このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚は、幼虫から全体のトランスクリプトーム解析手法を提案またはセルを並べ替えられます。我々 には、RNA の隔離、RNASeq データの経路解析と遺伝子発現変動の qRT PCR による検証。
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方法論記事
サンプル準備およびゼブラフィッシュから RNASeq による遺伝子発現データの解析
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
グローバル遺伝子発現変動の解析は、観察された表現型の基になる新規経路を識別するための貴重なツールです。ゼブラフィッシュは動物の多数からの RNA の隔離のしやすさのため全体動物または個々 の細胞集団から全体のトランスクリプトームの迅速な評価の優れたモデルです。ここで RNA シーケンス (RNASeq) を用いたゼブラフィッシュ胚におけるグローバル遺伝子発現解析のためのプロトコルが表示されます。我々 は胚やトランスジェニック動物の細胞を用いての細胞集団から RNA の準備について説明します。濃縮経路と Gene Ontology (GO) 用語的遺伝子発現データセットを識別するために RNASeq データの解析のためのアプローチについて述べる。最後に、定量的逆転写 PCR (qRT PCR) を用いた遺伝子発現変動の検証のためのプロトコルを提供します。これらのプロトコルは、新規遺伝子発現変動を識別するためにコントロールの比較分析およびゼブラフィッシュの実験セットを使用ことができ、興味の表現型への分子洞察力を提供します。
概要
遺伝子発現の比較分析、観察された表現型に貢献する新規の遺伝子を識別するために貴重なツールです。そのような分析は通常トラン スクリプトの豊富な比較実験の定量的評価に依存し、サンプルを制御します。QRT PCR など、ターゲットを絞ったアプローチが比較的迅速かつ単一遺伝子発現変動の調査のため正確です。RNA シーケンス (RNASeq) ことが今このような調査のための標準実験システム間でサンプル間の遺伝子発現の重要な変更を識別するために広い、無料の仮説のアプローチを提供しています。
ゼブラフィッシュは、多くの病気の分野で著名なモデルとして浮上しています。もともと彼らの高い多産と比較的低コスト、メンテナンスのための発生生物学研究でのユーティリティ ゼブラフィッシュの実験的使用として同様の大人の段階に胚から表現の広い範囲を含むように進化している、1,2,3の試金の分子の広い配列。確かに、これらの利点は、分子機構の研究は急速な人生のすべての段階で遺伝と環境両方の操作のしやすさと材料の大きい量を獲得しやすいのためコスト効果の高い結合します。さらに、ゼブラフィッシュの胚・仔魚の透過的な性質作る離散セル人口4の生体内可視化を許可する細胞と組織....
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プロトコル
以下の通り動物のすべてのプロトコルに従い、メリーランド州機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) の大学によって承認します
。1 胚の準備
- 生成の胚を自然交配
- 、生後 3 か月に培養胚生殖成熟 5 , 8。.
- は採卵の前に、の晩に分割交尾タンクに目的のひずみからアダルト オスとメス魚を分離し、各タンクに男性 2 名と女性 3 を追加します
。 注: 使用組換え insulin2a:mCherry 蛍光レポーターひずみの膵 β 細胞を分析します 。
- 交配に転送魚新鮮なシステム水タンクし、ライトは、次の朝来る直後後に、区分線を削除します 。
- は、魚の胚、下部タンクに観察されるまで自然に仲間を許可します。希望の金額が収集されるまで、30 分間隔で胚を収集します。各ストア収集時点 28.5 で胚のメディアで個別のペトリ皿に ° C
- が必要な場合、実験的文化メディア 6、遺伝物質または配置のマイクロインジェクションを実行し、新鮮なハンクの胚を培養 ' 28.5 ° C で 10 cm シャーレで s 胚中
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結果
遺伝子を発現特異的の並べ替え。
ゼブラフィッシュ モデル Alström 症候群とバルデ-ビードル症候群 (BBS) の幼虫の段階で発現が異なる遺伝子を識別するためには、いずれかのalms1を対象としたまたは注入によってbbs1の成績証明書は以前に MOs のスプライス ブロックを検証野生型のゼブラフィッシュの胚の16,17。5 日目にポスト受精 (dpf) は、上記のセクション 3 で説明した、コントロール、MO 注入胚と同様に、それぞれの条件から抽出したの RNA の 2 つの複製。各サンプルからの RNA の深さに配列された 〜 の読み込み 1 億 2000 万 〜 1 億 700 万読み取りゼブラフィッシュ ゲノムへの配置。ゲノムの exonic 領域にマップされている一直線に並べられた読み取りの .......
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ディスカッション
このプロトコルで記述されているアプローチでは、全体の動物または特定のソートされた細胞集団のトランスクリプトーム レベル分析のため比較的迅速かつコスト効果の高い戦略を提供しています。ゼブラフィッシュのため使いやすさと出発物質、遺伝の実装の容易さや実験環境と大規模な可用性の大量の生成で、急速に研究のこのタイプの有利なモデルを提供します。細胞型の特定および組織固有の人口の分離を可能にする遺伝子改変レポーター線のスペクトル。
ここ詳細、一方このメソッドは簡単に FACs やコレクションの代わりとして青少年や成人の魚から収集した組織切片を収容できます。基本的なスプレッドシート コマンドと既存の経路と移動データベースの使用に依存する基本的な追跡調査解析戦略を構築しました。このアプローチの主な利点は、コンピューターのプログラミングやデータベースの管理に高度な専門知識を必要とせずユーザー補助の使いやすさです。そのため、この戦略は、大規模遺伝子発現データセットの有益な分析のためのすべての背景の調査官には適用です。
我々 のアプローチは、RNAS.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この作品は、T32DK098107、P30DK072488 (N.A.Z.) R01DK102001 (N.A.Z.) によって支えられた (T.L.H. および J.E.N.)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 市販試薬 | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | 溶解試薬 |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | 解離バッファー 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | 解離バッファー 2 |
| DEPC 処理水 | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA変換 | Thermo Scientific | K1621 | cDNA変換キット |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master |
| Mix FACSバッファー | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| クロロホルム | Sigma Aldrich | 288306 | |
| 酢酸ナトリウム | Sigma Aldrich | S2889 | |
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| ゼブラフィッシュ株 | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | カタログ番号 | コメント |
| strong>Equipment | |||
| 40ミクロンセルストレーナー | Sigma CLS431750 | ||
| FACSチューブ | BD Falcon | 352063 | |
| 血球計算盤 | Sigma | Z359629 | |
| 解剖顕微鏡 | ツァイス | ||
| 倒立顕微鏡 | ツァイス | ||
| ナノドロップ | サーモサイエンティフィック | ||
| イルミナ HiSeq | イルミナ | ||
| ライトサイクラー 480 | ロシュ | ||
| メイティングタンク 1.0L クロッシングタンクセット | アクアニアリング | ZHCT100 | |
| FACSチューブ 5mLポリプロピレンチューブ | BDファルコン | 352063 | |
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| ソフトウェア | |||
| Excel | マイクロソフト | ||
| コンセンサスパスDB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO濃縮分析 | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis |
参考文献
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , 4th ed, Academic Press. (2017).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M.
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再版と許可
