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方法論記事

全体の睾丸針によるゼブラフィッシュを精原細胞の凍結保存に超急速冷却浸漬

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DOI:

10.3791/56118

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2018年3月4日

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1Department of Aquaculture, Szent István University

この記事について

サマリー

本研究の主な目的は、針を合わせて全体のゼブラフィッシュ精巣を凍結保存するガラス (NIV) の手順を浸漬でした。さらに、5 つの異なるゼブラフィッシュ系統における法の再現性がテストされました。

要約

科学とバイオ テクノロジーの現在の傾向は、何千ものそれによって繁殖コロニーを維持する一般的なプラクティスを超える遺伝資源の安全な保管のための新しい方法の必要性につながるモデル有機体内の新しい行の作成に します。本研究の主な目的は、針を合わせて全体のゼブラフィッシュ精巣を凍結保存するガラス (NIV) の手順を浸漬でした。初期段階全体精巣生殖細胞の凍結保存わたしを楽しめ、ゼブラフィッシュの貯蔵のため遺伝資源移植後彼らは雄性と雌性の配偶子に成熟することができます特に以来。精巣を摘出、2 凍害メディア (1.5 M メタノールと 1.5 M プロピレング リコール; 平衡ソリューションと 3 M ジメチルスルホキシドと 3 M プロピレング リコールを含むガラス固化ソリューション) で平衡鍼灸針の固定液体窒素に墜落しました。サンプルは、3 つの結果として地球温暖化ソリューションのシリーズで暖められました。この手法の主な利点 (1) 精子の不足は、暖められた精巣のため下流の操作が容易の消化後(2) 超急速冷却液体窒素したがって冷却と凍結保護剤、その毒性を低減の必要濃度の削減を最大化する組織の最適な露出を有効にします。(いくつか精巣の凍結保護剤と液体窒素への露出 3) 同期(4) の再現性は 5 つの異なるゼブラフィッシュ系統で 50% 以上の生存率を得ることによって示されます。

概要

科学とバイオ テクノロジーの新しいトレンドは、マウスやショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ モデル有機体生物医学的でおよび他の科学の1として使用される他種の新しい突然変異系統の何千もの作成につながっています。さらに、新技術の開発し、利用可能になるが、突然変異系統の数は着実に2を増加します。これの繁殖コロニーを維持する一般的な慣行を超えて遺伝資源の安全なストレージの必要性に します。凍結保存を不特定期間の遺伝資源の安全な保管を可能にする方法としては繁殖期の延長は親魚、継続的なメンテナンスの必要性を回避して、それはより多くのコスト-のように多くの利点を提供していて、労働効率2。

過去数年間2,3,4中に開発された精子凍結保存のためのプロトコルは、ゼブラフィッシュ男性遺伝物質の正常なストレージのための機会を提供しています。しかし、卵や魚の胚の凍結保存は、まだ彼らの複雑な構造と卵黄素材の大量のためことはできません。最近では、始原生殖細胞 (PGCs) 精原幹細胞 (Ssc) の移植の実践は機能的な精子や卵子に移植5後開発することによってこの障壁をバイパスをご利用いただけます。したがって、Ssc の凍結保存には、希少で貴重な遺伝資源の保全の新たなフロンティアが提供しています。

でも、凍結は、多くの利点を提供しています、緩速凍結過程は細胞損傷の2につながる可能性がありますいくつかの条件を生成します。細胞内および細胞外凍結、脱水、凍結毒性が挙げられます。細胞内氷被害、細胞、細胞外の氷は細胞から緩速凍結中の水の拡散は脱水6につながる可能性がありますしながら細胞の機械的粉砕する可能性があります。最近では、魚の配偶子7,8,9の凍結保存で氷形成の負の影響を防止する手法としてガラスを適用されています。それは、内部および外部のメディアに氷7,10に 0.28-0.5% なし/ガラスの非晶質状態に超急速冷却法を提示します。精巣や卵巣組織のガラス化を成功が証明されて鳥と哺乳類10、11,12、こうして魚、同様の応用の可能性を開きます。

本研究では全体のゼブラフィッシュ精巣の凍結保存用浸漬針ガラス (NIV) の手順を提案する.ゼブラフィッシュ初期生殖細胞汚染も初期生殖細胞の比較的高い金額を他の細胞、特に精子の低い存在を生み出すため凍結のプロセスを分離するための信頼性の高い方法を紹介します。我々 の知る限り、これは魚の生殖腺組織およびゼブラフィッシュ生殖細胞の超急速冷却のため詳細な可視化プロトコルを示す最初の研究。さらに、メソッドの再現性、5 つの異なるゼブラフィッシュ系統に示されて: AB 野生型、キャスパー (ロイ-/-;真珠-/-)、ヒョウ (レオt1/t1)、ヴァーサ号 [Tg (vas::eGFP)] ウィルムス腫瘍 [Tg (wt1b::eGFP 1)] 形質転換線。

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プロトコル

ここで説明したすべてのメソッドは、ハンガリー語の動物福祉法によって承認されています。

1. 試薬の準備

  1. 貯蔵液
    1. 1 M トレハロースを準備するには、それが完全に溶けるまでよく dH2O. ミックス 1 mL にトレハロース二水和物の 0.378 g を追加します。
    2. 1 M ショ糖を準備するには、それが完全に溶けるまでよく dH2O. ミックス 1 mL の中にショ糖の 0.342 g を追加します。
    3. 1 M HEPES を準備するには、それが完全に溶けるまでよく dH2O. ミックス 1 mL に HEPES の 0.238 g を追加します。
    4. 100 mg を 5 mL の PBS に追加することによって 20 mg/mL コラゲナーゼ (290 U/mg) を準備します。それが溶けるまで徹底的にミックスします。0.2 μ m のフィルターを通して無菌フィルター。0.2 mL PCR に 50 μ L 分注チューブし、- 20 ° C で凍結
    5. 15 mg/mL のトリプシンを準備 (~ 10000 U/mg) 75 mg を 5 mL の PBS に追加することによって。それが溶けるまで徹底的にミックスします。0.2 μ m のフィルターを通して無菌フィルター。0.2 mL PCR に 50 μ L 分注チューブし、- 20 ° C で凍結
    6. 1 mg/ml DNase 私 (〜 3000 U/mg) 5 mg を 5 mL の PBS に追加することによって。それが溶けるまで徹底的にミックスします。0.2 μ m のフィルターを通して無菌フィルター。0.2 mL PCR に 50 μ L 分注チューブし、- 20 ° C で凍結
    7. 0.4% トリパン ブルー色素を準備するには、10 mL の PBS にトリパン ブルー色素の 40 mg を追加します。0.2 μ m のフィルターを通して無菌フィルター。1.5 mL チューブに分注 1 mL。
    8. 200 mg/L の MS を準備-222 (Tricaine メタン スルホン酸) それが完全に溶けるまでよく dH2o ・ ミックスの 1 L に MS 222 の 200 mg を追加します。さらに、バッファーの 7.0 の中性 pH に重炭酸ナトリウムで MS 222 ソリューション。
  2. ガラス化のためのソリューション
    1. 平衡ソリューション (ES) を準備: ES の 2 mL をメタノール (メタノール; 1.5 M), 121.5 μ L を混合することによって準備プロピレング リコール (PG; 1.5 M) の 220 μ L FBS (10%)、トレハロース ストック溶液 (0.1 M)、HEPES 原液 (25 mM) を 50 μ l 添加し、2 に L-15 の 1208.5 μ L の 200 μ L の 200 μ L mL のチューブ。
    2. ガラス固化ソリューション (VS) を準備: PG (3 M)、ジメチルスルホキシドの 426 μ L の 439 μ L を混合することによって対 2 mL を準備 (私2だから; 3 M)、200 μ L FBS (10%)、トレハロース原液 (0.1 M)、HEPES の 50 μ L を 200 μ l 添加のストック ソリューション (25 mM) とに L-15 の 685 μ L、2 mL 管。
  3. 地球温暖化のためのソリューション
    1. 地球温暖化の解決策 1 (WS1) の準備: FBS (10%)、スクロース原液 (3 M) の 450 μ L の 150 μ L を混合することによって 2 mL チューブに WS1 の 1.5 mL を準備および L-15 の 900 μ L。
    2. 地球温暖化の解決策 2 (WS2) の準備: FBS (10%)、スクロース原液 (1 M) の 150 μ L の 150 μ L を混合することによって WS2 の 2 mL チューブ 1.5 mL を準備および L-15 の 1200 μ L。
    3. 地球温暖化の解決策 3 (WS3) の準備: 混合 150 μ L FBS (10%) 2 mL チューブに WS2 の 1.5 mL を準備および L-15 の 1350 μ L。
  4. 消化ソリューションを準備: の各サンプルは、コラゲナーゼ原液 (2 mg/mL) の 50 μ L、トリプシン原液 (1.5 mg/mL) の 50 μ L を混合することによって消化液の 500 μ L を準備、DNase の 10 μ L 私 (20 μ g/mL) と 2 mL の L-15 390 μ 管します。
  5. 解剖用具を得る: はさみや刀、ピンセット、ピンセット、鍼治療の針。

2. 精巣コレクション

  1. 200 mg/L の MS を含んでいる皿に配置することによって魚を安楽死させる-222 (pH = 7)。郭清を続行する前にエラが動いて停止した、その少なくとも 10 分が低酸素によって死を確認するその瞬間から渡されたことを確認します。
  2. ペーパー タオルを軽くたたいて魚を乾燥、解離性のマットに背側に置きます。
    1. まず簡単に郭清の骨盤と胸ひれを切った。
    2. 水平方向に胸鰭の間魚の腹の皮膚を切り取るし、臀鰭まで皮膚と腹に沿って基になる筋肉をカットします。
    3. 魚の体腔を開き、針を使って解剖マットに左と右の体壁を固定します。
      注: 精巣がスイミング膀胱 (図 1) の両側に消化器官の上にあります。
  3. 汚染を防ぐためには、胃腸の器官を取り出して、軽く 1 つの側面にそれらをプッシュしていない反対側から精巣を削除します。精巣は、体壁に接続されているので慎重にそれらを削除し、接続の腹膜を刀でカットします。
  4. さらに、汚染を防ぐためにまず滅菌精巣 70% のエタノールの 2 s、およびその後の場所にそれらを置くことによって氷の上の 96 ウェル プレートの L-15 でそれら。
    注: それが必要な場合、脂肪組織からは大きくてきれいな精巣血管は、実体顕微鏡下で正確に

3 精巣組織の超高速冷却

  1. サンプルの種類に応じて適切なラベル マーク針入力し、平衡 (ES) とガラス固化ソリューション (VS) を準備します。
  2. 滅菌鍼治療の針に大きいのウェル プレート皿とピン 2、3 精巣 (以上針のサイズによって) に精巣を転送します。
    1. まずピンセット上に精巣を位置します。精巣の真ん中に針のポイントを置き、慎重にピンセットで精巣を引き上げてください。
    2. 精巣を穿刺後ゆっくり引き上げます針の上部。精巣は互いから分離され、彼らがないから落ちるまたは滑っていることを確認します。
    3. ガラスまで L-15 と 2 mL チューブに固定された精巣では、針に満たされた場所 (25 ° C; にストレージ時間を超えない 1 h)。
      注意: 針の睾丸が固定されるべき精巣が乾燥するを防ぐために高速。
  3. 平衡のソリューションに精巣に針を転送し、25˚C で 5 分間インキュベートします。
  4. ガラス固化ソリューションに針を転送し、, 30 25˚C で s。
  5. ガラス固化ソリューションから針を削除します, 迅速かつ優しく滅菌ペーパー タオルで組織から残りの溶液を吸収します。精巣ペーパー タオルに付着または落下を避けるために注意を使用します。
  6. すぐに発泡スチロールの箱は、液体窒素に針を配置します。
    注: は、すぐにティッシュの液体窒素の蒸気への露出を避けるためこの手順をしないでください。液体窒素の低ボリュームを使用すると、サンプルのクロスコンタミネーションを防ぐため。
  7. 5-10 分のクローズド発泡スチロール ボックスで液体窒素に針をしてください。
  8. 開設 4.5 mL cryotube と同じ箱にそのキャップを precool します。
  9. 5-10 分後に液体窒素の表面の下の別の cryotube に各針を転送し、cryotube を閉じます。
    注意: は、常に時 (絶縁手袋) などの防護服を使用して露出は重度の凍傷をもたらす液体窒素を使用します。
  10. 金属の杖の上に cryotube を置き、できるだけ早く精子の容器にそれを配置します。キャニスター ストレージ内のサンプルを格納使用までデュワー。

4. 地球温暖化の手順

  1. それぞれの針を別々 に暖かい。25 ° C で、すべて地球温暖化ソリューションが必要
  2. 金属の杖から cryotube を外し、発泡スチロールの箱に格納されている液体窒素に突入します。
  3. (鉗子を使用して) 液体窒素の蒸気で、cryotube を開き、液体窒素に針をリリースします。
  4. 針を最初の温暖化のソリューションに非常に高速転送し、(25 ° C) で 1 分間インキュベートします。転送中に空気で地球温暖化を防ぐためにすぐに針を転送することを確認します。
  5. 2 番目の地球温暖化ソリューションに針を転送し、(25 ° C) で 3 分間インキュベートします。
  6. 3 地球温暖化ソリューションに針を転送し、(25 ° C) で 5 分間インキュベートします。
  7. 下曲がりピンセットで内側にスライドさせる針から精巣をリリースします。10% を添加した L-15 の 250 μ L に満ちた個別井戸 (96 ウェル プレート) に個別にそれぞれの暖められた精巣 FBS。サンプルによると井戸が分類されることを確認します。ウェル プレートまですべてのサンプルが暖めている氷の上、さらに仕事までを保ちます。

5. ティッシュの消化力

  1. 独立した 2 mL の管で各サンプルに対して解離液の 500 μ L を準備します。サンプルのコードによるとチューブにラベルを付けます。室温で 5 分間準備解離ソリューションを孵化させなさい。
  2. 消化液に温めた組織を追加し、小さなハサミの少なくとも 30 の動きによって小さな断片にそれをカットします。
  3. 25 ° C で 90 分間振動板の切断組織を孵化させなさい。
  4. FBS の L-15 と 100 μ L の 400 μ L を追加することによって消化力プロセスを停止 (10% FBS v/v)。簡単にソリューションを振るし、1 分室温で孵化させなさい。
  5. 1.5 mL チューブに 50 μ m のフィルターを通して得られた解決策をフィルターします。チューブをそれに応じてラベルします。
  6. 25 ° C で 10 分間 200 × g でフィルタ リング ソリューションを遠心します。
  7. 慎重に上澄みを除去し、10% を添加した L15 の 20 μ L でペレットを再懸濁します FBS。手動でペレットを完全に溶解するまで管を振る。さらに使用するまで細胞懸濁液または 4 ° C で氷の上を保ちます。

6. 生存率評価とセルを数える

  1. 細胞懸濁液と適切にラベル付けされた 0.2 mL PCR チューブの中 0.4% トリパン ブルー溶液 5 μ L ミックス 5 μ L。別のボリュームを使用している場合ことを確認希釈率 1:1 のまま。
  2. この懸濁液室温 (25 ° C) で 1 〜 3 分の間孵化させなさい。
  3. 顕微鏡下で検定の各サンプルの実行可能性を確認してください。
  4. 15 の分野で (トリパン ブルーによる無染色) 生細胞数をカウントします。20 μ m の細胞懸濁液内のセルの合計数を計算します。懸濁液は、すべてのダウン ストリーム アプリケーションの準備が整いました。
    注意: より大きなボディサイズと他の種の手順を最適化するときは、同じ重みの精巣フラグメントを使用します。結果に個々 の変動を避けるためにすべての実験群の 1 人の個人から精巣を使用します。ゼブラフィッシュ、場合我々 を利用した事実を左と右の精巣が等しい (または非常に類似した) 生殖細胞13数を含める必要があります (代表の結果を参照してください)。左の精巣は右精巣凍結融解中コントロールとして保たれました。生存率の割合を求めた新鮮な精巣から分離した細胞の数と比較して凍結融解精巣から分離した細胞の数。

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結果

平均では、魚の大きさに応じて 40,000 および 200,000 の細胞間単一新鮮なゼブラフィッシュ精巣から分離された初期生殖細胞の数で変化。すべての 5 系統で新鮮なゼブラフィッシュ精巣を消化、初期生殖細胞細胞懸濁液 (図 2) で現在のセルだけがなかった。初期生殖細胞の横に多数の精子がも見つかりました。その一方で、凍結保存した精巣の消化後はるかに少ない精子があった。これは、精子ではこの超高速の冷却プロトコルは生きていけないくらいクリーナー懸濁液が生殖細胞の初期段階をもたらす消化プロセス中に除去と思われることを示した。

3 AB ゼブラフィッシュ男性 (一方通行 ANOVA の新鮮な精巣の消化によって示される単一の個々 の左と右の精巣 (1 ± 0.5 × 105対 1.1 ± 0.7 × 105) 間初期生殖細胞数に有意差はありませんでした。;...

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ディスカッション

本研究の主な目的は、針を適応する鳥類と哺乳類10、11,12魚の精巣 (モデルとしてのゼブラフィッシュの凍結保存するために開発された超高速冷却手順を浸漬生物)。ゼブラフィッシュ遺伝子資源の凍結保存に関する従来の研究のほとんどは、ゼブラフィッシュ精子2,3,4の凍結保存に主に集中しました。但し、成熟卵子および胚の凍結保存のためのプロトコルが開発されていないけれども、にもかかわらず、いくつかの最近の研究の初期段階卵子を保存を示す、説得力のある14,15。本研究で我々 はゼブラフィッシュ精原細胞の移植後、彼らは両方の男性と女性の配偶子

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

本研究は、国立の研究、開発および革新ハンガリー オフィス (ÁH にグラント 116912) 費用事務所に支えられ (食品と農業コスト アクション FA1205: AQUAGAMETE)、Stipendium Hungaricum 奨学金プログラム (ザンビアにグラント)、新ハンガリー国家卓越性また、博士課程フェローシップ (EK にグラント)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
リーボビッツ培地 (L-15)Sigma-AldrichL1518L-グルタミン添加
シ胎児血清 (FBS)Sigma-AldrichF9665
トリカインメタンスルホン酸 (MS-222)Sigma-AldrichE10521
HEPESSigma-AldrichH3375
スクロースAcros Organics57-50-1
トレハローアクロス オーガニックス99-20-7二水和
物メタノールReanal20740-0-08-65
プロピレングリコールReanal08860-1-08-65
ジメチルスルホキシドReanal00190-1-01-65
コラゲナーゼGibco9001-12-1
トリプシンSigma-AldrichT8003
DNase IPanreac AppliChemA3778
Trypan blueSigma-AldrichT6146
ホスケート緩衝生理食塩水)Sigma-AldrichP4417Tablets for preparation of 200 ml PBS solution
物 ウス Phospate buffered saline (PBS)Sigma-Aldrich P4417 Tablets for preparation of 200 ml PBS solution(DNase I Panreac AppliChem A3778 トリパンブルー Sigma-Aldrich T6146

参考文献

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