マウスのレーザー誘発脈絡膜新生血管の形態学的変化のフォロー アップの縦生体内イメージングの有用性を紹介します。
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この記事について
サマリー
要約
レーザー誘発脈絡膜新生血管 (CNV) は、加齢に伴う黄斑変性症 (AMD) のウェット フォームを模倣する確立されたモデルです。このプロトコルでは血管新生のプロセス、マルチ モーダル縦から得ることができる強力な情報焦点を当てるをトリガーするレーザー誘起病変を生成の技術的な考察を通して単に読者を目指します生体内のフォロー アップ期間中イメージングします。
レーザー マウス CNV モデルは、ダイオード レーザーの管理によって生成されました。体内のマルチ モーダル イメージング技術は、CNV 誘導、進行と回帰を監視する使用されました。最初、ブルッフ膜の中断を確認するレーザー加工直後後スペクトル領域光干渉断層法 (SD 10 月) を行った。血管造影 (FA) を使用してその後体内イメージング脈絡膜レベルでシリアル画像からブルッフ膜の正常な損傷を確認しました。SD 10 月と FA の両方を使用して CNV の増殖と、レーザー加工後 5、10、および 14 日回帰の縦方向のフォロー アップを行った。シンプルで信頼性の高い FA 画像から漏れの CNV leasions の等級が表示されます。CNV のサイトで網膜の厚さの測定のための手動口径アプリケーションと組み合わせて、合計の網膜厚測定のための自動セグメンテーションは、浮腫の存在の公平な評価を許可します。最後に、脈絡膜の flatmounts に isolectin GS IB4 染色を使って CNV の組織学的検証を行います。どちらられる、染色は、ImageJ で isolectin 正面積が計算されます。
このプロトコルは、CNV の病理学のような高スループット スクリーニングを必要とすることができます高速、マルチ モーダル、治療研究と CNV 病理学および網膜浮腫の信頼性の高い分類に便利です。さらに、高解像度 SD OCT は網膜や網膜の流体の蓄積など、他の病理学的特徴の記録をできます。ただし、このメソッドは SD OCT 画像から手動で行う必要のあるボリュームの CNV 解析を自動化する可能性を行いません。
概要
齧歯動物で人間の CNV の病理学を模倣する最初の成功した試みはロング ・ ラット1クリプトン レーザーでほぼ三十年前を示した。その後、クリプトン レーザーは、最も人気のあるマウス緊張、c57bl/6 j2,3,4でブルッフ膜を破るに使用されました。FA と組織学的汚れ CNV 誘導の成功率を検証しました。OCT などの非侵襲的画像診断装置の急速な発展は、齧歯動物の前臨床モデルのフィールドの成長を促しています。大幅目と同じで複数の時点で網膜の形態変化を監視する機能は動物の使用の削減に寄与する、実験的研究の効率が向上します。CNV 病変の組織学的評価ではなく簡単で、レーザー管理、画像取得と画像解析ソフトを用いた面積/体積推定のサイトの周りの異常血管の増殖のラベリングを必要とします。対照的に、生体内のイメージ投射様相は、CNV の病理とその解釈のより複雑な分析をご紹介します。
ここで提示グレード誘導、進行、CNV の回帰してシンプルで比較的高速なメソッド FA、SD、OCT を使用して、マウスの自動抽出法レーザー誘起 CNV モデル。
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プロトコル
すべての動物は、動物のための使用の眼科とビジョンの研究や、EC 指令 86/609/EEC 動物実験で承認され、フィンランドの動物実験委員会によって監視されているプロトコルを使用して ARVO 声明に従って扱われました。
1. レーザー マウス CNV モデル5
- 肉眼的に異常動物の目を検査します。
- マウスの重量を量る。
- 計算し、動物、例えばメデトミジン (1 mg/kg), ケタミン (75 mg/kg)、および 1:1.5:2.5、またはケタミン (40-75 mg/kg) の割合で蒸留水 (0.9 %nacl 溶液) の混合物の重量に基づいて、使用する麻酔薬の適切な量を準備します。キシラジン (5 mg/kg)、および 1:2.; 5:1 の割合で蒸留水 (0.9 %nacl 水溶液)20 g のマウスのための混合物の 0.1 mL を注入します。
- 腹腔内麻酔薬を注入します。
- 動物に麻酔がかかるまでは、ケージと待機にマウスを置きます。マウスは正しくペダル反射の欠如によって麻酔を確認します。
- レーザー安全保護具の使用を確認します。
- スリッ トランプと 532 nm ダイオード レーザーを入れます。
- ケージや加熱パッド上の場所から、マウスを削除します。
- 瞳孔の拡張のトロピカミドの一滴を適用します。フル (3 mm) 瞳孔の拡張のための 3-5 分を待ちます。
- スリッ トランプのステージ上にマウスを置きます。
- Applanate 角膜に coverslip の眼科液体ゲルの一滴を配置します。
- 中心部で視神経乳頭とマウスの目を向けます。
- レーザー パワーを 100 にセット mW、100 ms に期間および 50 μ m スポット サイズ。
- レーザー光線を網膜色素上皮 (RPE) に焦点します。
- 1 つ目にそれぞれ理想的で、4、8、および 12 ポジション、視神経乳頭周囲の網膜の血管を避けることによって 3 つのレーザー ショットを確認します。すべてレーザー網膜出血の不在のためのショット後の眼底を検査します。反対側の眼は非レーザ書込みコントロールとして機能します。
- 加熱パッド背面 coverslip と場所のマウスを破棄します。
- 両方の目に釘ゲルの滴の一滴を適用します。
2. SD 10 月6,7
- 齧歯動物のアライメント ステージにマウスを置き、頭を固定します。
- X ・ Y ステージ コント ローラーを用いた生体内イメージングの目に直面する (例えばBioptigen/ライカ Envisu R2200) SD 10 月システムのレンズを合わせます。
- SD 10 月ブルッフ膜の中断を確認するスキャンを実行: 書込みサイトで基準線を手動で移動 SD-10 月は、全体の目をスキャンしたら。ブルッフ膜の区切りは、書込み領域 (図 1参照) で明確に見えるはずです。
3. フルオレセイン造影7,8,9
- ホルダー、マウスを取り外して、FA システム (例えば、ハイデルベルク Spectralis HRA2) の上に置きます。
- レーザーで焦点は、表示ウィンドウの中央に視神経の頭部と赤外モードを使用しての眼底部を燃やします。
- 皮下や腹腔内 5% フルオレセイン ナトリウム塩 20 g のマウスのための 0.1 mL を注入します。
- 脈絡膜レベルに焦点を当てます。
- 脈絡膜のフォーカス レベルからイメージを取る。
- 網膜のレベルを合わせるし、イメージを取る。
- 30 s と繰り返し手順 3.4 3.6 を待ちます。
- マウスをホルダーから外し、加熱パッドの上に置きます。
- メデトミジン、アチパメゾール (0.5 mg/kg, i. p.)、または麻酔から動物の回復を待つのため α 2 拮抗薬による麻酔を逆にします。
- SD-10 月と FA イメージング麻酔下の動物 5、10、および 14 フォロー アップ日を繰り返します。
4. CNV のグレーディング
- グレード 10 月画像、次として 0 日目にレーザー加工後すぐに撮影した脈絡膜の FA 画像からブルッフ膜の損傷:
0 - ブルッフ膜が破損していません。
1 にブルッフ膜の成功した被害 - 等級一連の次のように網膜の FA イメージの蛍光信号のダイナミクスを比較することによって観測された漏れがあった書込みのスポットから CNV の存在:
0 - 網膜の正常な外観
漏れの 0.5 - かすかな染
1.0 - 漏れの CNV 領域
注: は、OCT 画像における網膜流体の存在が CNV グレーディングお勧めしたい疑問 FA、CNV の確認を OCT イメージングを使用します。
5. 網膜厚測定
- 網膜の厚さ測定の自動領域分割ソフトウェアを使用します。その合計の網膜厚は RPE (健康測定サイト)、または損傷 (書込みサイト) のサイトの周り RPE を結ぶ架空の線神経線維層からのすべての層の厚さとして考慮されることを確認 (図 7を参照)。
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結果
バブルやレーザー加工後すぐに出血は常に表示されません。したがって、SD 10 月は特にブルッフ膜の損傷を確認することが重要です。図 1は、異なる時点でレーザー投与後 OCT イメージングの例を示します。
図 1: 10 月アン顔ビュー眼底画像 (VIP 画像) の白、緑、赤の円に記載されている 3 つの書込みエリアを表示します。10 月 B スキャン画像が撮影された前 (ベースライン) のレーザー加工、ブルッフ膜の中断を確認するレーザー加工直後後 (0 日で矢印をポイント ダメージのサイト)、レーザー投与後 5、10、14 日。白で囲ま...
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ディスカッション
マルチ モーダル イメージングでは、CNV の病理学的評価のための貴重なツールを提供しています。FA から成るイメージング プロトコルの紹介、SD OCT と CNV 病理、再現可能な迅速かつ信頼性の高い評価のための自動セグメンテーション。ブルッフ膜レーザー管理が確認された後の休憩。また、この段階で SD 10 月の使用はまたの結果の解釈を混同するかもしれない可能な網膜と網膜出血の即時の可視化を許可しました。網膜リーク FA 画像から蛍光信号に基づいて等級別になった。SD 10 月の使用は、CNV の病理学の詳細な説明を提供しました。さらに、フォロー アップ期間中のさまざまな時点での縦断的 SD 10 月分析には FA だけに頼る場合とらえどころのないまま検査開始の時間差が強調表示されます。
網膜厚は、自動抽出法を用いて測定しました。CNV が誘導されたサイトでの網膜の厚みを測定した手動で。Flatmount 脈絡膜の組織学的評価を確認すると、画像解析ソフト イメージ j. を用いて血管新生の領域
視軸の適切な透明性は提案する...
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開示事項
著者 Symantas Ragauskas、博士は従業員 (研究員) と提供契約のこの記事で使用されている臨床の CNV モデルを用いた研究サービス Experimentica 会社の株主です。
エヴァ Kielczewski の著者は、この記事で使用される SD OCT システムを生み出すライカマイクロシス テムズの社員 (研究アプリケーション エンジニア、10 月) です。
著者ジョセフ ・ ヴァンスは従業員 (NA 10 月セールス ・ ディレクター) のこの記事で使用される SD OCT システムを生み出すライカマイクロシス テムズ。ジョセフ ・ ヴァンスは、また社長と目的と、LLC のマネージング ディレクターです。
著者サイモン カジャ、博士はコンサルタント最高科学責任者および前臨床契約研究機関提供受託研究サービス、この記事で使用される臨床 CNV モデル税込 Experimentica 株式会社の株主です。サイモン カジャ、博士も CEO の K & P 科学的な LLC は、コンサルティング会社、生命科学、博士ジョン p. とテレーズ E. マルケイ恵まれて教授ロヨラ大学シカゴ、Stritch 医学部眼科として提供しています。この整理の言葉が検討されており、その利益相反ポリシーに従ってロヨラ大学シカゴ校によって承認されました。
著者 Giedrius Kalesnykas 博士は従業員 (CEO) と提供契約のこの記事で使用されている臨床の CNV モデルを用いた研究サービス Experimentica 会社の株主です。
謝辞
著者感謝したい Yuliya Naumchuk (Loyola 大学シカゴ)、アグネ Žiniauskaitė (Experimentica 株式会社) 優れた技術と再生産のサポート。カジャ博士の研究プログラムをサポートするには、博士ジョン p. とテレーズ E. マルケイ恵まれて教授ロヨラ大学シカゴ校で眼科で。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| メデトミジン(商品名ドミター) | オリオン | Vnr 01 56 02 | |
| ケタミン | インターベット | Vnr51 14 85 | |
| 0,9%NaCl | Bブラウン | 357 0340 | |
| キシラジン(商品名ロンプン獣医) | バイエル | Vnr14 89 99 | |
| トロピカミド | 参天 | 製薬Vnr04 12 36 | 散瞳エージェント |
| Viscotears | Alcon | Vnr 44 54 81 | |
| シスタン | コン | - | 潤滑剤 |
| 5%フルオレセインナトリウム塩 | シグマアルドリッチ | F6377-100G | 蛍光剤 |
| アチパメゾール(商品名アンチセダン) | オリオン | Vnr47 19 53 |
参考文献
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- Giani, A., et al. In vivo evaluation of laser-induced choroidal neovascularization using spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 3880-3887 (2011).
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- Sheets, K. G., et al. Neuroprotectin D1 attenuates laser-induced choroidal neovascularization in mouse. Mol. Vis. 16, 320-329 (2010).
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- Sulaiman, R. S., et al. A Simple Optical Coherence Tomography Quantification Method for Choroidal Neovascularization. J. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. 31, 447-454 (2015).
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再版と許可
