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方法論記事

水生動物使用グループ固有の rDNA プライマーの遺伝的腸内容分析の研究プロトコル

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⸱

DOI:

10.3791/56132

⸱

2017年10月5日

 , 
1Institute for Environmental Sciences, University of Koblenz-Landau, 2Institute of Integrated Natural Sciences, University of Koblenz-Landau, 3IV 2.5 (Trace Analysis, Artificial Pond and stream system), Federal Environment Agency

この記事について

サマリー

動物の最も一般的な腸内容の分析は、視覚的な。餌生物の形態の多様性についての強烈な知識を必要とする、彼ら柔らかい bodied 獲物を逃すし、獲物の強力な粉砕により、ヨコエビ類を含むいくつかの生物はほぼ不可能。昆虫の詳細な斬新な遺伝的アプローチ獲物ヨコエビの国会で身分証明書を提供します。

要約

食物網の分析は、生態系の理解を深めるために不可欠です。たとえば、食物網の相互作用は、非在来種の侵入によって引き起こされる深刻な変更を受けることができます。ただし、フィールドの捕食者-被食者相互作用の正確な同定は多くの場合困難であります。これらの分析は、腸内容の視覚的評価や安定同位体比 (δ15N そして δ13C) の分析にしばしば基づいています。形態学上の多様性や捕食生物の正確な同定の障害につながる、個々 の餌生物から同位体署名このようなメソッドは、それぞれ、包括的な知識を必要です。浸軟、経口摂取と餌生物の消化によって特定の種の同定困難ため visual 腸内容分析は特に柔らかい bodied 餌生物を過小評価します。したがって、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) による戦略、たとえばグループ特定のプライマー セットを使用、食物網の相互作用の調査のための強力なツールを提供します。ここでは、核リボソーム デオキシリボ核酸 (rDNA) のグループ特定のプライマー セットを使用してフィールドから消費者を昆虫の消化管内容物を調査するための詳しいプロトコルについて述べる。DNA がすることができます (小分類) の場合全体の標本から抽出またはフィールドの標本の消化管内容物から。存在と DNA のテンプレートの機能の効率テスト個人から直接確認する必要がある普遍的なプライマーを用いた DNA のそれぞれのサブユニットをターゲットに設定します。また、ポリアクリルアミドのゲルを使用して後続の一本鎖コンフォメーション sscp 解析と変更されていないグループ固有のプライマーと PCR によって種レベルまでさらに組み合わせて消費獲物を定めることができることを示します。さらに、ラベルとして異なった蛍光染料の使用できる並列スクリーニング自動化されたフラグメント解析による複数の腸コンテンツ サンプルから別の獲物グループの DNA のフラグメントを示す.

概要

栄養相互作用と食物網動態の大半を占める捕食者-被食者の相互作用、物質と食物網内および生態学の主要な目標の 1 つである生態系間を通してエネルギーのフラックスを特徴付ける重要な側面1。 ソースの決意と炭素と栄養素の流れは生態系2間の生態的結合の理解を促進します。ただし、有機物および栄養素のフラックスも生物3の動きには、川などの流域の生態系はだけはリンクされません。したがって、これらのシステムをリンクしているリソースの流れを中断する生息地の変化強く変更できます両方生態系の食物網だけでなく直接、また、間接的捕食者-被食者コミュニティのそれぞれの構成を変更することによって。たとえば、単一の捕食者の種 (例えばニジマス)4の動きにリンクする食物網の変化が示されています。このような変更は潜在的生物多様性と水界生態系の機能を脅かします。したがって、フィールドにおける捕食者-被食者の相互作用の分析水生生態系のネイティブの生物多様性、水管理など、人為的な環境変化の影響を判断することが不可欠です。

栄養連携を追跡は複雑なシステムで難しいので、フィールド5の相互作用の評価を有効にするいくつかのアプローチを確立されています。従来、供給分野における相互作用の調査は切り裂かれた根性のままに獲物の視覚的な識別に基づいています、獲物の形態学的多様性に関する広範な知識を必要とします。視覚的腸内容分析は消費者 (例えばの季節変動ダイエット ロブスター6魚7,8または餌の好みのカイアシ類) のいくつかのグループのリソースの使用に洞察力を提供しています。ただし、消化の物理的なプロセスは visual 腸内容分析を困難、通常柔らかい bodied 獲物生物9をミスします。種の液体摂取によって餌または集中的に摂取、ヨコエビ類のような前に餌を comminute いくつかの無脊椎動物の消費者のため消化管内容物の餌種の視覚的な識別は不可能10です。これらの制限のための分子解析は、有望な代替手段を提供します。

分子解析は、消化管内容物の迅速かつ的確な獲物の検出を許可する一般的なツールとなっています。このような技術の範囲は多様な: モノクローナル抗体またはポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) に基づく戦略頻繁にされる、彼らの高い特異性と感度11のため。新しいモノクローナル抗体の開発は時間とコストがかかる、抗体が11を既に存在しない場合したがって、他の分子技術の応用はより便利です。デオキシリボ核酸 (DNA) のように普遍的なプライマーを使用して、ほとんどの種で現在の ribosomal リボ核酸 (RNA) 遺伝子の領域の増幅は12,13を設定する一般的な方法です。この手法を使用して、頻繁にしない DNA14の混在のソース内の餌生物の全範囲を特定することが可能です。このような欠点を避けるために効果的な方法は、グループ特定のプライマーを使用する遺伝的腸内容分析の設定です。特定のターゲット グループの DNA 領域だけを増幅し、すべて他種15,16を除外するように設計、グループ特定のプライマーはせず指定したグループの分類学的レベルの餌生物の同定を有効にします。時間とコストのかかる二次分析。ただし、すべての腸の内容分析のようなそのような分析は摂食行動のスナップショットのみを提供します。したがって、自然なトレーサーの時間統合 (例えば、安定同位体) の解析と分子腸内容分析を組み合わせると、有益な1,2と見なされます。

ここでは、PCR に基づく調査核リボソーム DNA (rDNA) 領域のグループ特定のプライマー セットを使用した同じ試料の安定同位体比分析と組み合わせること捕食者-被食者の相互作用の詳細な方法について述べる。Agarose のゲルの電気泳動で単一獲物グループの DNA の検出について述べる。また、プライマーの特異性より高い分類の解像度が必要なときに該当するようなグループ固有プライマーの PCR 産物のさらに下流解析のための機会を紹介します。単一鎖 DNA (ssDNA) フラグメント フォーム第三構造の一次配列17によって決定される、ためこのようなグループに固有のプライマーによって増幅断片の小さな変化は構造変化に します。このような変更は、ポリアクリルアミドゲル17,18, (種レベル) の摂餌生態のより正確な識別を有効にすると一本鎖コンフォメーション sscp 解析によって検出できます。

Agarose のゲルの電気泳動は DNA のフラグメントを視覚化し、おおよその長さ19、解像度を決定する一般的で安価なツールは DNA の量に依存し、染色染料使用20。通常、可視化はまっすぐ進む純粋な DNA のサンプルを使用する場合、獲物の少ない潜在的消費者の消化管内容物の DNA、agarose のゲルの電気泳動の結果の得点が複雑に。まだ、この検出方法は画面の 1 つのフィールドから消費者の標本数が少ないことは不可能またはいくつか獲物のグループが、得点の合併症なりますサンプル数が高いスクリーニング複数獲物イチイは非常に時間の集中的なとこの実行不可能。高感度の検出法は、さらにフラグメント21の正確な長さの定量を可能にするキャピラリー電気泳動によるフラグメントの自動分析です。ラベルとして異なった蛍光染料を使用して、検出および自動フラグメント解析22,23で対等な長さのさまざまな断片を判断をすることが可能があることいくつかのマイクロ サテライトによる研究を示した 24。したがって、また提案する複数の獲物から DNA の並列検出のための詳しいプロトコル ラベル グループ特定のプライマー セットと自動シーケンサーによる自動フラグメント解析による検出 PCR を使用してグループ。さらに、自動化されたフラグメント解析による獲物の DNA の検出がまた摂取した獲物の相対的な定量化を可能にするアプローチであることを示す事例から結果を報告する.

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プロトコル

1 ですフィールドから動物を収集し、遺伝子の腸内容分析のサンプルを準備します。

。 各サイトで
  1. 収集動物消費者単一チューブへの興味の種の個体を整理し、直接液体窒素やドライアイス腸クリアランスと DNA の分解を防ぐためにそれらを凍結します
    。 注意: いくつかの動物はアルコールは、それらを殺す前に繰り返す傾向があるのでアルコールでサンプルを保存しないでください
    2. 。
  2. のみ使用の中型および大きい胃腸地域 (約 > 3 mm) 昆虫種の遺伝的腸内容分析試料の残りの問題は、他のプロシージャ (例えば、 安定同位体の使用できるように分析)。ミズダニのような非常に小さな分類群を調査するときこれが該当するではないことに注意してください。したがって、1.2.1、1.2.2 の手順を省略できます。
    1. は、個人を少し解凍そして慎重にステンレス鉗子を用いた顕微鏡下での消化管を解剖します。問題の損失を避けるために胃腸を穴をあけることを確認してください
      2. 。
    2. クリーン鉗子除染液を使用して各消化管の準備の後、DNA および RNA の汚染を削除します。したがって、鉗子除染液で 10 分間を、インキュベートします。その後、残留のトレースを削除し、糸くずのペーパー タオルでふいて滅菌水でそれらをすすいでください
      3. 。
    3. 2.0 mL 安全ロック反応への転送切り裂かれた消化管チューブ含む 440 μ L (反復的なピペットの使用のための 450 μ L 可能) 塩抽出バッファー [SEB; 0.4 M 塩化ナトリウム (NaCl) 10 mM トリス (ヒドロキシメチル)-アミノメタン2 mM エチレンジアミン四酢酸塩と塩酸 (トリス-HCl) pH 8.0、脱水 (EDTA) pH 8.0]。店でサンプルを準備 − DNA の抽出まですぐに 20 ° C。数日間内 DNA が抽出されるということを確認します
      4. 。
  3. 高塩抽出プロトコル 25 を使用して DNA を抽出します。
    1. 冷凍庫からサンプルを取る。鉗子を使って各サンプル チューブに 1 つ 5 mm ステンレス鋼ビードを追加し、常温に解凍 (RT) ベンチに凍結試料を残します。ビーズミルを使って、15 hz 1 分間試料をホモジナイズしてください
      2. 。
    2. スピンの遠心分離機の短い実行のサンプル。1 マイクロリットル ピペットを使用して 90 μ L (反復的なピペットの使用可能な 100 μ L) 10% ナトリウム dodecyl 硫酸塩溶液 (SDS) および 5 追加 10 mg/mL, プロテイナーゼ K の μ L
    3. 渦は徹底的にサンプリングし、混合物、thermomixer で 400 rpm で一定の揺れで 60 ° C で 1 時間インキュベートします。さらに、徹底的に渦サンプル溶解を促進する 10 分
      4. 。
    4. スピンの遠心分離の短い実行のサンプル追加 350 μ L ピペット 1 マイクロリットルと徹底的に 40 分間約 0.5 - 1 分遠心分離機のサンプルの渦 5 M の NaCl の 16,200 x g で 5 ° C
      注: 行の複数のセットは、行われる必要がある、遠心分離機の温度設定必要 SDS は温度が低すぎる場合を凝集する傾向があるので (ない高い 10 ° C より) 発生するわずか
      5. 。
    5. 使用 1 マイクロリットル ピペット新しい 1.5 mL の反応管に約 600 μ L 上清を移す。ペレットから何も削除しないようにします
      6. 。 ステンレス鋼の茶漉しに反応管から
    6. チップ ステンレス ビーズ水を実行してそれらをきれいにし、10 分は徹底的に滅菌と除染液を洗い流すため除染液をシャーレにそれらをインキュベート水し、エタノールで洗浄されたビーズを保存 (> 99%、年率グレード) や再利用まで乾燥
      。 注: ビーズの洗浄、直接この手順で行われる必要はないではなく、次の手順で待機時間があるときに行うことが
      7. 。
    7. 、1 マイクロリットルと上澄みに冷たいイソプロパノール (年率グレード) の追加 600 μ L ピペットし、慎重に数回チューブを反転します。-20 で一晩試料保存 ° C
    8. 冷凍庫からサンプルと 16,200 × g、室温で 20 分間遠心します。慎重に上澄みを廃棄し、糸くずのティッシュ ペーパーで慎重にチューブを乾燥します。周囲の温度が (以上 25 の ° C) 高い場合遠心上清を廃棄しながら滑りペレットを避けるために 5 ° C でメモします
      9. 。
    9. 洗浄の 70% のエタノールを含む DNA をペレットします。これを行うには、冷たいエタノール (70%、年率グレード) の 200 μ L を追加 16,200 x g と部屋の温度 (または必要な場合、5 の ° C) で 10 分間のサンプル 1 マイクロリットル ピペットと遠心分離機を使用しています。慎重に上澄みを廃棄し、糸くずのティッシュ ペーパーで慎重にチューブを乾燥します。10 μ L ピペットの使用は慎重に残りの上澄みをピペットに約 8 μ L に調整されます。ペレットを邪魔をしないことを確認します
      10. 。
    10. すべてのエタノールを蒸発するまでベンチで常温、もしくは 60 ° C で約 5-20 分のペレットを乾燥します
      11. 。
    11. (蒸気滅菌と DEPC 処理) ヌクレアーゼ フリー 50-100 μ L に溶解ペレット水 (ddH 2 O)、少なくとも 1 (ただしより良い結果を得るに一晩で 4 ° C) h を待つ
      12. 。
    12. 、メーカーによると微量分光光度計、各サンプルに含まれる DNA 量を測定する ' の指示。約 2-10 ng DNA を含む各サンプルの作業希釈を行う/μ L。 冷凍庫に原液を維持します。冷蔵庫の中に実用的なソリューションを維持し、さらにサンプルを確保する処理はまもなく行われます
      13. 。

2。最近摂取した獲物の後続の検出用 DNA 抽出物の機能的な効率を確認します

。
  1. の存在とテンプレートの機能の効率をテスト各 DNA 抽出 (手順 1.1 に 1.3.11) ように 普遍的なプライマーを用いたそれぞれの食品のソースに適した設定 (例えば、 無脊椎動物 16 、 26) 獲物 25 , 27 の後続の検出に使用、グループ特定のプライマーとして同じ核サブユニットを対象とします。次の手順は、普遍的なプライマー セット NSF1419/20 や NSR1642/16 16 LSU の D1、D2 fw1 と LSU D1、D2 rev2 LSU D1、D2 rev4 26 の使用を参照してください。PCR の反作用は成功しているし、発生した汚染がないことを証明するために既に正常に増幅されていた DNA を含む肯定的な制御と ddH 2 O を実行各 PCR 内の DNA ではなくを含んでいる 1 つのコントロールのサンプルを使用します。
      にプライマー プライマーの最終濃度 10 μ M が含まれ、それぞれプライマー在庫ソリューション、ddH 2 O (原液の濃度) に応じて適切な量をピペット作業ソリューションを準備する
    1. 、1.5 mL の新鮮な反応管用マイクロ ピペットを使用しています
      2. 。
    2. は、この混合物、渦、Taq DNA ポリメラーゼと ddH 2 O (処理されるサンプルの数) に応じて 1.5 または 2.0 ml の反応管、反応バッファー deoxynucleotide ミックス (dNTPs) プライマーを追加します。10 μ L の PCR の反作用のための標準的な反応混合物の詳細なボリュームは 表 1 に与えられた (詳細使用する薬品の詳細は、材料の表 を参照).
      3. 番目の 9 μ L に抽出 DNA の各 1 μ L を転送する
    3. 使用 1 マイクロリットル ピペットe PCR チューブ (または PCR プレートの井戸) 内の標準的な反応混合物。反応管または (キャップ ストライプ) を有する板の反応の井戸を閉じます
      4. 。
    4. プログラム、たち: NSF1419/20、NSR1642/16 16 プライマー セットの標準的なプロトコルです: 4 分 (変性)、94 ° C に 30 94 ° C の 30 サイクル続けて s、50 ° の C (熱処理) 30 s、7290 s と 10 分のための 72 ° C で最終的な拡張の ° C。LSU のプライマー セット 26 次の使用: 4 分、94 ° C に続いて 94 ° C の 20 のためのサイクル 45 52.5 ° C、20 s s 72 ° C、90 s、および 72 ° c で 8 分間最後の拡張
    5. 場所 PCR チューブや、たちにプレート、サーマルサイクラーのふたを閉じ、それぞれのプログラムを起動します
      6. 。
    6. 準備 1.5% の agarose のゲル含有基本トリス緩衝液、ホウ酸と EDTA (TBE バッファー) agarose を使用しています。10 cm × 7.5 cm × 3 cm の全体的な寸法とゲル鋳造トレイを使用して 1.5% の agarose のゲルの準備のため三角フラスコに 0.45 g アガロースの重量を量る、30 mL の 1 x TBE バッファー (89 mM Tris をゲージにメスシリンダーを使用、pH 7.6, 89 mM ホウ酸、2 ミリメートルの EDTA、pH 8.0)、三角フラスコに注ぐ。電子レンジを使用して混合物を加熱します。大きい空気泡があるときに電子レンジを停止し、ソリューションがある 1 つだけの位相まで慎重にフラスコを旋回します
      7. 。 ソリューション約 60 ° C に冷却する
    7. は、水浴でフラスコを旋回します。迅速ゲル鋳造トレイに溶液を注ぐ、空気の泡を削除および櫛を挿入します。ジェルが固まるまでに約 20 分を待つ
      8. 。
    8. 塗り電気泳動ユニット 0.5 x TBE と挿入ゲル鋳造トレイは agarose のゲルを含んでいます。ゲル スロットが気泡の自由を確認します
      9. 。
    9. はミニ (プレート) の遠心分離機の短い実行オプションを使用して PCR の製品にスピンダウンします。ローディングの染料 (40% ショ糖と 0.25% ブロモフェノール ブルー) x 6 の 1 μ L の PCR の製品の各 3 μ L をミックスして agarose のゲルのゲルのスロットにロード 1 マイクロリットル ピペットを使用します。標準サイズとして各行の 1 つのスロットに 1 マイクロリットル ピペットで 100 bp の DNA の梯子の 1.5 μ L をピペットします。電気泳動ユニットの蓋を正しく取り付け、リードを電源装置に接続します。35 分の 100 V/cm でゲルを実行
      10. 染色浴を準備する
    10. 1 の 1,000 mL を注ぐ光不浸透性であり、正方形のプラスチック ボックスに x TBE。1 マイクロリットル ピペットと臭化エチジウムの 50 μ L を追加、プラスチックの箱のふたを閉じ、ethidium 臭化物の等しい配分を確保するためにそれを振る
      11. 。
    11. は、電気泳動装置からゲルを削除し、約 10 分間染色浴に入れます。その後、染色浴からゲルを取るゲルのドキュメンテーション システムの上にそれを置くし、マニュアルに従ってそれを視覚化する
      12. 。
    12. の存在と最近摂取した獲物の後続の検出のためのテンプレートの機能の効率の面で肯定的な結果 (十分なサイズの agarose のゲルの中で視覚のフラグメント) を示した唯一のサンプルを分析します
      13. 。
< td > 0.25 μ
PCR ミックス濃度作業ソリューション10 のミックスμ l の PCR 反応PCR の最終濃度
プライマー FW10 μ M0.5 μ l0.5 μ M
プライマー RW10 μ M0.5 ・ #956l0.5 μ M
反応バッファー (トリス-HCl、pH 8.55、16 mM (NH4) 2SO4 と 2 mM MgCl2 最終濃度 20 mM)1 μ M1 μ l1 μ M
dNTP10 mM0.25 mM
Taq のポリメラーゼ5 U0.1 μ0.05 U
ddH 2 06.65 μ l
< strong > 量反応混合物を合計9 μ l
DNA1 μ l

テーブル 1: 10 μ L の PCR 反応の標準的な反応混合物の準備のための詳しいプロトコル

。

3 です最近摂取した獲物/食品ゲルの電気泳動を使用してグループ特定のプライマー セットを検出。

。
  1. 行う PCR を使用して DNA の実用的なソリューションを抽出 (1.3.11 に 1.1 の手順に従って準備)、グループ特定のプライマー セット (ラベルが付いていない、すなわち、 変更なし) のような対象となる獲物のグループのために適切に記載されています。2.1.1 に 2.1.3 の手順 (それぞれプライマー セットの反応混合物の変化は、表 2 を参照してください)。2.1.4 のステップで与えられる標準的なプロトコルを使用して PCR を実行 (アニーリング温度それぞれプライマー セットのため、表 2 を参照).
    1. 実行各 PCR の消費者の種からそれぞれのターゲット グループ (肯定的な制御) と純粋な DNA を持つ 1 つの否定的なコントロールに属する試験片から純粋な DNA の 1 つのコントロールを使用します
      2. 。
  2. 2.1.6 に 2.1.11 の手順に記載されているアガロース電気泳動を用いた PCR 反応の成功を確認します。PCR の反作用は適切な長さの断片 (表 2 参照) が表示される場合は成功した肯定的な制御ではなく、負の制御。これらの条件の一方または両方が満たされて、PCR を繰り返します
    3. 。
  3. 使用アガロースゲル電気泳動、対象となる獲物のグループは (適切な長さの断片が見えるかどうかの判断) を介してテスト消費者が異なる標本によって消費されていたかどうかを検出する 2.1.6 に 2.1.11 の手順で説明するよう。低視覚解像度を持つフラグメントを欠場することを確認してください
    4. 。
  4. ストア PCR の製品または分析が後で実行する場合は-20 ° C で 4 ° c、さらに分析は、次の 24 時間以内に行われます場合
    5. 。

4。その後さらに下流ポリアクリルアミドゲルによる SSCP 解析を使用して消費の獲物を決定します

。
  1. SSCP の電気泳動のための 9% アクリルアミドゲルの準備します。研究所フード作業ソリューションを準備します。
      200 mL アクリルアミド作業ソリューションを準備、10 の 20 mL のメスシリンダーを入力
    1. x TBE (トリス基地の 109 g、55 g ホウ酸と 0.50 M の EDTA、pH 8.0 ddH 2 O の 1000 mL に溶解した 40 mL) と 45 mL 40% (29:1) のもう 1 つアクリルアミドのミックス。(ご利用いただけます 200 mL マーク卒業ガラス瓶はこちらも適切な) 卒業フラスコに TBE とアクリルアミドのミックスを注ぐし、ddH 2 O 200 mL マークまでを追加します。解決策は必要になるまで、冷蔵庫 (4 ° C) で働き続けます。1 週間以上古い作業ソリューションを使用しないでください
      2. 。
    2. は、ddH 2 O の卒業までを追加することによってそれを 10 %aps ストック溶液を調製するマーク 1 mL メスフラスコとディゾルブに過硫酸アンモニウム (APS; 使用少なくとも 0.01 g の精度でバランス) の 0.1 g の重量を量る。新鮮な反応管に因数 (約 350 μ L) を転送します
      。 注: 1 つの因数は各ポリアクリルアミドゲルに必要です。残りの aliqu を保存します。-20 ° C で ots のみ必要な直前因数を解凍と
      3. 。
    3. 組み立ての間にスペーサー (厚さ 1.5 mm) との 2 つのガラス板、1 つの空白と 1 つの切欠きを有するガラス板 (各 20 cm × 20 cm)、妥協したゲル カセットは、ガラスの側面を実行しています。ゲル カセット ( 図 1) をじっと見つめること、左右に各 3 つのフォールド バック クリップ (32 mm) を使用します
      4. 。 ゲルの agarose の 250 mL のソリューション 2% の agarose の準備する三角フラスコ 1 x TBE バッファーの
    4. ミックス 5 g。熱し、その後混合冷却 2.1.6 と 2.1.7 の手順で説明するよう。迅速に正方形のプラスチックの箱の溶液を注ぐ (21 cm × 6.5 cm × 5 cm) とアガロース溶液にゲル カセット (ステップ 4.1.3) の低い方の端を置きます。正方形のプラスチック製ボックス ( 図 1) の縁に座る高さにゲル カセットの下端にフォールド バック クリップを調整します。アガロース プラグが完全に固まるまでに約 20-30 分を待っています
      5. 。
    5. は、60 mL のマークまでアクリルアミド作業ソリューション (ステップ 4.1.1) メスシリンダー 100 mL を記入し、溶液をビーカーに注ぐ。マイクロ ピペットを使用して、APS 原液 (ステップ 4.1.2) の 1 つの因数の 300 μ L を追加し、その後テトラメチルエチレンジアミン (TEMED) の 37.5 μ L を追加します。迅速に、ゲルのカセットのガラス板との間の溶液を注ぐ。また、溶液を 100 mL のシリンジに注射器の噴射ヘッド調整 1,000 μ L ピペット チップとガラス板を注入します
      6. 。
    6. は、ガラス板の上部端に 1.5 mm 厚の標準的な櫛を注意深く挿入します。櫛は、ポリアクリルアミド ソリューションで囲む必要があります。ポリアクリルアミドゲルの重合まで約 1 時間を待ちます。ゲル重合に必要な時間が増えるので可能な限り重合中に換気を避ける
      。 注: それは 3 日に冷蔵庫の中にウェットティッシュで密閉されたビニール袋内でキャストのゲルを蓄えることです
      7. 。

figure-protocol-1
図 1: 画像を示す、ポリアクリルアミドゲルを注ぎを建設。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

。
  1. 配置準備、垂直電気泳動装置に電気泳動法を含むゲル カセット。塗りつぶし 0.5 x TBE とクール冷蔵サーキュレータを使用して 10 の ° c 単位の (電気泳動装置の種類) によって異なります適切な量の電気泳動の単位
    2. 。
  2. DNA の変性の予熱ブロック/-自転車乗り 96 ° c. 準備変性バッファーを 95% フォルムアミド (99.5 %p. a. グレード)、0.25% ブロモフェノール ブルーと 40% (w/v) ショ糖を含む 5% 水溶液
    3. 。
  3. は、冷蔵庫や冷凍庫からの PCR の製品を取り出して解凍します。ミニ (プレート) の遠心分離機の短い実行オプションを使用して PCR の製品をスピンダウンします。変性バッファーの 4 μ L で、PCR の製品のそれぞれ 4 μ L を混ぜます。10 分の氷水で冷却ステップの直後に続く 96 ° C で 5 分間混合物を熱
    注: サンプルに読み込むポリアクリルアミドゲル (ステップ 4.5) この直後にします
    4. 。
  4. は電気泳動法 (ステップ 4.1.6) から櫛を取り外してマイクロ ピペットを使用して、各サンプルをゲルのスロットに完全に読み込みます。分離するフラグメントのサイズ異なりますが常に必要な 10 ° c. を実行している時間に電気泳動装置を冷却ゲルあたり 8 W で電気泳動を実行します。フラグメント サイズ約 210 の bp、約 3.5 時間の走行時間は適当です
    5. 。 染色浴を準備する
  5. 1 x TBE 正方形のプラスチックに光不透過性ボックスし、染色染料 (単一鎖 DNA を染色に適しています) を 30 μ l 添加の 1,000 mL を注ぐ 1 マイクロリットル ピペットと。プラスチックの箱のふたを閉じ、染色色素の等しい配分を確保するためにそれを振る
    6. 。
  6. は電気泳動室からゲル カセットを取り外して慎重にゲルから切欠き材ガラス板を分離します。空のガラス板からポリアクリルアミド ゲルを染色浴にスライドさせます。一定の揺れで 20 から 30 分の振動プラットフォームと染色ゲルに染色浴を配置します
    7. 。
  7. 染色風呂から慎重にゲルを取るし、ドキュメンテーション システムの UV テーブルの上にそれを配置します
    。 注意: ゲルの不安定性により、2 人の前のステップを処理することをお勧めは。一人は UV テーブルの横にある染色浴を保持する必要がある、別の 1 つ必要があります両方の手でゲルの下に到達、それを取るし、UV テーブルの上にスライドします
    8. 。
  8. 蓋またはドキュメント システムのドアを閉じるし、メーカーによると写真を撮る ' s 取扱説明書.

5。複数最近摂取した自動化されたフラグメント解析を使用して並列に獲物グループを検出します

。
  1. 消化管内容 DNA 抽出 16 グループ特定のプライマーを使用して 分析設定染色色素の変更によるラベル セットの 1 つのプライマーで、表 2 に与えられた (表 2 列のタイトル変更を参照)、並列検出メソッドを使用して、自動シーケンサー。
    1. (1.3.11 に 1.1 の手順に従って準備) DNA の抽出物と行為の実用的なソリューションのような各プライマー用 Pcr に別の使用は、2.1.1 に 2.1.5 (混合物の変化は 表 2 で与えられる) の手順で説明します。実行各 PCR の消費者の種からそれぞれのターゲット グループ (肯定的な制御) と純粋な DNA を持つ 1 つの否定的なコントロールに属する試験片から純粋な DNA を持つ少なくとも 1 つのコントロールを使用します
      2. 。 2.1.4 の手順で与えられる標準 PCR のプロトコルを使用してたちで
    2. 実行 PCRs 調整 表 2 に与えられた集合各プライマーのそれぞれの焼鈍温度 (とサイクル数).
      注: 割り当てを使用、同じ DNA 反応井戸の各バッチの PCR の製品の後プールを簡素化する 16 の異なるプライマー セットと PCR フラグメント解析を自動化された
      3. 。 自動化されたフラグメント解析が完了した (表 2 参照) は、1 つのバッチに属するすべての PCRs まで-20 ° C で
    3. ストア PCR 製品。暗闇の中で PCR の製品を維持し、それをフラグメント解析前に 1 週間以上保管しないでください
      4. 。

figure-protocol-2
テーブル 2: 15 グループ特定のプライマーのペアの 2 つのバッチの詳細斎藤 ら によって確立されました。(2013) と新たに設計された Jae28S プライマーの水生動物の 16 のターゲット グループから 18 や 28 s rDNA 領域の増幅します。f、前方のプライマー。r、逆プライマー;18 歳未満、プライマーをターゲット 18 s rDNA サブユニット;28 秒、プライマーを対象 28 srDNA のサブユニット。"、Hydrobiologia、Dikerogammarus villosus (甲殻綱, Gammaridae)、' キラー エビ ' ライン川における?、768、2016 年表 S1 補足資料ページ 2、斎藤 Meike、バイエル バスティアン、ルネ ・ Gergs、(© スプリンガー国際公開スイス 2015) " スプリンガーの権限を持つ。 この表の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

。
  1. 16 プライマー セットの増幅されたフラグメントを検出する自動化されたフラグメント分析表 2 に与えられる 2 つのバッチで。内部サイズ標準を使用 (DNA サイズ スタンダード キット - 400 [バッチ B] と 600 [バッチ A]、それぞれ) フラグメントの長さを決定します。次の手順で説明するよう配列板と自動シーケンサーを準備します。材料表で与えられているよりも別のプラットフォームを使用した場合に調整する必要がありますこの手順メモ。
    1. 各バッチ サンプルを実行、サンプル読み込みソリューション (SLS) とそれぞれのサイズの標準を含んでいる混合物を準備します。SLS の 21.6 μ L と DNA サイズ スタンダード キット - バッチ A のサンプルと、それぞれ、SLS の 21.7 μ L と 0.3 μ L の DNA サイズ スタンダード キットあたり 600 - 0.4 μ L をピペットします。バッチ B のサンプルあたり 400
    2. は冷凍庫からそれぞれのバッチに属する 8 PCRs の PCR の製品を取り出して解凍します。彼らがまだ暗闇の中で保たれることを確認します
      3. 。
    3. は、5.2.1 の手順に記載されているそれぞれの混合物の各 22 μ L でシーケンス プレートは必要 (分析するのにサンプルの数) の井戸の数を読み込む 1 マイクロリットル ピペットを使用します。ミニ (プレート) の遠心分離機の短い実行オプションを使用して 8 の PCRs のそれぞれの PCR の製品をスピンダウンします。1 マイクロリットル ピペットとシーケンス プレートのそれぞれの井戸 8 pcr 法のそれぞれの PCR の製品につき各 1 μ L に転送します
      4. 。
    4. は慎重にスピンダウンするとミニ板遠心分離機の短い実行シーケンス プレート内でこの混合物、鉱物油一滴で使われていた井戸のそれぞれをオーバーレイします。250-300 μ L の DNA 分離バッファーとバッファー板のそれぞれの反応の井戸を埋める
      5. 。
    5. 製造業者に従ってサンプル セットアップを作成する毛細血管のシーケンサーのソフトウェアを使用して、' の指示。サンプル セットを制御し、データ (材料表 の標準サイズで使用するために十分な条件を実行するため の表 3 を参照) を処理するために使用するメソッドのシーケンスを決定する方法を割り当てます。サンプル セットアップ内のサンプル割り当て (含むの正と負のコントロールは、ステップ 5.1.1 を参照) シーケンサー プレートのサンプル割り当てと一致しているとフラグメントの適切なメソッドをそれぞれ分析が重要であることに注意してください。標準サイズを選択します
      6. 。
    6. は脱イオン水で濡れトレイを埋める、シーケンス プレート、バッファー ・ プレート、ぬれトレイをキャピラリーのシーケンサーに挿入します。サンプルの実行に必要な新鮮な DNA 分離ゲルの十分な量を含むゲル カートリッジを挿入します。準備されたサンプル セットアップを使用してシーケンス プレートを実行します
      7. 。
変性 別キャピラリー 注入
温度時間電圧時間電圧時間
サイズ標準 60090 ° C120 s4.8 kV60 分50 ° C の温度のため待機: はい2.0 kV30 s
サイズ標準 40090 ° C120 s6 kV45 分50 ° C の温度のため待機: はい2.0 kV30 s

表 3: 材料表で与えられたサイズの標準を使用して自動化されたシーケンサーにフラグメント解析のための特別条件

。
  1. 結果を分析する raw データをエクスポートし、フラグメント解析プログラムにそれらのデータをアップロードします。選択の標準的な染料染料カラー チャンネルを設定するのにはそれぞれのメーカーの色注文。
    1. 作成プログラムのマニュアルに従ってバッチ内単一グループ特定のプライマーによって増幅されたフラグメントの長さの予想範囲をアウトライン パネルを設定します
      2. 。 、データを処理する
    2. は、それぞれパネル、適切なサイズの標準、標準色、および解析のタイプを選択し、プロシージャを実行します。各染料の色の単一ライン トレースとしてキャピラリー電気泳動の器具から蛍光信号強度を表示するレーザービームを選択します。それぞれのフラグメント範囲を示すマーカー/プライマー セットが表示され、各と呼ばれるピークのセンターに関連付けられている検出されたフラグメントの正確な長さは、(着色または割り当てられた名前によってほとんどのプログラム) で強調表示されます自動的にします
      3. 。
    3. どのように密接に計算、各サンプルのサンプル ' s の内部サイズを標準サイズの呼び出しの成功を安心して選択したサイズ標準に一致します。ほとんどのフラグメント解析プログラムは、自動的に計算して、この試合を視覚化するオプションを持っています。サイズ呼び出しが失敗した場合はそれらのサンプルのフラグメント解析を繰り返します
      4. 。
    4. は、視覚的に各サンプルのレーザービームを再確認し、各マーカーとプライマーを別々 に設定と呼ばれる各ピークの確認/unconfirm。差し出がましいピーク マーカー/プライマー セットの条件を満たす、使用プログラムのユーザー マニュアルによると間違っているものを削除を手動で挿入します。塩基対のサイズまたは bin 名を適用、' 遺伝子ラベル '。計算や表示のピーク仕様、' ピーク テーブル ' です
      5. 。

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結果

正常に、このプロトコルの異なる研究内食事分析で説明されている手順を使用しました。このセクションでは、プロトコルのさまざまなセクションの適用を記述する例を示す.

例として、著者28と SSCP 解析による PCR 産物のさらに下流解析の可能性によって確立されたグループ特定のプライマー セットの有効性を示す、給餌実験が実施されました。Dikerogammarus villosusの捕食者と獲物としてCaenis属幼虫の個体はライン川、背水のカールスルーエ (ドイツ) の近くで捕獲されました。研究室では、捕食者と獲物のイチイは 20 ° C でフィルター処理された河川水で別々 に保管された、36 時間に飢えていた。実験のため端脚類標本は、フィルター選択されたストリーム水 (100 mL)、個別にうんざりして、30 分間 2 〜 3 Caenis幼虫と、液体窒...

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ディスカッション

ここでは、簡単かつコスト効率の高い PCR に基づく同じ標本の他の非分子分析と組み合わせることができます rDNA 領域のグループ固有プライマーを介してフィールド サンプルから捕食者-被食者相互作用の決定法を提案する.ただし、プロトコルの中でいくつかの重要な手順があります。まず、使用されるプライマーの特異性を保証することは不可欠です。第二に、それは胃腸管の準備、その後の DNA の抽出の間に汚染や腸のコンテンツの材料の損失を避けるために重要です。クロス サンプルの汚染は、獲物の DNA の誤検出につながることができます、腸の材料はほとんど行方不明につながる可能性がありますコンテンツの損失は餌種を消費しました。それぞれのサブユニットと解析 (プロトコルのセクション 2) 用のテンプレートの機能の効率に属する rDNA の存在の検証は、摂餌量に関する代表的な情報の収集に不可欠です。これは、特に消費者を餌になって捕食グループの DNA が検出された25,27できますない場合、非常に重要です。さらに、Pcr (ステップ 3.1、...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

研究所からシルクはクラッセンは、生態系の解析と評価 (ガイアウッド)、このプロトコルで使用されるグループ特定のプライマー セットの確立で彼女の援助のため RWTH Aachen を感謝いたします。我々 はまたミズダニの実験でピーター ・ マーティンと協力のキール大学からローラ Schynawa をありがとうございます。スムーズに実行し、企業とのカタログ番号の登録の準備のラボの維持の技術研究室助手を感謝いたします。この作品は、ドイツ研究振興協会 (DFG; プロジェクト GE 2219/3-1) によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
液体窒素NA大型無脊椎動物のフィールドサンプルを研究室に輸送するため。
1.5 ml反応チューブ - セーフロックAnyNA現場での消費者検体の採取とその後の液体窒素反応チューブの保存のために、必ずしもPCRクリーンである必要はありません。チューブの爆発を防ぐために、チューブの蓋に針で穴を開ける必要があります。
実体顕微鏡任意のNA倍率が関心のある消費者のサイズの胃腸管を準備するのに適していることを確認してください。
ペトリ皿任意のNAステレオマイクロスコープの下で消費者標本の胃腸管を解剖します。
ステンレス製フォーセップ:デュモン鉗子No.7バイオフォームB40dこの湾曲したステンレス製鉗子は、胃腸管に穴を開けることなく、湾曲した部分の間に固定された標本を保持するために非常にヘリフルな場合があります。
ステンレス製フォーセップ:デュモン鉗子 電子5号バイオフォームB40bこの微細なステンレス製鉗子は、消費者検体の胃腸管の調製に最適です。
DNA-ExitusPlusAppliChemA7409,1000RFDNAおよびRNA汚染除去のための除染ソリューション
ファズフリーペーパータオル任意のNA
ラボスケール任意のNA精度は少なくとも0.01gである必要があります。
マイクロリットルピペット(0.5-10 / 10-100 / 50-200 / 100-1000 μL)AnyNA
Safe-Lock Tubes 2.0 mlVWR211-2165これらの反応チューブには、DNA、DNase、RNase、PCR阻害剤が含まれていないことが重要です(PCRクリーン)!
セーフロックチューブ 1.5mlVWR211-2164これらの反応チューブには、DNA、DNase、RNase、PCR阻害剤が含まれていないことが重要です(PCRクリーン)!
塩化ナトリウム ≥99.5%, p.a., ACS, ISOcarlroth3957.3DNAの抽出に必要な塩抽出バッファー(SEB)および5M NaCl溶液用。
トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン トリス・カールロス4855.2塩抽出緩衝液(SEB)およびTBE緩衝液
マイクロリットルピペット(0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL)carlroth8043.1塩抽出バッファー (SEB) および TBE バッファー
用 ホウ酸 ≥99.8 %、p.a.、ACS、ISOcarlroth6943.2TBEバッファ用。市販のTBEバッファーが得られた場合は不要です。
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)carlroth4360.1
プロテイナーゼKlyophilの抽出用。carlroth7528.110 mg / mlを含む作業溶液を準備します。
TissueLyser IIQuiagen85300サンプルの均質化のためのビーズミル。
ステンレス鋼ビーズ、5 mmQuiagen69989サンプルの均質化用。
加熱サーモシェーカー任意のNA
ボルテックスミキサー任意のNA
冷蔵遠心分離機:himac CT 15 RE日立NADNAの抽出中の遠心分離に使用される冷蔵遠心分離機(プロトコル1)。
イソプロパノールカールロス6752.5
エタノール99.8%、p.a.NA
水 分子生物学グレード (ddH2O)AppliChemA7398,1000ヌクレアーゼフリー (ストリーム滅菌およびDEPC処理済み) DNAの再懸濁に使用され、原稿内でddH2Oを参照する場合は常に、
未修飾オレゴヌクレオチド、ユーロフィン、MWG、オペロンNAプライマー、非標識
、修飾オレゴヌクレオチドMetabion International AGNAプライマー ラベル付き
peqGOLD Taq オールインクルーシブVWR Peqlab01-1000Taq オールインクルーシブ PCR 反応混合物 (反応バッファー Y および S、dNTP および MgCl2)
Primus 96 アドバンスドグラジエントサーモサイクラーまたは peqStar96x ユニバーサルグラジエントPeqlabNAプライマーセットは、もともとPrimus 96アドバンスドグラジエントサーモサイクラーで確立されました。このサイクラーはかなり古いものだったので、peqSta96x(古いモデルをシミュレートすることも可能)を使用して、同じ条件下でプライマーセットが効率的で特異的であるかどうかを確認しました。しかし、テストでは、古いマシンのシミュレーションを使用せずに、プライマーが良好に機能し、依然として特異的であることが示されました(Koester et al.2013を参照)。
標準96ウェルPCRプレートVWR Peqlab732-2879PCR反応に使用されます。
ロープロファイルチューブストライプ 0.15ml フラットキャップストライプ付きVWR Peqlab732-3223PCRプレートを閉じるために使用されるキャップストライプ。
アガロースPeqlab35-1020ゲル電気泳動に使用されます。
マイクロ波任意のNA
コニカルフラスコ任意のNA
測定シリンダー任意のNA
水平電気泳動ユニットと歯付きそれぞれのコーム任意のNAアガロースゲル電気泳動用。
電気泳動電源 PS3002Life TechnologiesNA
Ethidium bromide solution 1 %carlroth2218.1アガロースゲルの染色浴の調製に使用されます。
ホルムアミドカールロス6749.1SSCP分析用の変性バッファーに必要です。
ブロムフェノールブルーAppliChemA3640.0010アガロースゲル電気泳動用のローディング色素に必要です。
ショ糖カールロス4621.1アガロースゲル電気泳動用のローディング色素に必要です。
100 bp-DNA-Ladder extendedcarlrothT835.1アガロースゲル電気泳動のサイズ標準として。
UVドキュメンテーションシステムAnyNAゲル電気泳動の結果を可視化します。
ロチフォア NF-アクリルアミド/ビス溶液 40 % (29:1)carlrothA121.1ポリアクリルアミドゲルの調製用。
ペルオキシ二硫酸アンモcarlroth9592.2ポリアクリルアミドゲルの調製用。
フォールドバッククリップ(32mm)任意のNAポリアクリルアミドゲルの調製用。
正方形のプラスチックボックス(21 × 6.5 × 5 cm)任意のNAポリアクリルアミドゲルの調製用。
テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)carlroth23.67.1アクリルアミドゲルの調製用。
ビーカーAnyNA
RC 10 デジタルチラーVWR462-0138ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用したSSCP分析用。
縦型電気泳動ユニット P10DS (OWL Separation Systems)VWR700-2361ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたSSCP分析用。
ノッチ付きガラスプレートVWR730-0261ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたSSCP分析用。
ブランクガラスプレートVWR730-0260ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたSSCP分析用。
スペーサーVWR730-0262ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたSSCP分析用。
25歯のコームVWR730-0294ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたSSCP分析用。
振とうプラットフォームAnyNA染色浴の絶え間ない振とうに。
GelStar核酸染色剤(ロンザ・ロックランド社)Biozym850535 (50535)ポリアクリルアミドゲルの染色用。
GenomeLab DNAサイズ スタンダードキット 400bpAB Sciex608098自動フラグメント解析用。バッチBのサイズ標準。
GenomeLab DNAサイズ スタンダードキット 600bpAB Sciex608095自動フラグメント解析用。バッチAのサイズ標準。
サンプルローディングソリューション(SLS)AB Sciex608082自動フラグメント分析用。
シークエンツィングプレート - 96ウェルポリプロピレンPCRマイクロプレートCostar6551自動フラグメント分析用。
プレート式遠心分離機、PerfectSpin PVWR PeqlabNAミニプレート遠心分離機で、PCR産物のスピンダウンに使用されます。
バッファープレート - 96ウェル EIA/RIA 透明 平底ポリスチレン未処理 マイクロプレートコーニング9017自動フラグメント分析用。
GenomeLab Seperation bufferAB Sciex608012自動フラグメント解析用。
分離ゲル - LPAIAB Sciex608010自動フラグメント分析用。
Sequenzer - CEQ8000 Genetic Analysis Systemベックマン・コールターNA自動フラグメント解析用。
GeneMarker V1.95SoftgeneticsNA自動フラグメント解析結果を解析します。
DNAニウム ポリ

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