方法論記事

受動的な明快さクリア マウス卵巣の血管の 3次元再構築

DOI：

10.3791/56141

⸱

2017年12月10日

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Medicine and Neurobiology, School of Basic Medical Sciences; Institutes of Brain Science, Brain Science Collaborative Innovation Center, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Institute of Acupuncture and Moxibustion, Fudan Institutes of Integrative Medicine, Fudan University, 2Program of Reproductive and Stem Cell Biology, Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University School of Medicine, Stanford University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでそのままマウス卵巣における受動的な明快さと卵巣の血管と濾胞性毛細血管の可視化における 3 D 画像再構成法の適応を提案する.

要約

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卵巣は、女性の生殖器系の主要な器官と雌性の配偶子の生産構造の複雑な関係との三次元 (3 D) 血管アーキテクチャが、内分泌系を制御するために不可欠です、卵巣は記述されていません。3 D の接続とそのまま卵巣の血管の構造を視覚化するために最初の重要なステップは、光学的に透明の卵巣をすることです。ヒドロゲルを用いて組織の収縮を避けるためには、受動的な明快さの固定ベース (アクリルアミド ハイブリダイズ リジッドのオフ脂質交換イメージング/染色/の場-交配-互換性のある組織ハイドロゲル) プロトコルをそのまま卵巣をクリアする方法.染色、高度な多光子の共焦点顕微鏡と 3 D 画像再構成それから卵巣の血管と濾胞性毛細血管の可視化のために使用されました。このアプローチを使用すると、有意な正の相関を示した (P < 0.01) 卵胞の毛細血管と卵胞壁量の長さの間。

概要

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卵胞が卵巣の構造と機能の基本単位とその開発は、卵巣内にある血管に関連性の高い。血管は栄養と卵胞ホルモンと成長と1卵胞の成熟に重要な役割を担っています。

選択的血管マーカー、トランスジェニック マウス モデル、医薬品開発などの技術の組み合わせは、卵巣の血管網、血管新生、血管の機能に関する知識を増加しています。卵胞形成。卵巣は、卵胞発育と排卵の間に様々 な組織や血管のネットワークを改造するためにアクティブな器官と呼ばれます。サイズと血管の構造のようなアクティブな改造開発、採用に卵胞の生物学的機能に必要です。

卵巣のセクションおよび血管の反応を使用して従来の組織学的および組織計量方法は二次元 (2 D) 画像2に限定されます。三次元 (3 D) 再構成技術の発展に伴い、組織スライスの 2 D 画像を 3 D 構造に重ねることができますが、この方法はまだいくつかの制限を持って-微細構造の一部を破壊することが組織の区分、組織は、不足していると多くの労働力がスライスから得られた画像からの 3次元再構成の製作にかかわっています。全体組織 3 D 共焦点顕微鏡イメージングは、これらの制限の多数を克服できるがこれらのメソッドは萌芽期卵巣3における血管新生の評価に限定。生後および成体卵巣におけるこれ....

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プロトコル

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動物を対象とするすべてのプロシージャ上海医科大学、復旦大学 (承認番号 20160225-013) の動物倫理委員会のガイドラインに従った。

1. 透明なマウス卵巣の準備

  1. 溶液の調製
    1. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ソリューション (1 M、pH 7.6) 0.1% 準備トリトン X-100 (pbst;)。10 x PBS 原液 1 リットルを作るためには、87 g の塩化ナトリウム、NaH2PO4 · 3.1 g を混ぜる2 H2O、および Na2HPO4 ·12H2O. 28.7 g dH2O に 1 L 攪拌 ~ 2 h. 調整 pH 7.4 に 1 N naoh を追加し、常温で保存します。1/10 この 10 倍原液を希釈 dH2O を使用し、0.1% トリトン X-100 PBS で。
    2. 混合 (wt/巻) 4% パラホルムアルデヒド (PFA) ソリューション、4% (重量/巻) アクリルアミド、0.05% (重量/巻) bisacrylamide、ダブル蒸留水氷の上の 0.25% (重量/巻) VA 044 イニシエーターによるゲル溶液 (pH 7.5) を準備します。

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結果

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我々 は受動的な卵巣の卵胞期と血管のアーキテクチャを維持すると、容器と包のラベル付きのマーカーからの最高の蛍光信号の取得をオフに迅速かつ簡単な方法にパッシブのクラリティ法を適応しました。卵胞血管の 3 D アーキテクチャは、CD31、内皮細胞6マーカーの免疫染色により決定されました。CD31 染色成体マウスの卵巣では卵胞の毛細血管とプライマリとセカンダリの卵胞 (図 1) との間の相互関係を示し, フィラメントのアルゴリズムを使用してトレースされました。

スポット変換と表面のアルゴリズムは、チロシン水酸化酵素 immunostained 卵母細胞と顆粒膜層を検出し、包7,8の総体積を計算する使用されました。卵胞の圧縮のためトリミン.......

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ディスカッション

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現在の研究では、毛細血管と個々 の発育卵胞の間の関係を評価するイメージング 3 D を提案する.筆者らは同じプロトコル9を使用して、大血管、毛包とそのままマウス卵巣内の卵胞の場所間の相互作用の役割を検討しました。パッシブわかりやすくアプローチでは、マイクロおよびマクロ生、卵胞形成、および黄体と卵胞だけでなくさまざまな発達段階で卵巣の建築を再建するための間の相互関係を検討することができました。

そのまま組織の 3次元画像データを取得するには、清算プロセスは、最初の重要なステップです。主な戦略は 2 つあります-脱水方法と受動的な明快さ10など、親水性試薬ベースのメソッド。脱水方法が頻繁に蛍光シグナルの低下につながる、しばしば有害有機廃液を作り出す、ので私達の注意に注力様々 な組織型の受動的な明快さ使用法のいくつかの手順を簡素化します。

清算プロセスの最初の重要な手順は、transcardial 血流です。灌、心臓の鼓動は、背景の蛍光性.......

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

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本研究は、ポスドクの中国特別基金からの助成金によって支えられた (YF に号 2014T70392)、中国の国家自然科学基金 (YF に号 81673766)、新しい教師プライミング基金、復旦大学、Zuoxue 財団、開発上海ピーク分野統合医学 (20150407) のプロジェクト。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アクリルアミドベテックv900845http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845
アレクサフラワー488(希釈1:50) ライフテクノロジーA11039https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039
アレクサフラワー 594 (希釈率 1:50)ライフテクノロジーA11012https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
ビサアクリルアミドアムレスコ172http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx
黒壁ガラス底皿 (Willco-Dish)テッド ペラ14032http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall
ホウ酸Sinopharm 化学試薬10004818http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818
リン酸二ナトリウム 12 水和物 (Na2HPO4 12H2O)Sinopharm 化学試薬10020318http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318
FocusClearCelexplorerFC-102http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1
ParafilmBemisPM996http://www.parafilm.com/products
ParaformaldehydeSinopharm Chemical試薬80096618
http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10)Abcamab28364http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html
PhotoInitiator VA044Wakova-044/225-02111http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
Na-DideSigmaS2002http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US
塩化ナトリウム(NaCl)シノファーム化学試薬10019318http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318
リン酸二水素ナトリウム二水和物(NaH2PO4 2H2O)Sinopharm化学試薬20040718http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718
デシル硫酸ナトリウムSinopharm化学試薬30166428http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428
水酸化ナトリウム(NaOH)Sinopharm化学試薬10019718http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718
Triton X-100Sinopharm化学試薬30188928http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928
チロシンヒドロキシラーゼ (TH, 希釈率 1:50)Abcamab76442http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html
ズ ズ ド

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown, H. M., Russell, D. L. Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease. Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).
  2. McFee, R. M., et al.

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3D CD31

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