) 回避の泡3) 事前それなくメディア健康アストロ サイト; 成長温度と最適 pH を達成するために(ただし、ミクログリアが見つかりませんでした AWESAM 文化のこれまでのところ)、4) 交換媒体を半分だけ週に一度任意の残りのミクログリアは十分な栄養素が存在し、メディアが増殖する可能性が低いので8交換定期的に。この最後の点では、アストロ サイトの生存・分化・増殖がサポートされる場合と、文化の中でアストロ サイト由来因子は完全削除されませんする必要があります、注意してくださいすることが重要です。

DIV14 またはより古い文化成熟アストロ サイトのソースと...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

我々 は、欧州研究評議会 (FP7/260916)、アレクサンダー ・ フォン ・ フンボルト ・財団 (Sofja Kovalevskaja) とドイツ研究振興協会 (DE1951 と SFB889) からの資金を認めます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.05%トリプシン-EDTAギブコ2530005437で暖かいです。使用前のCウォーターバス
0.25%トリプシン-EDTAGibco25200-05637ºで暖かいです。Cウォーターバス使用前
B-27サプリメントGibco17504-04450Xストック
GlutamaxGibco35050-061100Xストック
ペニシリン/ストレプトマイシンGibco15070-06350ストック;ペニシリン:5000 U / ml;ストレプトマイシン:5000 µg/ml
神経基礎中ギブコ21103049L-グルタミンなし
DMEM ギブコ41966029
HBEGFシグマ4643
HEPESギブコ15630080
HBSSギブコ14170112
FCSギブコ10437028
PBSギブコ10010049
1X 100 μmナイロンセルス
トリパンブルーシグマT8154 
細胞培養インキュベーターサーモフィッシャーサイエンティフィックHera Cell 240i 細胞培養インキュベーター
ラボラトリーシェーカーハイドルフロタマックス 120 細胞培養インキュベーター内で使用
遠心分離機Eppendorf5810 R 
はトレーナーBD352360・

参考文献

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