方法論記事

光分留と標準的な顕微鏡装置を用いたマウス中脳のドーパミン作動性ニューロン数の薬剤の評価

DOI：

10.3791/56103

⸱

2017年9月1日

 ,  , 
1Department of Neurology, University Hospital of Würzburg

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品には、標準的な顕微鏡装置 (すなわち、光学顕微鏡 (x、y、z のモーターを備えられたオブジェクト テーブルを使用してマウス中脳ドーパミン作動性神経細胞数の公平な薬剤推定手順プロトコル平面)、およびデジタル画像解析のためのパブリック ドメイン ソフトウェア。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

パーキンソン病臨床研究では、黒質中ドーパミン作動性ニューロンの損失の定量化を含む黒質線条体路の解析が不可欠です。合計ドーパミン作動性ニューロンの数を推定するには、公平なステレオロジー光分留メソッドを使用して現在のゴールド スタンダードと見なされます。光分留メソッドの背後にある理論は複雑、ステレオロジーが特別な装置なしに達成するために困難であるため、必要なソフトウェアを含むいくつかの市販の完全な立体システム純粋存在してセルの理由を数えます。専門ステレオロジー セットアップを購入はないので常に実行可能な多くの理由のため、このレポートは、方法を記述するドーパミン作動性神経細胞の薬剤の推定カウント標準的な顕微鏡検査機器、光学顕微鏡を使用してのイメージング ソフトウェアと解析のためのコンピューター オブジェクト テーブル (x、y、z 平面) モーターを備えられました。光分留メソッドを使用して薬剤の定量化を実行する方法のステップバイ ステップの説明は与えられたし、推定される細胞数算定のため事前にプログラムされたファイルが提供されます。このメソッドの精度を評価するために市販ステレオロジー装置から得られたデータとの比較を行った。匹敵する細胞の数は、こうして公平な立体のこのプロトコルの有効桁数を示すこのプロトコルとステレオロジー デバイスを使用して発見されました。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神経細胞数の定量化は、前臨床パーキンソン病研究では神経変性疾患中脳 (SN)1,2内のレベルを決定する極めて重要です。関心の領域で細胞数の公平な薬剤推定は、ゴールド スタンダード3,4、5と見なされます。

公平な立体の出現の前のセクションでのニューロンの数をカウント セル ニューロンがセクションで見えて来ること変数の確率を修正するプロファイルを操作することによって評価しました。最も一般的に使用される方法の 1 つは、アバクロンビー6によって記述された定量化された細胞数の補正だった。このメソッドは、隣接する薄いセクションで同じセルのフラグメントが見つかった場合に何度も示すことができる、細胞を考慮ましょう。したがって、アバクロンビーや他の作家は、形状、サイズ、およびカウントの細胞7,8の方向を知るのために必要な方程式を生成しました。ただし、これらの仮定された通常は実現し、したがって実際のセル数 (すなわちバイアス) からの系統誤差との分岐につながった。また、バイアスを追加サンプリング3縮小できませんでした。

光の分留を使用してセル番号の薬剤の推定直接定義された、3 次元ボリュームのセル番号を直接推定する数学的原理が適用されます。このメソッドの利点は、形状、サイズ、およびカウントされて細胞の向きについての仮定を必要としないことです。したがって、推定の細胞数は真の値に近い、サンプル サイズが増加3(すなわち、公平な) 近づきます。すぐに使える商用ステレオロジー システムが開発されているステレオロジーを使用して公平な方法を維持するとき多くの規則が続かれなければならないので (レビュー、シュミッツとホフ, 2005年4を参照してください)。特殊な立体システム実装図形、サイズ、分布、およびの向きから自立につながる薬剤の評価のために事前定義されているプローブとサンプリング方式のデザイン ベースの薬剤方法、分析4,9セル。ただし、市販の立体システムは高価です;これは新しい研究での実装に制限があります。

本研究の目的は SN、光分留方式を採用した、標準的な顕微鏡装置 (すなわち、光を用いたマウスにおけるドーパミン細胞数のデザイン ベースの薬剤評価のため使用可能な手法の開発、顕微鏡、顕微鏡の標準ソフトウェア、および電動 x、y、z ステージ)。このため、マウス脳組織を処理する方法、および公平な立体のデザイン ベースを用いた SN 細胞数を推定する方法についてステップバイ ステップ ガイドが表示されます。さらに、エラー (CE) の係数と推定される細胞数の計算のテンプレートが提供されます。

ここで説明したメソッドは、SN の分析に限定されていないが、マウスまたはラットの脳の他の解剖学的に定義された地域での使用に適応することができます。例えば、海馬10や11の軌跡青斑核神経細胞の数を推定する公平なステレオロジーを使用されています。さらに、アストロ サイト12とミクログリア13など、神経細胞以外の細胞型も同様に評価することができます。したがって、このメソッドは、科学者の研究で公平なステレオロジーを実装するつもりが、ステレオロジー システムを購入するお金の多くを費やすことをいとわないされてすることができます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ケアとの動物の使用のためのすべての該当する国際、国家、および/または制度ガイドラインが続いていた。Regierung ・ フォン ・ Unterfranken、ヴュルツブルク、ドイツの地方自治体によって承認されたプロトコル

。

1 です組織処理および免疫組織化学

  1. CO 2 等で安楽死マウス承認メソッド。
    2. 。
  2. 10 ml の 0.1 M リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 25 G 針と輸液ポンプを用いての Perfuse 6 12 週齢 C56Bl/6 n の雄マウス transcardially は 0.1 M PBS で 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 70 mL に続いて
    。 注意:PFA は、アレルギー性、有毒で発がん性
    3. 。
  3. 前 (図 25、Paxinos、フランクリン マウス脳アトラス 14) から +0.74 mm の領域で脳マトリックス スライサーとコロナの平面でマウスの脳を解剖します
    4. 。
  4. 4% で、SN を含む脳の背の部分を入れて浸漬固定のための 4 ° C で 1 d の 0.1 M PBS で PFA
    5. 。
  5. 低温保護のため 30% ショ糖/0.1 mol PBS 溶液の PFA を交換し、インキュベートする別の 2 d で 4 ° C
  6. 、Cryomold に脳の背の部分は、最適な切削温度 (OCT) でいっぱい入れて化合物し、液体ドライアイス冷却イソペンタンで組織をゆっくりと凍結します
    。 注意:ドライアイスは、非常に寒いです (-78 ° C);ドライアイスでの作業中、手袋を含む個人保護具 (PPE) を使用します。CO 2 でドライアイスが蒸発します。したがって、ヒューム フードの下で動作します
    7. 。
  7. 直列コロナの平面カット 30 μ m の低温電子顕微鏡セクションとセクション、開始前 (図 51、Paxinos とフランクリン マウス脳アトラス 14) から 2.46 mm で、前から 4.04 mm で終了を収集 (図 64、Paxinos、フランクリン マウス脳アトラス 14).
  8. は、保護剤の検討 (30% のグリセロール、30 %ethoxyethanol と 40 %pbs)-20 ° C で満ちている管に 4 つのシリーズを格納します。断面中に、脳幹の上部領域に小さな穴を貫通して右半球をマークします
    9. 。
  9. 免疫染色、セクションごとにマウスの 1 つの系列を選択します。1 h で 10% ヤギ血清 (NGS)/2% BSA/0.5% 洗剤 0.1 mol シェーカーで PBS の preincubate の浮遊セクション4 で一晩 2% NGS/2% BSA/0.5% 洗剤 0.1 mol PBS で希釈したウサギ抗マウス チロシン水酸化酵素 (TH; 縮尺希釈) 抗体とセクションを孵化 ° C
  10. 適用二次抗体ウサギ、室温で 2 時間 (1: 100 希釈) Igs は続いてアビジン ・ ビオチン試薬 (1: 100 希釈)。孵化し、3, 3-ジアミノベンジジン-tetrahydrochloride (軽打) と H 2 O 2 ステインします。被塗り物のスライドで、それらを染色後のセクションにマウントします
    。 注: TH + ドーパミンニューロン SN は、 図 1 a に表示されます。1 つの系列を染色によって平均 13 SN セクション、SN pars 緻密 (SNpc) とカン、尾側の部分に、吻側から伸びるの動物 ( 図 1 b) あたりステンド グラスします。セクションは 120 μ m (1/4 シリーズ) で区切られます ( 図 1 c).
    注意:軽打は発がん性が疑われるです。接触、吸入によって有毒であります。軽打で PPE を使用します
    11. 。

2。画像の取得

  1. キャプチャ TH 免疫染色 SN セクション デジタル顕微鏡に結合イメージング ソフトウェアを使用しています。1 つの系列の各セクションを別々 に分析します
    2. 。
  2. は、イメージング ソフトウェアのスキャン スライド オプションを使用します。高品質の画像 (図 2) の TIFF 形式で保存します
    。 注: 画像の解像度は 1 cm あたり 312 ピクセルです
    3. 。
  3. プレス " 取得 " 取得] ウィンドウ (図 2 a) を開きます
    4. 。
  4. 設定、ビニング " 2 " グレースケール画像
    。 注: カラー画像ではなくグレースケール画像の取得最終的なスタック画像ファイル (図 2 a) のサイズが小さくなります
    5. 。
  5. をクリックして " ショーの生きている " セクションのライブ画像を表示新しいウィンドウを開くにアクイジション ・ ウィンドウで (図 2 と b).
    6. クリックして
  6. " ステージ " アクイジション ・ ウィンドウで。選択 " スライド スキャン " ドロップ ダウン メニューとチェック ボックス (図 2 c).
    注: これにより、集録と 13 μ の全範囲をカバー z 平面で 1 μ m の連続する画像間距離で画像をスタックの取得と同様、x、y 平面の非常に拡大、SN イメージ (630 X 倍率) の配置m.
  7. 2.5 X 目的 SN を検索するを選択します
    8. 。
  8. X. 63 に目標を変更
  9. をクリックして左上隅 (左上) (図 2 c) および右下隅 (LowRight) (図 2 d) 部を定義 " セット "
    10. 。
  10. をクリックして " Z シリーズ " して、" Z 平面シリーズ " ボックス (図 2 e).
    11. イメージング ソフトウェアを使用してセクションごとの
  11. を決定する 3 つのランダムに選択されたカウントでセクションの実際のマウントされた厚みのサイト。これをクリックして " ビュー上部のオフセット " (図 2 e) セクションの上部を定義し、をクリックする " ビュー上部の停止 " (図 2 f)。その後、つけ " ビュー下部のオフセット " (図 2 f)、[クリックして " ビュー下部の停止 " (図 2 g)。断面の厚みを書き留めます
    12. 。
  12. を引く 3 μ m (ガード ゾーン) 上からオフセットし、上のオフセット スロット (図 2 h) に結果を入力します。上オフセットの数字から 13 μ m (光 disector の高さ) を減算し、下部オフセット スロット (図 2 i) に結果を入力します。次のパラメーターを選択: 手順、14;サイズ、1.00 (図 2i).
    注: これは 13 μ m、連続する画像間の 1 μ m の距離の z 平面の厚みに対応しています
    13. 。
  13. (図 2 j) ファイルを保存するディレクトリを選択します
    14. 。
  14. をクリックして " シーケンス " 集録 (図 2 j) を開始する
    15. 。 [
  15. ] をクリックして " 処理 " し、次のパラメーターを選択: " すべての平面、" から " シーケンス; " " モンタージュ; " と " 高速 " と " ステッチ " 10% (図 2 k) の画像の重なりで囲まれたボックス。クリックして画像をステッチを開始 " を開始 ".
    注: これは解析のための画像をスタックが生成されます (図 2 l 図 3 a -e).

3。薬剤評価のシーケンス

  1. ソフトウェア バージョン 4.7 NIH ImageJ を用いた SN スタック画像の分析を実行します
    2. 。
  2. ImageJ.nih.gov のウェブサイトからの必要な 2 つのプラグインのダウンロード: " グリッド オーバーレイ " プラグイン 15 と " 細胞カウンター " プラグイン 16。前述の両方のプラグインをインストールします
    3. 。
  3. 公平な薬剤の評価のためには、次のようにカウント パラメーターを定義: グリッドのサイズ、130 × 130 μ m; カウント フレーム、50 × 50 μ m と光 disector 高さ 13 ・ #181; m.
  4. をクリックして画像を開いて " ファイル " → " オープン " (図 4 a) を使用してイメージの尺度を設定します " 分析 " → " 縮尺の設定 " コマンド (図 4 b)。この手順では、定義されたサイズをピクセルから μ m (図 4 c) に変更します
    。 注: 分析画像 425 ピクセル対応 100 μ m にします
    5. 。
  5. 選択、" プラグイン " → " グリッド " → " グリッドの種類: 行 " グリッドをランダムに挿入するコマンド。チェック、" ランダム オフセット " ボックス。グリッド (グリッド) 内の 1 つの正方形のサイズ 130 μ x 130 μ m として指定 16,900 μ m 2 ( 図 3 b と 図 4 d と e) を = します
    6. 。
  6. 変更のイメージの種類から 16 ビット RGB カラー (をクリックして " 画像 " → " 型 " → " RGB カラー ") (図 4 階)。バケー募集しています ら で説明されているように、SNpc を検索します。 17、SNpc を取り囲んで、" ペイント ブラシ ツール " (ブラシの幅: 11) ( 図 3 c と 図 4 g -私)。
    7. 。
  7. 元に戻す、" スケールを設定 " をクリックしてコマンド " 分析 " → " 縮尺の設定 " → " スケールを削除するをクリックして " (図 4 j -l) ではなくピクセル単位で計算のパフォーマンスを有効にするにはμ m よりです
    8. 。
  8. は、スクリーン ショット (図 4 m)、イメージ ファイルを保存し、ImageJ (図 4 n) で新しいファイルを開きます。選択 " ポイント " (図 4 o) と 25 (図 4 p) のブラシの幅。すべてのグリッド正方形光 disector (図第 4 四半期) の配置をその連絡先 SN をマークします。完全にローカライズされているすべての光学 disectors またはアウトラインの SN の内で部分的に細胞数の分析を実行します
    9. 。
  9. は、SN の部分を含む 1 つのグリッドを選択します。(図 4 r) で開始する x と y を定義する ImageJ にカーソルがこの正方形の左上隅の座標測定
    。 メモ: 座標は、光 disector を用いた位置決め用挿入されます、" 光 disector 位置 " (図 4)、手順 4 で説明した
    10. 。
  10. と題してスプレッドシート テンプレートを使用して光の disector 位置を計算 " 光 disector 位置、" 手順 4 で説明した
    11. 。
  11. をクリックして光 disector (マクロ クリストファー s. 病棟、補足のファイル に記入) を調整する " プラグイン " → " マクロ " → " 編集 " (図 4 t) を開き、" opt_dis_grid.txt " (図 4 u) ファイルを開き、定義のサイズ、" usergrid " 光 disector (図 4 v) の y 次元 x に対応するピクセル単位。50 μ x 50 μ m のサイズを選択すると、212.5 ピクセル (50 x 4.25 ピクセル) として、usergrid の 1 つの側面のサイズを定義します
    12. 。
  12. は、光 disector (図 4 v) の中心を定義する ImageX および ImageY の座標を挿入することによってスタックのイメージで光の disector の位置を決定します。マクロを実行 (" マクロ " → " マクロの実行 ") (図 4 w).
    注: グリッド ( 3 d 図 し、図 4 x) スタックのイメージから消滅するでしょう。光の disector も保持されます ( 図 3e と 図 4 x) z 面で下に移動します
    13. 。
  13. 選択 " プラグイン " → " セル カウンター " カウンター プラグイン (図 4 y) を開始します。細胞カウンターを初期化し、(図 4z) のマーカーの種類を選択します。画像をズームイン (をクリックして " + ") 及び 200% の拡大率で細胞数の薬剤の評価を行う
    14. 。
  14. 識別ドーパミン作動性神経細胞の円形または卵形形状とセルのサイズによって ( 図 1 a)。薬剤の規則を使用してセルの数を定量化します
    。 注: 光学 disector は 3 次元キューブ ( 図 5 a) なので除外として、左前側面とキューブ (赤) のトップの側面を定義します。したがって、ドン ' t カウント TH + 細胞その赤い線 (左、フロント) またはトップ側と接触。細胞数の結果を権利、準備されたスプレッドシート ファイルに追加 " 細胞数の計算 " (ステップ 5).
  15. SN 画像によると次の細胞数の光 disector を配置する次のグリッドを計算する場合、y の手順を覆うグリッド ( 図 5 b) のサイズと " 光 disector 位置 "スプレッドシートのテンプレート、手順 4 で説明した
    16. 。
  16. 用いた細胞数の推定を実行、" 細胞数の計算 " スプレッドシート (手順 5).

4。Disector 位置を用いた光の計算、" 光 Disector 位置 " スプレッドシート テンプレート

  1. サイズと上を覆うグリッド SN (アウトライン内に配置するそれぞれの光 disector の位置を計算 図 5 b)使用して、" 光 disector position.xlsx " スプレッドシート ファイル (補足のファイル).
  2. Μ m あたりのピクセルの変換を挿入で定義されている、" スケールを設定 " の黄色マークの位置に、コマンド、" 光 disector position.xlsx " ファイル ( 図 6a と 補足ファイル).
  3. オレンジのマークの位置に光 disector の計画されたサイズと (μ m) で 1 つの側面の長さによって定義された、上を覆うグリッドのグリッドのサイズを挿入します
    。 注: 結果のオレンジ色のボックスの横にある赤い箱に描かれている
    4. 。
  4. の出発点として決定された SN アウトライン内で四角形のグリッドでスタート (1 グリッドの正方形で始まるにように選択ステップ 3.9、上).
  5. 挿入の x と y 座標を (この最初の四角形内で光の disector の中心が計算され、結果が青のボックスで描かれているために、これらの値は、x、y 座標を使用して) によってファイルの緑色のボックスに 3.9 のステップで測定されます。Opt_dis_grid.txt マクロ (補足のファイル) を実行します
    6. 。
  6. 最初のグリッド広場 (茶色のボックス) を基準にしてグリッド正方形距離 (単位正方形の数) を挿入することによって x, 連続光 disectors の y 座標を計算します
    。 注: + x: グリッドの右側にあります。-x: グリッドの左にあります。y: グリッド正方形; 下に位置しています +-y: グリッドの上にあります。灰色のボックスに結果が表示されます
    7. 。

5。使用セル数の推定、" セル数の計算 " スプレッドシート

  1. 出版した動物 (N) 数式を使用して 1 回 + SN セルの数が推定計算西 ら によって.、1991 年 3、どこ ∑ Q - は TH + ニューロン 1 つの脳のセクションのすべての光 disectors でカウント数の合計として定義されている
    。 注: セクション (t) の厚みの測定に関連して光 disector (h) の高さは、方程式に含まれます。エリア サンプリング分数 (asf) は光学 disector (光 disector) フレーム サイズ (x、y のステップ) のグリッドの正方形のサイズ内の領域 (A) の割合として定義されている (光の disector/A x, y ステップ) ( 図 3 b) とセクション サンプリング分数 (ssf) は、連続全体カットの脳の部分の割合として定義:
    figure-protocol-1
    高品質の定量的見積もりの係数エラー (CE) は、0.10 よりも低くする必要があります。CE Keuker ら によって、数式を使用してを決定します, 2001 10:
    figure-protocol-2
  2. それぞれの SN 内細胞数の薬剤の評価のため。マウス、マウスあたり生成される系列の合計数、光 disector、x、光 disector (、光 disector、μ m 2 で)、x、y グリッド正方形 (x、y のステップ部 y 地区の高さについて示されている情報を挿入、μ m 2 で)、平均 (μ m) で黄色のボックスを使用してセクションの厚さを測定し、" 細胞 count.xlsx の計算 " スプレッドシート ファイル ( 図 6 b と補足ファイル).
  3. 手順 5 で説明したように同じ動物から各 SN セクションを分析します
    4. 。
  4. 挿入細胞数各光 disector 灰色のボックス内の各行は 1 つの SN」を参照し、使用して、" 細胞 count.xlsx の計算 " スプレッドシート ファイル (補足のファイル).
    注: 推定の細胞数と計算される CE 青のボックス ( 図 6 b) で描かれている
    5. 。

6。商業利用可能な立体システムを使用して細胞数の推定

  1. ドーパミン SNpc の推定開始セル数をクリックして " プローブ " → " 光分留ワークフロー " 光分留を開くにはワークフロー ウィンドウ
    。 注: 新しいウィンドウがポップアップのかどうか SN の新シリーズはカウントするつもりを決定します
    2. 。
  2. をクリックして回 + SN セクションの新シリーズを開始 " 新しい件名を開始 " ポップアップ ウィンドウで
    3. 。
  3. 光の分留ワークフローの別のステップを通過します。最初のステップで件名を設定します。このため、捜査官を挿入 ' の名前、件名 ' s 名 (SN グループ)、および他の有用な情報。この SN をカウントするセクションの番号を挿入します。カット組織切片の厚さを挿入します。この場合は 4 セクションの間隔を挿入します。手始めにランダムに決められたセクション番号を挿入します
    4. 。
  4. 2 番目の手順では、低倍率 (2 × 対物) と選択に顕微鏡をセット " マグ レンズ X 2 " メニューから
    5. 。
  5. ステップ 3 で、バケー募集しています ら による記述で、SNpc は、マウスの左ボタンで関心領域をトレースします, 2009 17。
    6. 。
  6. は、顕微鏡を手順 4 で高倍率に設定します。このため、100 X に目的を変更し、選択 " 100 倍マグ レンズ " ドロップ ダウン メニューからです
    7. 。
  7. 手順 5 で焦点を当ててセクションの下部と上部にマウントされた厚さを測定します
    8. 。
  8. ステップ 6、50 × 50 μ m としてカウント フレーム サイズを定義; 光学 disector (x, y) のサイズです
    9. 。
  9. ステップ 7 で 130 x 130 μ m として体系的なランダム サンプリング (SRS) グリッドのサイズを設定します
    10. 。
  10. 手順 8 で 3 μ m ガード ゾーンを入力します
    11. 。
  11. 9 の手順で設定を保存します
    12. 。
  12. は、最後に、光 disectors 光の分留ワークフローの手順 10 で SRS グリッド内のそれぞれの TH + ドーパミン作動性セルをカウントします。このため、開始をクリックして、" カウント " ボタン
    13. 。
  13. をクリックして 1 つのセクションを終えた後、" 次のセクションを開始 " 同じ SN シリーズの次の SN のセクションの光の分留ワークフローを開始する] ボタンをクリックします
    14. 。
  14. 1 つの SN シリーズの最後の SN セクションが定量化されてときに、クリックして " 私 ' ve 完了カウントします "
    15. 。
  15. をクリックして、" ビュー結果 " ステレオロジー サンプリングの結果を表示するボタンです
    16. 。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

提案手法は, TH + 右 SN 7,363 と 7,987 セル間であったのと、SN、左のドーパミン作動性ニューロンの推定数を使用して、7,446 7,904 細胞間。したがって、ドーパミン作動性ニューロン (± SEM) の平均数は、SN 右と左の SN 7,675 ± 66 7,647 ± 83 細胞だった。各動物のため計算される CE は 0.08 より低かった (範囲: 0.073 0.079) (図 7)。商業的に特殊な立体を用いたこの方式の比較可能性を確認するためには、ステレオロジー セットアップ (図 8) を使用して SN セル番号も定量化しました。カウント パラメーター: グリッドのサイズ、130 × 130 μ m;カウント フレーム、50 × 50 μ m;ガード ゾーン、3 μ m の範囲のセクションを行った 100 x 1.25/開口 BX53 顕微鏡の目的。TH + SN ニューロン 〜 7,067 8,105 セル/SN ...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ステレオロジーは、ティッシュの処理から始まります。SN 組織のシリアルの切削は、解析中にセクションの損失を防ぐために慎重に行う必要があります。さらに、1 つの重要なステップは、ステレオロジーを実行するとき、SN の左から右を区別するために 1 つの半球をマークします。脳幹の上の部分に小さな穴を配置すると、提示された研究で最良の結果が生成されます。また、組織が光分留メソッド要求の使用以来、免疫、抗体、中に他のインキュベーション流体組織の浸透でより一般的に使用される 5-10 μ m ではなく、約 30-40 μ m の厚さのセクションでカットします。免疫組織化学染色保障されなければならない、このような洗剤を使用しています。

免疫は、SN から内側のある腹側被蓋野 (VTA) 内回抗体ラベル SN ニューロンとニューロンを用いたドーパミン作動性ニューロンのドパミン神経細胞染色します。したがって、別の臨界点 sn ステレオロジーを実行するときは、標準的な免疫組織化学的または組織学的染色によって専ら SN ニューロンを視覚化することはできませんのでマウス SN 解剖学の知識です。代わりに、...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. w. i.、メルツ医薬品、LLC、テバ; の科学的なボードを務めていますイプセン、メルツ医薬品、LLC は、アラガン株式会社からの旅行のための資金を受けた応募作品外メルツ、テバと、アラガン社からスピーカーの謝礼を受けた。J. V. ボストンサイエンティフィック、メドトロニック、および AbbVie のコンサルタントを務めて、提出した応募作品外メドトロニック、ボストンサイエンティフィック、AbbVie、ビアル、アラガン社、および GlobalKinetics から謝礼を受けた。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、専門家の技術援助; Keali Röhm、ルイザ Frieß、平家メンツェルに感謝してヘルガ Brünner 動物のケアのためにクリストファー s. 病棟の生成と ImageJ ソフトウェアの光 disector グリッドのプラグインの配布します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Paxinosマウスアトラスマウス脳 ジョージPaxinos キースB.J.フランクリンCopyright @2001 アカデミックプレスCD ROMデザイン&ポールハラス
マトリックススライサーマウスZivicインスツルメンツBSMAS 001-1
パラホルムアルデヒドメルク1040051000
ショ糖/ D(+)サッカロスロス4621.1
イソペンタンRoth3927.1
GlycerolMerck1040931000
EthanolSigma Aldrich32205-1L
NameCompanyカタログ番号コメント
リン酸緩衝生理食塩水成分:
塩化ナトリウムSigma Aldrich31434-1KG-R
リン酸二水素カリウムメルク1048731000
リン酸二ナトリウム二水和物メルク1065801000
塩化カリウムメルク1049360500
正常なヤギ血清DakoX0907
ウシ血清アルブミンΣA4503-100G
トリトンX-100シグマ アルドリッチX100-100ml洗剤
3,3-ジアミノベンジジン-テトラ塩酸塩/DAB錠 10mg pH 7.0ケムエンテック4170
H2O2/ 過酸化水素 30%メルク1072090250
アビジン/ビオチン試薬Thermo Scientific32050Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100
rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibodyabcamAb1121:1000
ビオチン化ヤギ-抗ウサギ IgG H+Lベクター研究所BA-10001:100
StereoInvestigator version 11.07MBF
BX53 microscopeOlympus
VisiviewVisitron Systems GmbH3.3.0.2
Axiophot2Zeiss
ImageJ softwareNIHVersion 4.7
Tissue-TEK OCTSakura4583
ドライアイス
グリッド オーバーレイ プラグインWayne Rasbandhttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
セルカウンタープラグインKurt de Voshttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). 
光学式二分線マクロクリストファー・ウォード
C57Bl/6N 雄マウスチャールズ川、ドイツ
SuperFrost Plus コーティングされたオブジェクトスライドランゲンブリンク、ドイツ
25G ニードル Microlance 3BD300400
REGLO アナログ輸液ポンプIsmatecISM 829
StereoInvestigator システムStereoInvestigator バージョン 11.07
BX53 顕微鏡BX53 顕微鏡
自己整列立体学Visiview
Axiophot2Axiophot2
脳

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11(2017).
  2. Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).
  3. West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
  4. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  5. Tieu, K. A guide to neurotoxic animal models of Parkinson's disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), e009316(2011).
  6. Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec. 94, 239-247 (1946).
  7. Rose, R. D., Rohrlich, D. Counting sectioned cells via mathematical reconstruction. J Comp Neurol. 263 (3), 365-386 (1987).
  8. Weibel, E. R., Gomez, D. M. A principle for counting tissue structures on random sections. J Appl Physiol. 17, 343-348 (1962).
  9. West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog Brain Res. 135, 43-51 (2002).
  10. Keuker, J. I., Vollmann-Honsdorf, G. K., Fuchs, E. How to use the optical fractionator: an example based on the estimation of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions of tree shrews. Brain Res Brain Res Protoc. 7 (3), 211-221 (2001).
  11. Mouton, P. R., et al. The effects of age and lipopolysaccharide (LPS)-mediated peripheral inflammation on numbers of central catecholaminergic neurons. Neurobiol Aging. 33 (2), e427-e436 (2012).
  12. Barreto, G. E., Sun, X., Xu, L., Giffard, R. G. Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct. PLoS One. 6 (11), e27881(2011).
  13. Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).
  14. Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2001).
  15. Rasband, W. Grid_Overlay.java. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html (2010).
  16. De Vos, K. cell_counter.jar. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2010).
  17. Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse. Neuroscience. 161 (4), 1082-1090 (2009).
  18. Fu, Y., et al. A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse. Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).
  19. German, D. C., Manaye, K. F. Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat. J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).
  20. Smeyne, R. J., et al. Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice. PLoS One. 11 (10), e0164094(2016).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

関連記事