蚊幼虫における遺伝子の機能解析の遺伝子配達ベクトルとして組換え蚊 Densovirus を使用

サマリー

良品組換えネッタイシマカdensovirus (AaeDV)生体内での配信システムを開発する、人工イントロン小 RNA 発現戦略を使用して報告します。建設、パッケージング、および幼虫の感染に関しては同様に rAaeDV のベクトルの定量分析のための詳細な手順を説明します。

要約

体内のインジェクションは、個体の遺伝子の機能を解析するための最も一般的に使用される遺伝子転写法です。ただし、このメソッドはより操作を技術的に厳しいが必要ですし、小型、比較的薄く、壊れやすいキューティクル ・高い死亡率は、そのアプリケーションを制限するために幼虫に使用される場合は特に、複雑な手続きが含まれます。対照的に、遺伝子ウイルスベクターは、細胞外と細胞内の障壁を克服するため開発されています。これらのシステムは、簡単な操作、高い遺伝子導入効率、遺伝子発現、長期的な保守、生体内で永続的な効果を生成する能力の利点を持っています。蚊濃 (MDVs) が蚊に固有の小型の単一座礁させた DNA のウイルスを蚊細胞に外国の核酸を効率的に配信できます。ただし、交換または遺伝子組換えウイルスを通常作成する配信ベクトルとしてこれらのウイルスの開発への障壁である包装やレプリケーションの能力の損失が発生します。

症例人工イントロン小さな RNA 発現戦略を使用して良品組換えネッタイシマカdensovirus (AaeDV)生体内での配信システムを開発します。建設、包装、rAaeDV ベクトルの定量的解析と幼虫の感染症のための詳細な手順を示します。

本研究に留まらず、初めて、良品組換え MDV マイクロ RNA (miRNA) 式システムを開発、蚊の遺伝子の機能解析のための強力なツールを提供するのための基礎を確立、ウイルス paratransgenesis 蚊媒介疾患を制御するためのアプリケーションです。我々 は、ヒトスジシマカ1^st幼虫が簡単かつ効果的に感染するサイト、幼虫の水体にウイルスを導入してとノザンまたは倒すため開発 rAaeDVs が実証、幼虫は、蚊の機能解析のツールを提供する遺伝子の特定のターゲット遺伝子の表現。

概要

マラリア、デング熱、ジカ熱、黄熱などの蚊媒介性疾患は、グローバル感染症負担^1,2のかなりの割合を考慮して引き続き主要な国際的な公衆衛生の問題です。ベクトルへの応答で使用されている、従来の殺虫剤は、蚊媒介性疾患の予防のための持続可能な統合された蚊コントロール戦略の主要なコンポーネントです。しかし、このような戦略は、比較的非効果的な蚊個体群^3,4の耐性の進化と同様に、関連付けられた否定的な環境影響のため望ましくないか証明しています。これらの理由から、制御及び滅菌雄蚊を生産する遺伝子組換え方法蚊の代替方法を緊急の必要性があるし、病原体耐性蚊のリリースは、有望な新しい制御戦略として生じています。効果的な新しいコントロールのメソッドなど生体内で遺伝子デリバリー、蚊の遺伝子機能の包括的な分析のための安全かつ効果的なアプローチが必要を開発します。

直接マイクロインジェクション プラスミド DNA の二重鎖 RNA (dsRNA) または小さい干渉の RNA (siRNA) は蚊の遺伝子生体内で最も一般的に使用される配送方法。実際には、蚊のトランスジェニック系統の生産は、まだ胚マイクロインジェクション^5,6、7のプロセスに依存します。ただし、インジェクションには、いくつか制限があります。まず、この方法は技術的に難しく、複雑な手順が含まれます。第二に、注入は胚、幼虫、蛹、大人は、対象生物の生存に直接影響する物理的な侮辱を発生します。第三に、ほとんど水生生息地に住んでいるし、うごめく運動特性を所有しているので蚊族幼虫のマイクロインジェクションを固定化することは困難です。第四に、1^st-2^nd幼虫のサイズは 10 〜 20 倍より小さい 4^thよりも前者のキューティクルと古い幼虫齢より繊細です。これらの機能で、1^st-2^nd幼虫に比べて古い段階のものを操作することが難しくなっています。組み合わせることで、これらの要因は、大人⁸と比較して幼虫 (約 5%) の減少の投与後生存率に貢献します。ウイルス ベースの配信システムは、関連付けられている細胞外および細胞内の障壁を克服するために開発されています。これらのシステムは、簡単操作、高伝達効率、式の長期的かつ堅牢なレベルおよび生体内で永続的な効果を生成する能力の利点を持っています。したがって、レトロ ウイルス、レンチ、およびアデノ ウイルスを利用した配信システムが広くされている遺伝子は、哺乳細胞およびモデル種を使用しました。シンドビス ウイルス発現システムは、大人の蚊; で遺伝子機能を解析する以前使用されていたしかし、バイオ セーフティの懸念のほか、注射はウイルス感染⁹のための必要なプロセスではまだです。DsRNA ソリューションで幼虫を浸漬による口頭配達は可能な配信方法として以前報告されていますが、小さな RNA 機能解析¹⁰に適してはないです。だから、効果的なウイルスの配信方法は、蚊のまだ開発されなければなりません。

蚊濃 (MDVs) は、 ParvoviridaeとBrevidensovirus¹¹の属内のすべてが 1 つの秋のDensovirinae亜科の一部です。MDV ウイルス粒子はエンベロープを持たないとから成っている単一座礁させた DNA ゲノムと正二十面体のキャプシド (20 nm の直径)。ウイルスのゲノムは約 4 kb のサイズを宿主細胞の核内でレプリケートされます。MDVs 環境で比較的安定しているし、蚊の高い特異性と宿主範囲を表示します。これらのウイルスは広がり、蚊個体群の自然を保持する可能性があるし、ほとんどすべての臓器や腸、キイロショウジョウバエマルピギー細管、体脂肪、筋肉、ニューロンと唾液腺¹²を含むこれらの昆虫の組織に侵入することができます。

そのまま MDV ゲノムはプラスミドを用いた感染性クローン; を生成するプラスミッドのベクトルに subcloned できます。これらのクローンは、蚊のセルに配信されると、ウイルスのゲノムはプラスミッドのベクトルから抽出され、感染性ウイルス粒子が生成されます。MDV は小さな一本鎖 Dna ゲノムがあるため感染性クローンが簡単に構築されているし、ウイルスのゲノムは、簡単操作で^11,13をすることができます。これらの特性は、MDV 蚊生物を調べるため貴重なエージェントを作る。しかし、ほぼすべてのウイルスのゲノムはウイルス増殖に不可欠な外来遺伝子の挿入または交換組換えウイルス作成の損失が発生ウイルスの包装および/またはレプリケーションの能力を作成する、遺伝子配達ベクトルとして MDVs の開発のための障壁。ここで、報告するシステムを開発する良品 rAaeDV生体内RNA 配信簡単プラスミド構築の利点と作り出すことができる機能的なウイルスのメンテナンスがある人工のイントロン小さな RNA 発現戦略を使用して野生型のウイルスを必要とせずホスト細胞の長期かつ安定的発現。また、この方法は、幼虫の簡単な伝達のできます。

本研究では次の手順でプロトコルの記述: 1) rAaeDVs イントロンの小さな RNA 発現カセット、2) C6/36 パッケージング細胞を用いた組換えウイルス粒子の生産をエンコーディングのデザイン ライン、3) 細胞の定量的解析rAaeDV ゲノム コピー番号、および 4) 幼虫の生息地の水の体にウイルスの直接導入によるAe。 ヒトスジシマカ幼虫の感染症。全体的にみて、この作品は、特定の Rna または標的遺伝子過剰発現したり開発 MDV の配信システムを使用して蚊の幼虫でノックダウンを示した。

プロトコル

のすべてのプロトコルは、倫理委員会の南方医科大学によって承認されました

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1 人工イントロンを設計

注: この作業で使用する人工のイントロンは 65 bp の長さ、およびシーケンスは 5 ' - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 '。

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1. Hpa を配置私だから、Hpa の人工イントロンの両端に制限サイト私消化はプラスミド ( 図 1 を参照) からイントロンを解放できます
。
2. 2 つ Xba 私だから、Xba のイントロンで制限サイト私消化を使用と小さな RNA 式シーケンスを挿入できます
。
3. は、DNA の製造元から人工のイントロンのフルレングスの dna 塩基配列の化学合成を注文します。合成 DNA 作成標準 pUC19 プラスミドにクローニングからです
   。 注: 人工のイントロンの不可欠なコンポーネントを含める、5 を含むいくつかのコンセンサス塩基配列要素 ' ドナー スプライス部位 (DS)、GUAAGAGU、UACUAAC、ポリ ピリミジン順序で保存されているブランチ ポイント シーケンス (BPS) シーケンスシーケンスの UCUUC(U) ₁₀ と、3 管 (PPT) '-GAUAUCCUGCAG ( 図 1 A) シーケンスとアクセプタ スプライス サイト (AS)。2 Xba 私制限のサイトは DS と小さな RNA 式シーケンスを挿入する使用ことができます BPS の間導入されました。哺乳類と蚊の細胞からこの人工イントロンを効果的に接続する機能が以前確認された ¹⁴ されています
。

2。設計、人工イントロン小さな RNA 発現カセット

注: 過剰発現または内因性マイクロ Rna のノックダウンは、DS と BPS 間 miRNA 前駆体や miRNA スポンジを符号化するシーケンスに挿入されました。例として、miRNA 発現とノックダウンの組換えウイルスベクターを構築する ヒトスジシマカ Ae。 aal-せ-7 から内因性前駆体 miRNA が選ばれました。アンチ let 7 スポンジは、上記の方法 ¹⁵ に従って設計されました。幼虫における標的遺伝子をノックダウンするには、特定人工 miRNA (amiRNA) またはオンライン ソフトウェア ^{16 , 17} を使用して短いヘアピン RNA (shRNA) シーケンスを考案例、V ATPase のサブユニットとして、mRNA (加盟なし。本研究ではターゲット遺伝子として AY864912) が選ばれました。AmiRNA に以下 amiVTP として参照されます。プレ-マイクロ Rna、スポンジ、amiRNA、shRNA のすべてのシーケンスの詳細 補足表 1 で説明します

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1. 前駆体 Mirna、miRNA スポンジと Xba の shRNA の完全長 cdna の化学合成を注文私 DNA メーカーから両端に制限のサイト
。
2. チューブの下部にすべて乾燥 DNA であることを確認する 1 分 g は、順序付けられた DNA スピン 10,000-14,000 x で DNA ブロックを含むチューブを受信した後です
。
3. 乾燥 DNA を DNase 自由水に 10 ng/μ L の最終的な集中を達成するために再懸濁します
。
4. ダイジェスト プラスミド バックボーンと DNA Xba 私 37 ° C 1 時間の配列しし、dephosphorylate、5 ' 牛小腸アルカリホスファターゼ (CIAP)、メーカーによると、線形プラスミッド バックボーンの両端 ' s プロトコル.
5. 65 で 60 分間の加熱で不活性化 CIAP ° C
6. は 1.0% の agarose のゲルを実行し、線形のバックボーンをカットします。製造元、次ゲル抽出キットを使用してゲルのスライスから DNA を抽出 ' の指示
。
7. Ligate 1 h. 22 ° C で backboneby T4 DNA リガーゼ (5 U/μ L) に DNA のフラグメント
8. ステップ 2.7 有能な エシェリヒア属大腸菌 (E. 大腸菌) にセルおよび (濃度 100 μ G/ml) にアンピシリンを含むホストゲノム スープ (LB) 寒天プレート上にプレートから ligation の反作用の製品を変換します。
   1. 熱衝撃法 ¹⁸、適切な エシェリヒア属大腸菌 を使用して変換を実行するひずみ。たとえば、熱ショック変換の 大腸菌 の菌株 DH5α を使用します
   。
9. ピックから単一コロニー 2.8 をステップ、3 mL の文化に豊か (100 μ g/mL の濃度) で中含まれているアンピシリン
。
10. 次のメーカー小型準備キットを使用して細菌文化からのプラスミド DNA の抽出 ' の指示。DNA シーケンスの会社にサンプルを送る
    。 注: 過剰発現または内因性マイクロ Rna のノックダウン、miRNA 前駆体や miRNA スポンジを符号化するシーケンスは 2 つの間挿入された Xba 私のサイトします。MiRNA 発現またはスポンジの構造をすべてを 400 未満にする必要がありますウイルス ¹⁹ 包装制限のため bp (ウイルスのゲノムの長さの 10%).

3。プラスミドのバックボーンに miRNA や shRNA 発現カセットを複製することによって rAeaDV のコンス トラクターを生成する

注: pUCA pUCA プラスミド AaeDV のゲノムを含んでいるから成る感染性クローン (3,981 nt) ¹⁹、教授ジョナサン ・ カールソンによって提供された親切と以前詳細 ¹¹ に記載されています。p7NS1 した DsRed 非構造蛋白質 1 (NS1) を表現-p7 プロモーターからの赤色けい光たんぱく質 (下流) 融合タンパク質とされている ¹⁴ の他の場所の詳細について。人間固有のミール-941-1 前駆体 ²⁰ そのスポンジ、スクランブル shRNA (CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG) がまた subcloned ネガティブ コントロールとして AaeDV に

。

1. 私はサイト Hpa にプレ-マイクロ Rna、スポンジ、shRNA や、amiVTP 式カセットを縛る pUCA プラスミド バックボーン プロトコル手順 2.7 に 2.4 で説明されているように AaeDV NS1 コーディング領域
。
2. DNA に変換 Stbl3 有能な エシェリヒア属大腸菌 細胞し、2.8 に 2.10 の手順で説明するよう肯定的なクローンを選択します
。
3. 次の製造元マキシ準備キットを使用して細菌の細胞から rAaeDV プラスミドを抽出、これに続く ' の指示
   。 注: Stbl3 または Stbl4 エシェリヒア属大腸菌 のセルは rAaeDV DNA 変換不要 ITR 再結合を最小限に抑えるために活用されなければなりません。マキシ準備を使用すると、抽出 rAaeDV プラスミド DNA の大規模な量を取得する必要があります (> 100 μ g)。RAaeDV プラスミド性シーケンスは、ウイルスを生成する前に、DNA シーケンシング ²¹ によって常に分析必要があります
。

4。RAaeDV プラスミドを持つ株 c6/36 細胞

1. 文化 C6/36 セル ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 1640 培 10% 牛胎児血清 (FBS) と 28 ° C の定温器で 1% ペニシリン/ストレプトマイシン
。
2. 0 日プレート 10 25 cm ² 培養フラスコで細胞遺伝子導入の 90-95 %1: 2 の希釈で合流するセルを分割する前に 18-20 h.
   注: 1 日目で細胞達するべきである 90-95% 合流
。
3. 1 日 transfect rAaeDV プラスミド ²² のシリーズを持つセル。
   1. 600 μ L の微量遠心チューブに RPMI 1640 媒体での 10 μ g の DNA を希釈、軽く混ぜます。一方、準備 RPMI 1640 媒体の 600 μ L とトランスフェクションごとのトランスフェクション試薬を 25 μ l 添加します
   。
   2. 室温 (RT) で 5-10 分間加温。1640 トランスフェクション試薬の混合物の 625 μ L を 1640 プラスミド DNA の混合物に追加します
   。
   3. 加温室温 20-30 分のこの混合物トランスフェクション効率を促進する前に RPMI 1640 媒体の 2 mL で 2 回セルを洗浄しています
   。
   4. インキュベーション後、RT (ステップ 4.3.3) 25 cm ² フラスコに the1640 トランスフェクション試薬 DNA プラスミドの混合物を追加し、28 で 6 h 間インキュベート ° C
   5. 約 6 h 後トランスフェクションを削除トランスフェクション メディア RPMI 1640 培地 5 mL で 2 回洗浄し、10% RPMI 1640 媒体を追加 FBS
      。 注: rAaeDV Ae。 ヒトスジシマカ 幼虫の感染 (95%) の率を示しています; しかし、感染した幼虫のほぼ 50% に、我々 の経験で感染が主な感染部位 (例えば、肛門乳頭と毛細胞) なしに制限普及 ²³。したがって、複数組織の幼虫に感染する必要がある、蛍光蛋白を発現する欠陥組換えウイルスが感染感染部位の可視化を有効にするのにする必要があります。たとえば、表現した DsRed 欠陥組換えウイルスを生成するは、p7NS1 した DsRed を上記の手順に従って c6/36 細胞にヘルパー プラスミド cotransfected にする必要があります (失うか濃度の比は 2:1 にする必要があります).

5。トランスフェクション c6/36 細胞からの rAaeDV 粒子を収穫

1. 収穫細胞トランスフェクション後 5 日。取り除くし、培養液中で上下ピペット 5 mL ガラスのスポイトで料理の細胞を中断します。すべての細胞懸濁液を滅菌 15 mL チューブに転送します
。
2. -80 ° c またはドライアイス ・ エタノールお風呂 30 分間での凍結し、37 で解凍 1 分 ° c. の渦は、フリーズとフリーズ解除手順を繰り返します 3 回
。
3. 4 °C.Collect 上澄みで 20 分の 4,800 x g でサンプルを遠心し、ペレットを破棄します。その後、0.22 μ m シリンジ フィルターを上澄みを通過します。最終精製ウイルス粒子の-80 で在庫の因数とストア ° C
   メモ: は、凍結融解の繰り返しをしないでください
。

6。RAaeDV の定量化

1. DNA の準備標準。Hpa とすべての rAaeDV プラスミドをリニア化、ゲル抽出キット ²⁴ 消化の製品を浄化して
。
2. 絶対定量標準曲線を構築し、上記の方法 ²⁵ によるとウイルスの力価を測定します
。

7。蚊伝達

1. 洗浄 100 1 ^st Ae。 ヒトスジシマカ 幼虫 3 回脱イオン水、してその後、幼虫を 95 mL の脱イオン水を入れたビーカーに転送します。RAaeDV 株 (1.00 コピー 10 10/mL の x の最終濃度) 5 mL を追加します
。
2. インキュベート 24 28 ° c、h 3 幼虫を脱イオン水を使用する洗うし、その幼虫をプレートに転送し、定期的にフィードします
。
3. は、qPCR または西部のしみ (結果を 図 3、4 に示す代表) と幼虫のターゲット遺伝子発現のレベルを監視します
   。 注: 蛍光信号の検出法より正確に感染した幼虫を分離する使用できます。たとえば、幼虫が下流を発現する組換えウイルスに感染してから蛍光信号を検出する幼虫凹面スライド上に配置でき感染 2 日後まですべての 8 h 倒立蛍光顕微鏡下で観察されました。蛍光の幼虫が検出されると、以降連続観測を許可する個々 のプラスチック テスト カップに分離する必要があります。幼虫感染した複数の組織では、このメソッドを使用して識別できます
。

結果

RAaeDV 建設のための戦略
蚊幼虫における下流遺伝子を表現する欠陥 rAaeDV ベクトルが生成されました。結果のプラスミドは、VP 蛋白質を削除 (図 1A) と NS1 した DsRed 融合タンパク質カセットを含まれています。miRNA の発現コンストラクトを含む rAaeDV プラスミド、miRNA スポンジ、shRNA および amiRNA は (図 1Bに示すように) 設計されていた。たとえば、rAaeDV ベクターはノザン aal-せ-7 蚊類幼虫に生成されました。結果のプラスミドには、ウイルス NS1 エクソン (図 1B) イントロンの pre-aal-せ-7 カセットが含まれています。蚊類幼虫 (

ディスカッション

2 つの rAaeDV の建設を制限する重要な障壁を克服するために重要です。最初の欠陥組換えウイルスの生産です。MDV を適切に表現するベクトル スコーピオン昆虫固有 neurotoxins20 と GFP タンパク質などの外国の遺伝子のサイズとして使用できることが報告されています。ただし、建設方法に関係なく MDV の Orf を挿入または外因性の遺伝子を交換したらウイルス粒子を形成できません独自ヘルパー プラスミドは行方不明の不可欠なウイルス蛋白質を供給する cotransfected しない限り。不良のウイルスが生体内で欠損ゲノムと蚊の発生する二次伝達に従事することができます。我々 の結果は、蚊に外来遺伝子の効率的な配信を有効にする欠陥ゲノム MDVs の限界を克服することができます新しいパラダイムを提供するイントロン式戦略を検証します。

2 番目は、カプシドのサイズによって課された組換えウイルスのゲノムの要求の長さの制限です。効率的なパッケージングは、ゲノムのサイズは 4,400 ヌクレオチド (wt MDVs ゲノムの長さの 110%) を超えることはで...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
遠心分離機	Thermo Scientific	75004260
遠心分離システム	ベックマン・コールター	363118
GeneJET ゲル抽出キット	Thermo Scientific	K0691
E.Z.N.A. プラスミド ミディキット	Omega Biotech	D6904
精製寒天	OXOID	LP0028A
FastAP感温性アルカリホスファターゼ(1 U/µL)	Thermo Scientific	EF0651
FastDigest HpaI	Thermo Scientific	FD1034
FastDigest XbaI	Thermo Scientific	FD0684
T4 DNA Ligase (5 U/µL)	Thermo Scientific	EL0011
TransStbl3 Chemically Competent Cell	Beijing Transgen Biotech	CD521-01
Ampicillin	北京天源バイオテック	RT501
プロテイナーゼK	プロメガ	MC5008
スーパーリアルプレミックスプラス(SYBRグリーン)	北京天源バイオテック	FP205