ヒトに誘導された多能性幹（hiPS）細胞の強力な誘導は、真皮線維芽細胞の非組込みセンダイウイルス（SeV）ベクター媒介性再プログラミングを使用することによって達成された。 hiPS細胞の維持およびクローン増殖は、組換えヒトラミニン521（LN-521）マトリックスおよびEssential E8（E8）培地を用いた異種非含有および化学的に規定された培養条件を用いて行った。
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この記事について
サマリー
要約
Xeno-freeおよび完全に定義された条件は、均一なヒト誘導多能性幹（hiPS）細胞の堅牢で再現性のある世代のための重要なパラメータである。フィーダー細胞または未定義マトリックス上のhiPS細胞の維持は、バッチの変動、病原性の汚染および免疫原性のリスクに影響されやすい。定義された組換えヒトラミニン521（LN-521）マトリックスを異種非含有培地および規定培地と組み合わせて使用することにより、変動性が減少し、hiPS細胞の一貫した生成が可能になる。センダイウイルス（SeV）ベクターは、非組み込み型RNAベースのシステムであるため、組み込みベクターが有するゲノムの完全性に対する潜在的な破壊的効果に関連する懸念を回避することができる。さらに、これらのベクターは真皮線維芽細胞の再プログラミングにおいて比較的高い効率を示した。さらに、細胞の酵素的な単細胞継代は、実質的に以前の経験のないhiPS細胞の均質な維持を容易にする培養する。ここでは、再現性と使いやすさに重点を置いて広範囲に試験および開発され、線維芽細胞から定義された異種非含有ヒトhiPS細胞を生成するための堅牢で実用的な方法を提供するプロトコールについて説明します。
概要
Takahashi らによるhiPS細胞株の最初の誘導以来、 1、2 、hiPS細胞は、疾患モデル化、創薬、および再生医療における細胞療法を生成するための原材料として有用なツールを提供している3 。 hiPS細胞培養は、線維芽細胞フィーダー細胞4,5またはマトリゲル6および胎児ウシ血清（FBS）を含有する培地製剤との共培養に長く依存してきた。バッチ間の変動は、これらの培養条件の未定義の性質の共通の結果であり、予測不可能な変動をもたらし、これらのプロトコルの信頼性に大きく寄与する7 。 Essential 8（E8） 8および定義された細胞培養マトリックス、例えばLN-521 9のような規定された培地の開発は、高度に再現可能なプロトコールの確立および均質なhiPS細胞の堅牢な生成および維持を助けるためのものである7,8,9,10。
統合型の再プログラミング技術の開発は飛躍的な進歩を遂げています。もともと、再プログラミングは、ゲノムの完全性に破壊的な影響を与えてゲノムにランダムに組み込まれたレトロウイルスベクターに依存していました....
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プロトコル
患者物質の収集およびhiPS細胞の誘導は、2012年3月28日のストックホルム倫理審査委員会の登録番号：2012 / 208-31 / 3によって承認されています。細胞培養ステップは、特に明記しない限り、バイオセーフティキャビネットで行う必要があります。細胞を扱うときは、常に無菌操作技術を実践してください。開始前に培地、プレートおよび試薬を室温に戻す。高湿度下、37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートする。
1.皮膚生検からのヒト線維芽細胞の単離
- 培養液の調製、消化酵素、皿のコーティング、切開器具。
- 線維芽細胞培地：イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）44.5mL、胎児ウシ血清（FBS）5mL、ペニシリン/ストレプトマイシン（PEST）500μL（ 表1参照）を4℃で保存する。
- 1mg / mLの作用濃度で消化酵素を調製する：wei4mlのディスパーゼおよびコラーゲナーゼI型パウダーのアリコートを別の15mLチューブに入れ、4mLのDMEM / F12 + 1％PESTに溶解する。酵素溶液を0.22μmのストレーナーに通すことによって酵素溶液を滅菌する。毎回新鮮な酵素溶液を調製する。
- リン酸緩衝化生理食塩水（DPBS）中の0.1％ゼラチン1mLで切開した生検当たり6ウェル組織培養プレート（または35mm組織培....
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結果
生検からhiPS細胞まで
生検から確立されたhiPS細胞までの全過程は、再プログラミングベクターがなく、特性決定の準備ができてから約16週間かかる（ 図1 ）。より詳細なタイムラインが図2Aに示されている 。線維芽細胞の培養を確立して拡張するためには、約4週間が必要である。最初のhiPS細胞コロニーは、センダイベクター導入の約3週間後に出現し始めた。最初の継代のためにコロニーを機械的に採取し、次いで単一細胞として酵素的に継代した。
ヒト線維芽細胞培養の確立
ヒト線維芽細胞培養物がコンフルエントまで増殖し、受け入.......
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ディスカッション
このプロトコールの予想される結果は、いくつかのクローン的に誘導されたhiPS細胞株の生成が成功したことである。重要なことに、ここに記載された確立されたhiPS細胞の維持および増殖のための方法は信頼性があり、幹細胞培養の経験がほとんどない状態で実施することができる。 ROCKiとLN-521マトリックスとの酵素的単一細胞継代は、細胞を核型正常、多能性および容易に分化させることができ、コロニーに基づく継代が10,19,20を刺激することができる誘導された異種性を避けることが知られている。 ROCKi 10を添加しなくても、LN-521上で培養されたhiPS細胞は単一細胞として継代することができるが、ROCKiを添加すると、経験の少ないハンドラーにとってプロトコールが容易になり、hiPS細胞誘導に要する時間が短縮される。
再プログラミング効率はGEですこのプロトコルの問題ではありません。 SeVベクターは、線維芽細胞11に対して> 1％の比較的高い再プログラミング効率を有する。豊富なコロ.......
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開示事項
著者は報告する利益相反はない。
謝辞
この作業は、SSF（B13-0074）とVINNOVA（2016-04134）の資金提供機関によってサポートされました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Dispase | Life Technologies | 171105-041 | 生検消化 |
| コラゲナーゼ | シグマ | C0130 | 生検消化 |
| ゼラチン | シグマ | G1393 | 線維芽細胞マトリックス |
| IMDM | Life Technologies | 21980002-032 | 線維芽細胞培地 |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | 線維芽細胞培地 |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | Life Technologies | 15070-063 | Antibiotic |
| Essential 8 培地 | ThermFisher Scientific | A1517001 | iPS細胞培養培地 |
| LN-521 | Biolamina | LN521-03 | iPS細胞培養マトリックス |
| TrypLE select 1X | ThermoFisher Scientific | 12563011 | Dissociation reagent |
| Rho-kinase inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | Rho-kinase inhibitor (ROCKi) |
| CytoTune – iPS 2.0 リプログラミングキット | Life Technologies | A1377801 | 仙台ウイルス リプログラミングベクター |
| 35 mm 組織培養皿 | Sarstedt | 83.3900.300 | 細胞培養 |
| 60 mm 組織培養皿 | Sarstedt | 83.3901.300 | 細胞培養 |
| 24 ウェル組織培養プレート | Sarstedt | 83.3922.300 | 細胞培養 |
| T25 組織培養フラスコ | VWR | 734-2311 | 細胞培養 |
| 15 mL チューブ | Corning | 430791 | 遠心分離チューブ |
| 1.5 mL チューブ | Eppendorf | 0030123.301 | 1.5 mL チューブ |
| CoolCell cell LX | Biocision | BCS-405 | 凍結容器 |
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | 線維芽細胞凍結 |
| クライオバイアル 1.8 mL | VWR | 479-6847 | クライオバイアル |
| PSC 凍結保存キット | Gibco | A2644601 | PSC クライオmediumRevitaCellサプリメント |
| トリプシン-EDTA (0.05%) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 25300054 | 線維芽細胞解離酵素 |
| DMEM/F12 | ライフテクノロジー | 31331-028 | 消化酵素希釈剤 |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | PBS |
| HBSS | ThermoFIsher Scientific | 14025-050 | 生検調製 |
| 血球計算盤 | Sigma | BRAND, 718920 | 細胞計数パラ |
| フィルム | VWR | 291-1213 | 保管用シーリングプレート |
参考文献
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced p....
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再版と許可
