方法論記事

自己組織化ペプチドとアミノ酸の組み合わせを用いる水溶液中の疎水性化合物の溶解度

DOI：

10.3791/56158

⸱

2017年9月20日

 ,  , 
1Latner Thoracic Surgery Research Laboratories, University Health Network, 2Department of Pediatrics, British Columbia Children's Hospital & University of British Columbia, 3Institute of Medical Science, University of Toronto

この記事について

サマリー

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このプロトコルでは、自己組織化ペプチドとアミノ酸のソリューションの組み合わせを使用して水溶液中における疎水性化合物の溶解の臨床応用可能な手段について説明します。私たちのメソッドは、臨床試験への溶解度と配信方法の安全で効率的な手段を欠いている疎水性治療の主要な制限を解決します。

要約

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自己組織化ペプチド (Sap) は、臨床応用; 疎水性治療薬の配達のための有望な車自分の両親媒性プロパティは、それらが人間の体の水環境における疎水性化合物を溶解すること。しかし、自己組織化のペプチッド解決はある貧しい血液適合性 (例えば、低い浸透圧)、静脈内投与による臨床応用を妨げます。我々 は最近アミノ酸ソリューション (SAP AA) 薬物の溶解度を強化し臨床用途の要件に到達する製剤の浸透圧を高めると Sap を組み合わせた疎水性薬物送達のための一般化されたプラットフォームを開発しました。この定式化戦略は構造的に異なる 3 つの疎水性有機化合物-PP2、rottlerin、そしてクルクミン-その多様性を示すためのコンテキストで徹底的に調べた。さらに、エタノールと 2 つの異なる共同溶剤ジメチルスルホキシド (DMSO) 低および高濃度 20 自然既存アミノ酸 6 異なる Sap を分析することによって定式化コンポーネントを変更するの効果を調べた。ある疎水性薬剤と PP2、定式化阻害剤の治療的機能用のコンポーネントを最適化するに有効であることを証明した当社の戦略は、 in vitroとin vivoの両方を観察されました。本稿では、疎水性化合物の溶解度より機能的な研究でこれらの製剤の潜在的な使用への第一歩としての解析 SAP AA の組み合わせを使用して私たちの一般的な定式化法について説明します。我々 は疎水性の化合物は、クルクミンの定式化の代表的な溶解度結果を含めるし、我々 の方法論が将来の生物学的研究と疾患モデルのためのプラットホームとして役立つ方法を話し合います。

概要

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Sap は、生体材料再生医療1,2,3,43 D 足場として広く研究されているクラスです。もっと最近しかし、彼ら悪用されている彼らのユニークな生物学的特性の5,の6,7,の8のための治療薬の配達のための車として。Sap は、当然安定したナノ構造9、従って薬剤のカプセル化と保護の手段を提供するのにまとめます。Sap が両親媒性、疎水性と親水性アミノ酸の繰り返し、運転の特定のパターンから成るその自己集合9,10疎水性と親水性を媒体として提供することを許可します。環境。したがって、-疎水性薬物の臨床の配信がある非常に低いバイオアベイラビリティと体内吸収率水溶液環境11,

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プロトコル

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1 アミノ酸溶液の調製

  1. 準備とラベル 2 つ 50 mL コニカル遠沈管各アミノ酸のため (両方の 1 つずつ " 低 " と " 高 " 濃度)。
    2. 。
  2. 精製水 (25 ° C で 18.2 MΩ·cm) を含む大きな 2 L フラスコを準備します
    3. 。
  3. 目的の濃度に到達する (グラム) の各アミノ酸の量を計算し、へらを使用して、それぞれ 50 mL 遠心チューブにアミノ酸の適切な量の重量を量ます
    。 : 注 " 高 " 2 つの濃度の荷電アミノ酸、PBS が水の代わりに使用されます。低水溶性と水に役立ちますではなく低 pH を維持するために PBS を使用するため濃度を増やすことはできません。さらに、濃度の計算は、各アミノ酸溶液の 40 mL の最終巻を使用して得られました。すべてのアミノ酸濃度は 表 3 のとおりです。汚染を避けるためにアミノ酸の間にヘラをすすぐこと。70% のエタノールで拭くことによって続いて水リンスをお勧めします
    4. 。
  4. 血清ピペットを使用して各 50 mL チューブに精製水 (または PBS) の追加 40 mL。キャップ管と渦または溶解するまで積極的に振る。水お風呂超音波 (室温、130 W、40 kHz) は、溶解プロセスを支援するも使用できます
    。 注: 次のアミノ酸ソリューションは、光に敏感とアルミ箔で覆われるべきである: ....

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結果

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疎水性薬剤、クルクミン、当然のことながら既存の証拠の原則として 1 つだけ SAP、EAK16 II との組み合わせで、低濃度のアミノ酸すべて 20 製剤をプロデュースしました。また、共溶媒として DMSO およびエタノールを使用して製剤をテストしました。合計では、これは 40 のクルクミン製剤をそれぞれ異なるコンポーネントを含む生産。SAP (計 6 個) のアミノ酸濃度その他の施設を含めました PP2、Src 阻害剤を使用して私たちの以前の研究を注意することが重要だ (臨床、高濃度だけでなく、)、480 の異なる製剤の合計を生産します。この研究のための SAP として EAK16 II を選択するときこの作品から動向は考慮しました。様々 な成分の濃度は、参考表 1表 2、および表 3に含まれます。すべて疎水性医薬品の製剤は、可視化により薬物の溶解度の上映され、遠心分離 (図 1) 後にソリューションが完全に任.......

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ディスカッション

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定式化の手順でさまざまな重要な手順とトラブルシューティングの考慮すべき点があります。最初に、我々 はさまざまなコンポーネントと濃度が機能して、プロトコル全体で複数の渦ステップように全ての濃度が均一で正しいこと。高濃度、疎水性アミノ酸の解決策のいくつかがまだない完全に解散するボルテックス後、し、この場合、彼らすることができます動揺する精力的に手作業のプロセスを支援します。同様に、それは重要な SAP AA ソリューションは Sap は自然に傾向があるので手順 2.4 に示した超音波処理ステップを受けること SAP クラスターより均一な溶液で結果が断片化に骨材および超音波処理が役立ちます。第二に、指定された疎水性医薬品の在庫および SAP AA 製剤内最終濃度決まるべきである生物学的設定でその化合物の効果的な濃度。プロトコルは、このアクティブな濃度を反映するように適宜変更されます必要があります。さらに、薬剤積載量も考慮します。 重要な因子であります。そう、それぞれの薬のこの戦略を使用してユニークな積載能力を持ち、互換性に基づいて各 SAP AA の組み合わせが異なる薬物量をサポート可能性がありますです。これは、特定の化合物の最適な SAP .......

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

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この仕事は、健康の研究のカナダの協会によってサポートされて、モップ 42546 とモップ 119514 を与えます営業します。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
EAK16-ICanPeptide株式会社カスタムペプチド配列:AEAKAEAKAEAKAEAK、N末端アセチル化およびC末端アミド化、HPLC
EAK16-IICanPeptide Inc.カスタムペプチド配列:AEAEAKAKAEAEAKAK、N末端アセチル化およびC末端アミド化、HPLC
EAK16-IVCanPeptide Inc.カスタムペプチド配列:AEAEAEAEAKAKAKAK、N末端アセチル化およびC末端アミド化、HPLC
EFK8-IICanPeptide Inc.カスタムペプチド配列:FEFEFKFK、N末端アセチル化およびC末端アミド化、HPLC
A6KECanPeptide Inc.カスタムペプチド配列:AAAAAAKE、N末端アセチル化およびC末端アミド化、HPLC
P6KECanPeptide Inc.カスタムペプチド配列:PPPPPPPKE、N末端アセチル化およびC末端アミド化、HPLCによる純度>95%
ニンSigma-AldrichA7469-100GL-アラニン
イソロイシンSigma-AldrichI7403-100GL-イソロイシン
ロイシンSigma-AldrichL8912-100GL-ロイシン
メチオニンSigma-AldrichM5308-100GL-メチオニン
プロリンSigma-AldrichP5607-100GL-プロリン
バリンSigma-AldrichV0513-100GL-バリン
フェニルアラニンSigma-AldrichP5482-100GL-フェニルアラニン
トリプトファンSigma-AldrichT8941-100GL-トリプトファン
チロシンSigma-AldrichT8566-100GL-チロシン
グリシンSigma-AldrichG8790-100GL-グリシン
アスパラギンSigma-AldrichA4159-100GL-アスパラギン
グルタミンSigma-AldrichG8540-100GL-グルタミン
SerineSigma-AldrichA7219-100GL-セリン
スレオニンΣ-AldrichT8441-100GL-スレオニン
ヒスチジンSigma-AldrichH6034-100GL-ヒスチジン
リジンSigma-AldrichL5501-100GL-リジン
アルギニンSigma-AldrichA8094-100GL-アルギニン
アスパラギン酸Sigma-AldrichA7219-100GL-アスパラギン酸
グルタミン酸Sigma-AldrichG8415-100GL-グルタミン酸
システインシグマ-アルドリッチC7352-100GL-システイン
ジメチルスルホキシシグマ-アルドリッチD4540-500MLDMSO
エタノールシグマ-アルドリッチ277649-100ML無水
クルクミンシグマ-アルドリッチ08511-10MG疎水性薬、クルクミン
ロトレリンEMDミリポア557370-10MG疎水性薬、ロトレリン
PP2エンツォ BML-EI297-0001疎水性薬物、PP2
シンチレーションバイアルVWR2650-66022-081ホウケイ酸ガラス、スクリューキャップ付き、20mL。ペプチドを秤量するためのバイアル。
Falcon 50 mL 円錐形遠心分離チューブVWR352070ポリプロピレン、滅菌済み、50 mL。アミノ酸溶液用。
による純度>95%による純度>95%による純度>95%による純度>95%による純度>95% アラド

参考文献

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  1. Holmes, T. C., de Lacalle, S., Su, X., Liu, G., Rich, A., Zhang, S. Extensive neurite outgrowth and active synapse formation on self-assembling peptide scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6728-6733 (2000).
  2. Davis, M. E., Motion, J. P. M., et al.

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