方法論記事

クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

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DOI：

10.3791/56186

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2017年8月29日

 ,  ,  ,  , 
1Center for Molecular Medicine Cologne (CMMC), University of Cologne, 2Cologne Center for Genomics (CCG), University of Cologne, 3Cologne Excellence Cluster for Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases (CECAD), Research Center and Systems Biology of Ageing Cologne, University of Cologne

この記事について

サマリー

ここでは、クロマチン免疫沈降 (チップ) と低豊富な鶏胚サンプルからグローバル エピゲノム プロファイルを生成するチップ seq ライブラリの準備のプロトコルについて述べる。

要約

クロマチン免疫沈降 (チップ) は、クロマチン修飾酵素特定の軌跡やゲノム規模で、転写因子やヒストン ファーストクリーニング変更されたヒストンのローカリゼーションをマッピングするための広く使われている手法です。次世代シーケンス (すなわち、チップ Seq) とチップ試金の組み合わせは、遺伝子制御ネットワークを世界的に明らかにして特に規制の非コーディング シーケンスのゲノムの機能アノテーションを改善する強力なアプローチです。チップ プロトコルは通常多量の細胞材料、従ってまれなセルタイプまたは小さい組織生検の調査にこの法の適用性を排除を必要です。チップ試金を初期脊椎動物胚体内で通常得られる生物学的材料の量に対応するために、するために述べるここでチップの簡易プロトコルを完了するために必要なステップ数、アッセイは、サンプルの損失を最小限に抑えるために減少しました。このチップ プロトコルは様々 なニワトリ胚および成体組織中細胞数 (5 × 104 - 5 x 10 の5セル) に低の異なるヒストン修飾を調査するため正常に使用されています。重要なは、このプロトコルは標準ライブラリの作製法を用いたチップ seq 技術と互換性のある、関連性の高い萌芽期ティッシュのマップ グローバル エピゲノムを提供します。

概要

ヒストン翻訳後修飾は、転写、複製 DNA 修理1,2,3など、さまざまなクロマチンに依存するプロセスに直接関与しています。さらに、異なるヒストン修飾を示す正 (などH3K4me3 と H3K27ac) または負 (例えばH3K9me3 と H3K27me3) 遺伝子の発現との相関と広く定義することができます活性化または抑圧的なヒストンをマークしたようそれぞれ2,3。その結果、全体的なヒストン修飾マップ、エピゲノム マップとも呼ばれますが、機能的脊椎動物のゲノム4、5の注釈に強力で普遍的なツールとして浮上しています。たとえば、遠位規制エンハンサーを識別できるように基づく系列クロマチンの特定の存在 (例えば、アクティブなエンハンサー: H3K4me1 と H3K27ac)、近位プロモーター領域からそれらを区別する (など活性プロモーター: H3K4me3)6,7,8。その一方で、主要な細胞アイデンティティの規定する機能を持つ遺伝子、通常、広範なクロマチン ドメインそれぞれ根本的な遺伝子の転写活性アクティブまたは非アクティブの状態に応じて H3K4me3 と H3K27me3、マーク9 で発見します。 ,10。同様に、主要な細胞アイデンティティ遺伝子発現クラスター化エンハンサー (すなわち、超エンハンサー) 広範な H3K27ac マーク ドメイン11として識別することができます複数のと空間的に制御する頻繁にようであります。

現在、ヒストン修正図を生成する技術を使用してチップ seq チップ (チップ マイクロ アレイに結合) などの従来のアプローチと比較して高い解像度、ノイズ、大きい範囲、および下位以下の少ないアーティファクトを提供しますコスト12。それにもかかわらず、エピゲノム マップ チップ seq 技術を使用しての世代が関心のサンプル チップを正常に実行する能力と大抵関連付けられるその固有の限界あります。伝統的なチップ プロトコルは通常細胞の培養系にこの法の適用性線またはセル範囲が制限簡単に分離できます生体内で(例えば、血液細胞) 細胞の数百万を必要です。ここ数年で低細胞数と互換性のあるチップ プロトコルの修正の数は説明13,14,15,16をされています。ただし、これらのプロトコルを次世代シーケンス (すなわち、チップ seq) と結合される設計、彼らは通常アドホック図書館準備方法13,14,を使用15,16。

ここでは、我々 は中間に低細胞数 (5 × 104 - 5 x 10 の5セル) を使用して、ヒストン変更プロファイルを調査するためチップ プロトコルを記述した (すなわち、チップ qPCR) いずれかの選択した軌跡またはグローバル (すなわち、チップ seq) (図 1)。チップ seq 技術を組み合わせることで、当社のチップ プロトコルは標準ライブラリの製法をできるようになり、多くの研究所10に幅広くアクセスと共に使用できます。このプロトコルは、いくつかのヒストンを調査に使用されている(例えば、 H3K4me3、H3K27me3、および H3K27ac) 異なる鶏胚組織 (例えば、脊髄神経管 (SNT)、成人プロミネンスと胚盤葉上層) で。ただし、少量で、生物学的および臨床的に関連するサンプルをだけ得ることが他の生物に広く適用されると見込んでください。

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プロトコル

ドイツ動物のケアのガイドラインに従って施設動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 承認された鶏胚の実験を実行する必要ありません。ローカルのガイドラインに従ってのみ実験鶏 HH44 (18 日) 胚と古い IACUC 承認が必要。ただし、本研究で使用される胚は胚の開発の初期の段階ですべてだった (すなわち HH19 (72 h)).

注: このプロトコルの目的は qPCR または次世代シーケンス (すなわち、 チップ seq) のヒストンの修正を調査すると効果的に組み合わせることができますので、チップ試金の詳細な説明を提供するために低豊富な胚サンプル (5 × 10 4-5 x 10 の 5 セル各チップの反作用のため) と異なる組織型 ( 図 1)。プロトコルは転写因子と共活性剤 (例えば p300) の結合プロファイルを調査に適用する必要があります。ただし、これらの調節蛋白質の低い豊富なのため大きな細胞数が必要 (5 x 10 5 - 各チップの反応の 5 × 10 6 セル) をする可能性があります

。

1。 準備の卵と鶏の SNT の

注: microdissections 手順は技術的に組織に組織および動物モデルと動物モデルから異なります。解剖のプロトコル使用例鶏胚をステージ HH19 から、上腕の SNT セクションを取得する詳細について説明します

。
  1. 37 ° C、湿度 80% ステージ HH19 鶏胚を得るための 3 日間で水平方向での地元のブリーダーから得られる、肥沃な白色レグホーン鶏の卵を孵化します
    2. 。
  2. ハンバーガーとハミルトンに従って段階鶏胚発達ステージング システム 17 決定します
    3. 。
  3. 冷たい条件の下ですべての microdissections を実行; クロマチンの整合性を侵害可能性がありますそうでなければ、.
  4. HH19 胚を隔離します。
    1. 胚にアクセスできるように、10 mL シリンジ針 (0.90 × 40 mm) を用いた、胚を下げるためアルブミンの 3 mL を抽出します
      2. 。
    2. 高級はさみを使って卵に小さな開口部を作るし、ロック溶液 1 mL を追加 (レシピの 補足資料 参照) 胚体外膜の除去を容易にします
      3. 。
    3. 胚の可視化を容易にするため、すなわち下針 (0.55 × 25 mm 2) で 1 mL 注射器を使用して 10% インド黒インク/ロック溶液を注入しています
      4. 。
    4. 医療外科高級はさみと鉗子を使用して胚を囲む胚体外膜切断します
      5. 。
    5. 4.5 cm x PBS ソリューション 1 の 20 mL を含むペトリ皿に胚を転送する穴あきスプーンを使用します
      6. 。
  5. 、羊膜と高級シザーと顕微鏡下で鉗子を使用した胚体外膜の残りの部分を離れて解剖します
    6. 。
  6. 尾 SNT ( 図 2) を分離する胸部領域に拡張胚の上腕のレベルで横の SNT セグメントをカットします
    7. 。
  7. 横/腹側 (例えば、 側板中胚葉、外胚葉、脊索、および大動脈) SNT を囲む組織を削除する鉗子 ( 図 2) を使用します
    8. 。
  8. 3.5 cm シャーレ暖かい (37 ° C) トリプシン (トリプシン EDTA/ソリューション 1: 250) 5 mL を含む解剖鶏 SNT セグメントに没頭します
    9. 。 SNT の周りの非神経組織の緩みが顕微鏡下で検出された場合、
  9. はトリプシン処理を停止します
    。 注: trypsinization 時間する必要があります厳密に管理する過剰消化・神経組織の分散を避けるためとの SNT の構造の整合性を保持する
    10. 。
  10. トリプシン処理後きれいな SNT 部分を準備する手動で残り、外胚葉性間葉系組織を削除します
    11. 。
  11. は、SNT セクションを 1.5 mL チューブに転送し、フラッシュを液体窒素で凍結それ。一度十分な SNT セクションは蓄積された (プールの SNT セクション 1 つのチップの反作用のための ~ 30 鶏の胚から)、-80 デパート ° C
    注: 場合十分な萌芽期ティッシュ (5 すなわち 5 x 10-5 x 10 の 6 セル) 単一または少数の鶏胚から解剖することができ、凍結が必要ではありません、直接次の手順に続行することが可能です。表 1 のトラブルシューティング ガイドを参照してください
    。 注: 注意!液体窒素は超低温、適切な保護具を着用します
    12. 。

2。DNA に架橋タンパク質: 日 1

注: 特に明記しない限り氷の上のすべての手順を実行します

。
  1. 追加 500 μ L DMEM の 10 %fbs と凍結組織に直接 1 M Na 酪の 10 μ L、あるいは新たに切り裂かれたティッシュをすぐに。再 1 mL ピペットをゆっくり停止することによって細胞をホモジナイズしてください
    。 注: Na 酪酸の追加はオプションですが推奨されるヒストンのアセチル化を調査する場合。DMEM-10 %fbs ではなく 0.1 %bsa を用いた 1 × PBS でサンプルを再停止することができます。政府短期証券や BSA の追加はオプションですが、その後遠心分離の手順でサンプルをペレット化を容易にします
    2. 。
  2. 37% ホルムアルデヒド (1% ホルムアルデヒド ファイナル) の 13.5 μ l 添加し室温で 15 分間ローテータの上に置きます
    。 注: 注意!ホルムアルデヒドは有毒な
    3. 。
  3. 管に 2.5 M のグリシンの 25 μ L を追加し、ホルムアルデヒドを抑制するために室温で 10 分間の回転子の上に置きます
    4. 。
  4. スピン テーブル トップ遠心分離機の 4 ° C で 5 分間 850 x g のチューブです。上澄みを廃棄します
    5. 。
  5. 一度風邪を 500 μ l 添加の餌を洗浄作りたてを洗って 850 x g と、5 分の 4 ° C で (レシピの 補足資料 を参照)、遠心分離機をバッファー、上澄みを廃棄します
    6. 。

3。換散および超音波処理

  1. 準備完全な換散バッファー (LB) (レシピの 補足資料 を参照してください)、冷たい氷の上。1 mL の LB、プロテアーゼ阻害剤濃縮 (25 x) の 40 μ L、100% の 10 μ L の 950 μ L を使用して、PMSF
    2. 。
  2. ピペッティングによる完全なポンドの 300 μ L でペレットを再懸濁します、4時 10 分にロッキング プラットフォームに ° C
  3. は、次の設定を使用してサンプルを超音波照射: 温度 4 ° C = 合計時間 = 7 分、“ に ” 間隔 = 30 s、“ オフ ” 間隔 = 30 s、振幅 = 25%
    注: 超音波照射条件は各組織の最適化が必要な超音波発生装置の使用によって異なります。200 から 600 に至るまでせん断の DNA は、最低の超音波処理設定を使用するお勧めサイズで bp。ひら組織型によって大きく異なりますせん断ty、超音波ボリューム、架橋条件、および装置。表 1 のトラブルシューティング ガイドを参照してください
    4. 。
  4. 細胞の残骸をペレットへの 4 ° C で 10 分間 16,000 x g で熱量のサンプルをスピンします
    5. 。
  5. が新鮮な 1.5 mL チューブにライセート (清) を転送します
    。 注: 出発原料は 2 つのチップの実験のための十分な場合、完全なポンドの 300 μ L に追加できる熱量クロマチン (すなわち、 最終巻: 600 μ L).
  6. 10% の追加の 30 μ L オクチルフェノールエトキシ レートのすべての 300 μ L の超音波溶解処理 (最終濃度: 1%)、ピペッティングで混ぜます
    。 注: 注意!オクチルフェノールエトキシ レートは急性毒性 (経口、経皮、吸入).

4。抗体の孵化

  1. 因数、330 μ L の 2 つの 1.5 mL チューブにライセート超音波処理: チップと入力コントロール (原料の 10%) として 30 μ L 300 μ L。ストア、" 30 μ L 入力コントロール サンプル " に-20 ° C
    注: 660 μ 超音波溶解処理し、2 つのチップの反応が同じサンプルから実行される場合配布できる 3 つの 1.5 mL チューブ (300 μ L チップ #1、チップ #2 300 μ L と入力コントロール (各チップの原料の 20%) として 60 μ L のために).
  2. を加える熱量クロマチン因数とミックスする反転の 300 μ L 抗体の 3-5 μ g.
    注: この研究では、各チップの反応を行った K4 でメチル化されたヒストン H3 トライの抗体 (H3K4me3) K4 でメチル化されたヒストン H3 ・ ディ ・ (H3K4me2)、K27 でメチル化されたヒストン H3 トライ (H3K27me3)、K27 のヒストン H3 トライ アセチル化 (H3K27me3)。このプロトコルの成功は、使用される抗体の品質に完全に依存です。抗体は、特定、特定のタンパク質の免疫沈降で効率的にする必要があります。複雑な immunoprecipitate 架橋蛋白質・ DNA を使用することができる抗体の量を決定することが重要です。また、抗体の特異性は、それが正しい蛋白質を検出することを確保するため西部のしみでチェックできます。複数の非特異的なバンドを検出する抗体はチップ推奨されません
    3. 。
  3. は、クロマチンへ 4 ° C で一晩 (12-16 h) 抗体をバインドするロッキング プラットフォーム上管を配置します
    。 注意: 表 1 にトラブルシューティングのガイドを参照してください
    4. 。

5。磁性ビーズの作製: 日 2

  • 氷でチューブ 1.5 mL および microfuge に各チップの反作用のための蛋白質 G/磁気ビーズ スラリーの 100 μ L 分注 50 -
    1. 洗浄 3 回コールド ブロック ソリューションと磁気ビーズ (レシピの 補足資料 参照) (4 ° C)。反転またはフリックで 500 μ L のコールド ブロック ソリューションとミックスを追加します。マグネット ホルダーに管を入れ、管の側に解決するビーズを待ちます。透明な液体を注ぐを繰り返します。最後の洗浄後、すべて液体ゲルの読み込みヒントを削除します
      2. 。

    6。クロマチン免疫沈降

    1. 洗浄ビーズに抗体が結合クロマチンの 300 μ L を追加し、ミックスに反転します
      2. 。
    2. 抗体をビーズにバインドする、少なくとも 4 時間のための 4 ° C で管の回転で縦方向に回転します
      3. 。

    7。洗って、溶出、逆にクロスリンク

    1. チル RIPA 洗浄バッファー氷上では、風呂の水を 65 ° C に設定 (レシピの 補足資料 を参照してください)、4 に遠心分離機を precool ° C
    2. は、4 回 1 mL の冷 RIPA 洗浄バッファーでクロマチン結合ビーズを洗浄し、氷の上を保ちます。これを行うには、反転またはフリックによって冷 RIPA 洗浄バッファー ミックス 1 mL を追加します。マグネット ホルダーにチューブを置き、ビーズ、チューブの側に解決を待ちます。透明な液体を注ぐし、繰り返します
      。 注意: RIPA 洗浄バッファーで洗浄の数を最適化する必要がありますサンプル タイプ、サンプルの豊富なと使用されている抗体の応じて。洗浄数の増加がバック グラウンドを減少させるが、また減少 qPCR またはチップ シーケンスによる下流解析を妥協することができます回復された DNA の合計金額
    3. チューブにテ/50 mM NaCl の 1 mL を追加し、前述のように、マグネット ホルダーを使用して液体を削除する前に新鮮な 1.5 mL および microfuge の管に TE/50 mM NaCl でクロマチン結合ビーズを転送します
      4. 。
    4. 4 ° C で 3 分間 900 x g でビーズをスピン、マグネット ホルダーに管を配置し、ゲルの読み込みヒントと残りのすべてのテを削除します
      5. 。
    5. 溶出バッファーの追加 210 μ L (レシピの 補足資料 参照) 常温、フリックすることで再懸濁します
      6. 。
    6. 揺れながらヒート ブロックの 65 ° C で 15 分間想定し, 浸出液
      7. 。
    7. 室温で 1 分 16,000 x g でビーズをスピンし、磁気ホルダーにチューブを配置します
      8. 。
    8. ビーズが落ち着いて一度新鮮なおよび microfuge の管に上清 (〜 200 μ L) を転送します
      9. 。
    9. (手順 4.1 で冷凍) 部屋の温度-20 ° C から入力コントロールのサンプル (30 μ L) を解凍溶出バッファー (90 μ L) の 3 つのボリュームを追加し、ミックスを簡単にボルテックス
      10. 。
    10. 65 ° C で一晩 (12-16 h) クロスリンクを逆にチップとコントロールのサンプルをインキュベートします
      11. 。

    8。ダイジェスト細胞蛋白質と RNA: 日 3

    1. 8.1At 室温 (SDS をうすめる) チューブ TE バッファーの 1 ボリュームを追加して、ミックスに反転: コントロールのサンプルの 120 μ L、200 μ L チップ サンプルに TE の 200 μ L に TE の 120 μ L を追加します
      2. 。
    2. 追加 RNase A 0.2 mg/mL 最終濃度、反転にミックスする: 20 mg/ml の RNase A 2.4 μ L を追加し、コントロールのサンプルの 240 μ L 4 μ L チップ サンプルを 400 μ l 添加する RNase A を 20 mg/mL の
      3. 。
    3. 37 ° c に RNA を消化 2 h の水風呂でチューブをインキュベートします
      4. 。
    4. ミックスは、最終濃度 0.2 mg/mL と反転の「プロティナーゼ K を追加: コントロール サンプルの 240 μ l と 20 mg/mL, プロテイナーゼ K 400 μ L チップ サンプルための 4 μ l に 20 mg/mL プロティナーゼ K の 2.4 μ L を追加します
      5. 。
    5. 蛋白質を消化し、DNA を浄化する 55 ° C の 2 h の水浴中で加温します
      6. 。

    9。チップ qPCR

    注: 補足資料 で説明されているように DNA の抽出および浄化を実行します

    。

    注: 前述の 補足資料、( 図 3) を 200-500 bp の DNA 断片が得られることを確認するために超音波処理効率を確認します

    。

    注: チップが実際に働いていたかどうかを決定するための重要なステップです。既知の興味の蛋白質のためのゲノム結合部位がある場合のプライマーを設計できます量的な PCR (qPCR) 知られているサイトがチップ DNA で濃縮され具体的にかどうかを決定するために拘束されることがなく期待陰性コントロール領域との比較チャンディ日付蛋白質。例として、この作品はチップ H3K4me3 の実行により得られたチップ qPCR 結果を示しています (アクティブなプロモーター ヒストン マーク) と H3K27me3 (アクティブでないプロモーター ヒストン マーク) HH14 ニワトリから分離された SNT のセクションで ( 図 4 a).

    1. 同じ管で各プライマーのペア (前方および後方) を混合し、各を使用して 20 μ M でストック濃度を準備 dH 2 O (表 2).
      注: 各プライマーの効率は、チップ qPCR 解析の前に評価されるべき
      2. 。
    2. はチップと 20% の入力コントロール ステップ 8.5 qPCR 最適化で得られた DNA を使います
      。 注: DNA は通常入力希釈 20 x (チップの反作用で使用される原料の 1%) を qPCR 解析します
      3. 。
    3. 各 10 μ L の PCR、PCR チューブに次のコンポーネントを混在させる: DNA マスター ミックス (チップまたは 1% 入力) から 2 μ dH2O、SYBR グリーン ミックスの 2.5 μ、1 μ L の DNA を追加; プライマーとマスター ミックス、dH2O、SYBR グリーン ミックスの 2.5 μ L、前方および逆プライマー ミックスの 0.125 μ L の 2.375 μ L を追加します。
    4. 2 s と 1 分 900 × g で遠心する簡潔にボルテックスによってサンプルをミックス
    5. は、リアルタイム PCR (プライマーおよびここで使用されるサイクリング条件の例にあります 表 2 および 表 3、それぞれ) を実行します
      。 注: チップ qPCR データ分析: チップ信号は入力のパーセントとして計算されます。簡単に言えば、一度 Ct 値を取得各 qPCR 反応、100 または 6.644 サイクルの希釈倍率 (100 log2) が入力の DNA 反応で得られた Ct 値に適用されます。次に、(すなわち プライマー) の関心の特定の領域、チップ信号を計算通り:
      入力を調整 = Ct (入力) - 6.644
      チップ信号 = 100 x POWER(2;average of adjusted Input-Ct value ChIP sample)

    10. チップ seq ライブラリの準備;終わり修理: 4 日目

    1. 100 まで希釈溶出バッファーの 60 μ L の DNA チップの ng (材料 の表 を参照してください).
    2. エンドの追加 40 μ L ミックスを修復し、ピペットの軽く 10 倍
      3. 。
    3. サーマルサイクラー上で 30 分間 30 ° C に加温します
      4. 。
    4. 磁気渦ビーズ終わり修理ミックスを含むチューブに 160 μ L を追加。10 回のピペッティングにより徹底的にミックスします。室温で 15 分間インキュベートします
      5. 。
    5. マグネット ホルダーにチューブを置き、側管. 解決するビーズを待つ
    6. 透明な液体を注ぐ
      7. 。
    7. マグネット ホルダーをチューブのまま、作りたての 80% の 200 μ L を追加 EtOH
      8. 。
    8. 加温室温 30 s と破棄上清で。一度を繰り返して
    9. は、マグネット ホルダーに室温で 15 分の管を維持します。ペレットが乾燥していたら、マグネット ホルダーからチューブを削除します
      10. 。
    10. は、再懸濁バッファーの 20 μ L にペレットを再懸濁します。ミックス徹底的に 10 倍を軽くピペットします
      11. 。
    11. 室温で 2 分間加温します
      12. 。
    12. マグネット ホルダーにチューブ、チューブの側に解決するビーズの待ちます。上澄みの 17.5 μ L を新しいチューブに転送します
      13. 。

    11。チップ seq ライブラリの準備;アデニル酸 3 ' 終了

    1. 新しい A テーリング ミックス追加 12.5 μ 管と上下に 10 回軽くピペッティングして徹底的にミックス。サーマルサイクラーに管を配置し、次のプログラムによると孵化させなさい: 37 ° C、30 分、70 ° C、4 ° C で 5 分押し

    12。チップ seq ライブラリの準備;アダプターを縛る

    1. 再懸濁の追加 2.5 μ L バッファー、結紮ミックスの 2.5 μ L と適切な RNA アダプター インデックスの 2.5 μ L。ミックス徹底的に優しく上下に 10 回ピペッティングします
      2. 。
    2. 30 ° で 10 分間のサーマルサイクラーに加温します
      3. 。
    3. ストップ結紮バッファーと 10 回のピペッティングで徹底的にミックス追加 5 μ L.
    4. 渦磁気ビーズ、42.5 μ L をサンプルに追加します。10 回のピペッティングにより徹底的にミックスします。室温で 15 分間インキュベートします
      5. 。
    5. マグネット ホルダーにチューブを置き、管の側に解決し、明確な液体を注ぐビーズを待つ
    6. マグネット ホルダーをチューブのまま、作りたての 80% の 200 μ L を追加 EtOH
      7. 。
    7. 加温室温 30 s と破棄上清で。もう一度繰り返します
      8. 。
    8. マグネット ホルダーに管を保持し、15 分空気乾燥させるサンプル
      9. 。
    9. はマグネット ホルダーからチューブを削除し、再懸濁バッファーの 52.5 μ L でペレットを再懸濁します。10 回のピペッティングにより徹底的にミックスします。2 分間室温でインキュベート、マグネット ホルダーにチューブ、チューブの側に解決するビーズの待ちます。明確な上澄みの 50 μ L を新しいチューブに転送します
      10. 。
    10. 渦磁気ビーズのサンプルに 50 μ L を追加。10 回のピペッティングにより徹底的にミックスします。室温で 15 分間インキュベートします
      11. 。
    11. マグネット ホルダーにチューブを置き、管の側に解決し、明確な液体を注ぐビーズを待つ
      12. 。
    12. マグネット ホルダーをチューブのまま、作りたての 80% の 200 μ L を追加 EtOH
      13. 。
    13. 加温室温 30 s と破棄上清で。もう一度繰り返します
      14. 。
    14. マグネット ホルダーにチューブを維持し、15 分の乾燥サンプル空気
    15. はマグネット ホルダーからチューブを削除し、再懸濁バッファーの 27.5 μ L でペレットを再懸濁します。10 回のピペッティングで徹底的にミックスします
      16. 。 2 分間、室温で
    16. 加温マグネット ホルダーにチューブ、チューブ側に解決するビーズの待ちます。明確な上澄みの 25 μ L を新しいチューブに転送します
      17. 。

    13。チップ seq ライブラリの準備;DNA のフラグメントの増幅

    1. 0.2 mL PCR のテンプレートの場所 12.5 μ 管。上下に 10 回ピペッティングして徹底的に PCR プライマー カクテルの 2.5 μ、10 μ L の強化された PCR ミックス ミックスを追加します。サーマルサイクラーにチューブを置き、表 4 に示した条件を使用します
      2. 。
    2. 渦磁気ビーズとサンプルを 25 μ L を追加。10 回のピペッティングにより徹底的にミックスします。室温で 15 分間インキュベートします
      3. 。
    3. マグネット ホルダーにチューブを置き、管の側に解決し、明確な液体を注ぐビーズを待つ
      4. 。
    4. マグネット ホルダーをチューブのまま、追加 200 μ L 作りたての 80% のエタノール。30 s や破棄上清のため室温で孵化させなさい。もう一度繰り返します
      5. 。
    5. マグネット ホルダー、みましょうサンプル空気管が 15 分乾いた状態に保つはマグネット ホルダーからチューブを削除し、再懸濁バッファーの 32.5 μ L でペレットを再懸濁します。10 回のピペッティングで徹底的にミックスします
      6. 。
    6. インキュベートします。PCR チューブ/プレート常温で 2 分間。室温でマグネット スタンドに PCR チューブ/プレートを置き、チューブ側を解決し、新しいチューブに上清の 30 μ L を転送するビーズを待つ
      7. 。

    14。チップ seq ライブラリの準備;ライブラリ検証

    注: ライブラリの検証は、DNA および RNA の品質管理システムを使用して行われます。はしごの準備: 最初にゲノム DNA の梯子の 1 μ L 分注チューブ/ウェルとサンプル バッファーを 3 μ l 添加します

    。
    1. サンプルの調製: チューブ サンプル バッファーの 3 μ L でライブラリのサンプル (10-100 ng/μ L) の 1 μ L をミックスします。スピン ・ ダウンし、管の下部にサンプル配置に 5 s. スピンの最大速度に渦
      2. 。
    2. 品質管理システムにサンプルをロードします
      3. 。
    3. の実行が終了したら、プライマー二量体の例 ( 図 5) に存在がない; 帯約 135 プライマー二量体が対応する必要がありますを確認する最大値にコントラストを設定することによって、結果の分析 bp。でも弱いバンドが存在する場合は、溶出バッファーを追加して 2 番目のクリーン アップに進みます混合磁性体ビーズ 47.5 μ L を追加、最大で 50 μ L のボリューム (表 参照)。サンプルの濃度が低すぎる場合 (< 2 nM)、PCR (ステップ 13.1) の実行を続行、ステップ 12.16 から左 12.5 μ L のサンプル量で 15 ではなく 18 サイクルを使用します
      4. 。
    4. は、qPCR 市販キットを使用して、個別にライブラリを定量化します
      。 注: ライブラリのプール シーケンス処理できるシーケンサーを用いた 30 M の読み取り/サンプルを目指して 1 x 50 nt プロトコルの単一読み取り
      5. 。

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    結果

    チップ seq 実験 HH19 鶏の胚からプールの SNT セクションを使用して、HH22 の上顎突起鶏胚との結合プロファイルを調査する段階 HH3 鶏胚を行ったチップ プロトコルのパフォーマンスを示すためには、各種のヒストンの修正は (すなわちH3K4me2、H3K27ac、H3K4me3、および H3K27me3)。チップ Dna が得られた後、超音波処理効率は対応する入力 Dna (図 3) のアガロース電気泳動で評価しました。チップと入力の Dna は遺伝子座のバインドまたは調査のヒストンの修正 (図 4 a) で非連結予想で濃縮を測定するチップ qPCR 解析に使用されました。図 4 aH3K27me3、H3K4me3 濃縮の例 HH19 SNT のセクションでレベルは SOX17、SOX2、非アクティブ、アクティブ、SNT では、それぞれ 2 つの遺伝子のプロモータ...

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    ディスカッション

    エピゲノム チップ seq を使用してヒストン修飾のプロファイリングは、異なる携帯電話4,5,18で脊椎動物のゲノムの機能アノテーションを改善するために使用できます。これらエピゲノム プロファイルは使用できます、他のものの間でエンハンサー エンハンサー (すなわち、アクティブ、プライミング、または構え)、規制の状態を定義し、異なる生物の主要な細胞アイデンティティ レギュレータを定義する要素を識別するためにまたは病理学的コンテキスト (例えば、広い H3K4me3 プロモーター ドメインおよびスーパー エンハンサー)6,7,9,10、

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    開示事項

    著者には、開示すること、競合する金銭的な利益はありません。

    謝辞

    著者は、このプロトコルの確立の間に彼の優秀なテクニカル サポート 1 月アペルをありがとうございます。Rada イグレシアス研究室で作業に支えられて CMMC 学内資金、DFG 研究助成 (RA 2547/1-1、RA 2547/2-1、および TE 1007/3-1)、カタルーニャ ・ オープン大学上級研究員グループ Grant、および CECAD グラント。

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    材料

    この記事で使用された材料の一覧
    名前会社カタログ番号コメント
    試薬
    BSA粉末ロス3737.3
    リン酸生理食塩水緩衝液(PBS)シグマアルドリッチD8537
    スHCL pH 8.0グマアルドリッチT1503NaCl
    カールロス3957.2EDTA
    カールロス8043.2
    EGTAカールロス3054.2
    Na-デオキシコール酸シグマアルドリッチD6750-24
    N-ラウロイルサルコシンシグマアルドリッチ61743-25G
    HepesApplichemA3724,0250
    LiClロス3739.2
    NP-40グマアルドリッチI3021-100ml
    SDSCarl Roth1833
    Protein G/magnetic beadsInvitrogen1004D
    37% ホルムアルデヒドSigma Aldrich252549-1L
    グリシン
    RNasePeqlab12-RA-03
    プロテイナーゼ KSigma Aldrich46.35 E
    Na-酪酸Sigma Aldrich
    プロテイナーゼ阻害剤ロシュ5892791001
    SYBRgreen ミックスバイオザイム617004
    dH2OSigma AldrichW4502
    1 Kb ラダーサーモフィッシャーSM1333
    Orange GSigma Alrich03756-25
    アガロース Invitrogen16500-500
    0.25% トリプシン-EDTA (1x)Gibco25200-072
    オクチルフェノールエトキシレート (トリトン X 100)Roth3051.4
    DMEM (ダルベッコ´Modified Eagle Medium)Gibco31331-028
    Gel loading tips MultiflexA.HartensteinGS21
    qPCR PlatesSarstedt721,985,202
    384 wellSarstedt721,985,202
    1.5 mL tubesSarstedt72,706
    100 - 1,000 µL フィルターチップSarstedt70,762,211
    2 - 20 µL フィルターチップSarstedt70,760,213
    2 - 200 µL フィルターチップSarstedt70,760,211
    0.5 - 10 µL フィルターチップSarstedt701,116,210
    H3K27me3 抗体Active Motif39155
    H3K27ac antibodyActive Motif39133
    H3K4me3 antibodyActive Motif39159
    H3K4me2 antibodyActive Motif39141
    End Repair MixIlluminaFC-121-4001
    常磁性ビーズベックマン・コールターA63881
    再懸濁バッファーイルミナFC-121-4001
    A-テーリングミックスイルミナFC-121-4001
    ライゲーションミックスイルミナFC-121-4001
    RNAアダプターインデックスイルミナRS-122-2101
    ライゲーションバッファーイルミナFC-121-4001
    PCR プライマーカクテルIlluminaFC-121-4001
    Enhanced PCR MixIlluminaFC-121-4001
    ゲノム DNA ラダーAgilent5067-5582
    溶出バッファーAgilent19086
    サンプルバッファーAgilent5067-5582
    ライブラリ定量キットKapa BiosystemsKK4835 – 07960204001
    肥沃な鶏の白い卵LSL Rhein MainKN: 15968
    針 (Neoject)A.Hartenstein10001
    シリンジ (Ecoject 10 mL)Dispomed witt oHG21010
    Name会社名strongカタログ番号コメント
    Equipment
    遠心分離機HermleZ 216 MK
    サーモシェーカーITABISMKR13
    ソニケーターアクティブモーティブエピシアープローブ ソニケーター ソニケー
    ターダイアゲノードバイオラプタープラス
    ローテータースチュアートSB3
    可変容量(5 –1,000 &MU;L) ピペットエッペンドルフN/A
    タイマーシグマN/A
    マグネットホルダーサーモフィッシャーDynaMag-2 12321D
    テーブルスピナーヒースロー サイエンティフィックスプラウト
    ミキサーLMSVTX 3000L
    リアルタイムPCRサイクラーロシュライトサイクラー;シリアルNr.5662
    PCRサイクラーApplied BiosystemsGene Amp PCRシステム 9700
    DNAおよびRNA品質管理システムAgilentAgilent 4200 TapeStationシステム
    鉗子Dumont 5-Inox-H
    穴あきスプーン世界の精密機器501997
    カールトリシカールシSLB2659V

    参考文献

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