サンプル準備およびゼブラフィッシュから RNASeq による遺伝子発現データの解析

Summary

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚は、幼虫から全体のトランスクリプトーム解析手法を提案またはセルを並べ替えられます。我々 には、RNA の隔離、RNASeq データの経路解析と遺伝子発現変動の qRT PCR による検証。

Abstract

グローバル遺伝子発現変動の解析は、観察された表現型の基になる新規経路を識別するための貴重なツールです。ゼブラフィッシュは動物の多数からの RNA の隔離のしやすさのため全体動物または個々 の細胞集団から全体のトランスクリプトームの迅速な評価の優れたモデルです。ここで RNA シーケンス (RNASeq) を用いたゼブラフィッシュ胚におけるグローバル遺伝子発現解析のためのプロトコルが表示されます。我々 は胚やトランスジェニック動物の細胞を用いての細胞集団から RNA の準備について説明します。濃縮経路と Gene Ontology (GO) 用語的遺伝子発現データセットを識別するために RNASeq データの解析のためのアプローチについて述べる。最後に、定量的逆転写 PCR (qRT PCR) を用いた遺伝子発現変動の検証のためのプロトコルを提供します。これらのプロトコルは、新規遺伝子発現変動を識別するためにコントロールの比較分析およびゼブラフィッシュの実験セットを使用ことができ、興味の表現型への分子洞察力を提供します。

Introduction

遺伝子発現の比較分析、観察された表現型に貢献する新規の遺伝子を識別するために貴重なツールです。そのような分析は通常トラン スクリプトの豊富な比較実験の定量的評価に依存し、サンプルを制御します。QRT PCR など、ターゲットを絞ったアプローチが比較的迅速かつ単一遺伝子発現変動の調査のため正確です。RNA シーケンス (RNASeq) ことが今このような調査のための標準実験システム間でサンプル間の遺伝子発現の重要な変更を識別するために広い、無料の仮説のアプローチを提供しています。

ゼブラフィッシュは、多くの病気の分野で著名なモデルとして浮上しています。もともと彼らの高い多産と比較的低コスト、メンテナンスのための発生生物学研究でのユーティリティ ゼブラフィッシュの実験的使用として同様の大人の段階に胚から表現の広い範囲を含むように進化している、^1,2,3の試金の分子の広い配列。確かに、これらの利点は、分子機構の研究は急速な人生のすべての段階で遺伝と環境両方の操作のしやすさと材料の大きい量を獲得しやすいのためコスト効果の高い結合します。さらに、ゼブラフィッシュの胚・仔魚の透過的な性質作る離散セル人口⁴の生体内可視化を許可する細胞と組織特異遺伝子改変レポーター行を生成するために理想的。このような行の搾取レポーター遺伝子発現に基づく特定の孤立セル型グローバル遺伝子発現解析が可能です。

ゼブラフィッシュ胚の培養後 RNASeq を使用して世界的な遺伝子発現解析のための包括的なプロトコルをご紹介します。Morpholino (MO) を含む遺伝子の実験操作-ベースの一過的遺伝子ノックダウンや CRISPR を介したゲノム編集、提示されている他^5,6,7。したがって、全体の胚からの RNA の隔離のための詳しいプロトコルに焦点を当てるまたは経路ツールと遺伝子の ontology (GO) の用語を使用して RNASeq 結果の簡単な解析に続いてトランスジェニック レポーター発現細胞を並べ替えられます。最後に、我々 は定量的逆転写 PCR (qRT PCR) による遺伝子発現変動の検証のための戦略を含まれています。これらのプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の遺伝的変異体または環境条件の比較を含む、実験の条件の広い範囲を受けるに適用されます。

Protocol

以下の通り動物のすべてのプロトコルに従い、メリーランド州機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) の大学によって承認します

。

1 胚の準備

1. 生成の胚を自然交配
   1. 、生後 3 か月に培養胚生殖成熟 ^{5 , 8。}.
   2. は採卵の前に、の晩に分割交尾タンクに目的のひずみからアダルト オスとメス魚を分離し、各タンクに男性 2 名と女性 3 を追加します
      。 注: 使用組換え insulin2a:mCherry 蛍光レポーターひずみの膵 β 細胞を分析します
   。
   3. 交配に転送魚新鮮なシステム水タンクし、ライトは、次の朝来る直後後に、区分線を削除します
   。
   4. は、魚の胚、下部タンクに観察されるまで自然に仲間を許可します。希望の金額が収集されるまで、30 分間隔で胚を収集します。各ストア収集時点 28.5 で胚のメディアで個別のペトリ皿に ° C
   5. が必要な場合、実験的文化メディア ⁶、遺伝物質または配置のマイクロインジェクションを実行し、新鮮なハンクの胚を培養 ' 28.5 ° C で 10 cm シャーレで s 胚中 ⁸
      注: morpholino (MO) 注入または変異動物における遺伝子発現解析、遺伝子発現の付随的影響を各操作が可能性がありますに注意してください。突然変異が観測 ⁹ MO 系遺伝子の転写レベルでの遺伝子の補正を表わすことができる
   。
2. 胚
   1. のグループで胚を培養 50 – 75 胚 すべての胚の一貫した発達のタイミングを図る 10 cm シャーレあたり
   。
   2. ように発達進行 ¹⁰ 割球、ふせ、体節の段階で解剖顕微鏡を使用して発育形態を監視します
      。 注: 料理の発達遅延を防ぐために、死にかけている、または不正な胚を削除します
   。
   3. 分離胚の発達年齢に基づきます。約 24 までセグメンテーション (後の原腸陥入 10.33 h ポスト受精 (hpf)) 後の体節数を使用して胚年齢を測定 hpf。段階の胚および 24 後総ボディ長さを利用した幼虫 hpf
      。 注: 体節は、シェブロンの形をした中胚葉性組織、胚の背の部分に存在します
   。
   4. 28.5 ° C の定温器に並べ替えられた胚を置き、目的の時代に進行する開発が可能です
   。

2。単一細胞解離: 全胚や細胞集団の並べ替え

1. 全胚解離
   1. 安楽死ゼブラフィッシュ胚段階で必要な動きが観測されないまで 5 〜 15 分のための氷にペトリ皿を置くことによって.
   2. は、ラベル付きの 1.5 mL 遠心チューブに 20 胚のプールを転送します。遠心チューブから任意の余分な胚のメディアを削除します
   。
   3. 追加 200 μ L 溶解試薬 (材料の表 を参照してください) の胚を含むチューブに。機械的に乳棒を用いて溶解試薬で胚をホモジナイズしてください。1 mL の総量をさせる 800 μ L 溶解試薬を追加します。RNA の抽出まで-80 ° c ストア
   。
2. フロー並べ替えセル隔離 ¹¹
   1. シャーレから 1.5 mL 遠心チューブに胚を転送し、できるだけ多くの胚の培地を取り除きします
      。 注: 胚の年齢に応じて機械的解離もありますこのステップで必要です。胚と > 48 hpf、進む前に胚の整合性を混乱させる杵の使用をお勧めします
   。
   2. 孵化胚解離バッファー 1 の 1 ml (材料表 参照) 1.5 mL 遠心チューブに。室温で 15-30 分間インキュベートします。優しく上下に潜伏段階 3-4 分毎をミックスする P1000 探針を用いたピペッティングによるソリューションをカップ刻んだ。ボルテックスにかけないでください
   。
   3. は 300 × g で 3 分間遠心分離によって胚を収集し、上清を除去します。再 1 mL 解離バッファー 2 (材料の表 を参照) で胚を中断します。通常のピペットおよび trituration 室温で 15-30 分間インキュベートします
   。
   4. は 1-2 μ L の顕微鏡 (FACS) バッファーの並べ替え蛍光活性化細胞の懸濁液を希釈することによって消化を評価します
      。 注: 完全な消化力が発生しました, 因数最小限細胞塊と萌芽期ティッシュの部分の単一のセルを示すときです
   。
   5. は、5 分削除上清の 300 × g で遠心分離によって細胞を収集します。40 μ m 細胞がサンプルから未消化の組織を除去するストレーナー 1 mL FACS バッファー、および重力フィルターにセルを再停止します
   。
   6. 診断を使用してセルを数えるし、約 1 × 10 ⁶ セル/ml に FACS チューブ FACS バッファーで希釈します
      。 注: セル型の胚 (5% 未満の合計)、膵 β 細胞など数が比較的小さい、1,000 段階一致の胚の最小値を使用します
   。
   7. は、FACS 選別溶解試薬または FACS バッファーのみを含む FACS 管と同様、FACS 管細胞懸濁液試料 1 mL を含む施設を提供します。ゲート蛍光レポーターを表す単一のセルのみを収集する FACS 流れソーター
   。
   8. が目的のセル番号が収集されるまで FACS がフローに並べ替えを実行します
      。 注: RNASeq を実行するには、総 RNA の最低があります。3,000-5,000 細胞が十分に高品質・高濃度の RNA を隔離することがわかりました
   。
   9. 氷の上集められたセルを格納し、RNA の準備に進んでください
   。

3。RNA の準備

1. RNA の抽出
   1. 部屋の温度で 5 分間溶解試薬と (手順 2) から収集したサンプルをインキュベートします
   。
   2. 追加溶解試薬の各 1.0 mL のクロロホルムの 0.2 mL 使用し、室温で 2-3 分間 15 s. 加温の手でチューブを反転します。4時 15 分間 12,000 × g でサンプルを遠心分離機 ° C
   3. は、新鮮な管に分けられて、水性相を転送し、溶解試薬使用の各 1.0 mL のイソプロパノールの 0.5 mL を追加します。室温で 10 分間インキュベートします。4時 10 分 12,000 × g でサンプルを遠心分離機 ° C
   75% エタノールで洗浄
   4. 4時 5 分 7,500 x g でサンプルを遠心分離機と ° C 完全に上澄みを除去し、乾いた空気で常温乾燥。15-30 μ L ジエチルエステル (DEPC) で RNA を再停止-水を扱われます
   。
2. 浄化高品質 RNA
   1. 1/10 ボリューム 3 M 酢酸ナトリウム (pH 5.5) と RNA のサスペンションを組み合わせるとイソプロパノールの 1 巻。室温で 20 分間インキュベートし、4時 10 分 12,500 x g でサンプルを遠心分離機 ° C
   2. DEPC 処理水で冷えた 70% エタノールでペレットを洗浄し、4時 5 分 10,000 x g でサンプルを遠心分離機 ° C. 繰り返し洗浄ステップを一度します
   。
   3. は、上澄みを除去し、室温で乾燥することができます。DEPC 処理水で再停止します
   。
   4. 濃度 (ng/μ L) の純度 (260/230 比) 吸収分光法を使用して抽出した RNA の試金します。260/230 値であることを確認 〜 2.0 RNASeq に進む前に。私たちまで-80 ° C で保存します。e (最大 6 ヶ月).
   5. は、RNASeq のベンダーまたはコアに RNA サンプルを送るし、遺伝子発現変動解析読み込みシーケンスの定量化に基づきます。ベンダーから返される結果は、通常トラン スクリプトのサンプル間で読み取りに大きな倍変化を示す遺伝子のリストとして指定します
      。 注: 上記の方法は質の悪い RNA を得られます場合は、列を使用できます。量、濃度、および RNA サンプルの RNA 整合性数 (鈴) は、ベンダーまたはコアを確認すべき。ベンダーまたはコアも通常評価するりん
   。

4。経路と行く用語分析

注: コアまたはベンダーによって提供される RNASeq 後遺伝子発現解析の代表的な出力の 図 1 を参照してください

。 スプレッドシートの管理ソフトウェア

1. 1. 1. オープン コントロールと 1 つの実験条件を比較する を 並べ替え発現遺伝子 のデータ (結果) (参照してください 材料表).
      2. 横にドロップダウン矢印を選択、' の並べ替え ' ボタンをクリックし、選択 " カスタム並べ替え " 統制条件と実験における特異的発現遺伝子を含むスプレッドシート内で
      。
      3. は、下のテキスト ボックスを選択 ' 列 ' ポップアップ ウィンドウを並べ替えるを選択、' LFC ' 列。確保する ' 値 ' で選択されている、' ソートの ' 列。選択する選択 ' 最大最小から ' で、' 注文 ' 列とクリックして " OK ".
         注: これが並べ替えて発現遺伝子、発現の低下 (負 LFC) とのそれらは、リストの下部に表示されます間、増加式 (正 LFC) とのそれらは、リストの上部に表示されます
      。
   2. 次のように 1 つのコントロールに複数の実験条件を比較します。
      1. 選択差分を決定するスプレッドシート コントロールと実験 1 の空の列の最初のセルは、2 つの実験条件で見つけられた遺伝子を表明しました。セルに次の式を入力:
         
         注: この式はもし、ISERROR の組み合わせと一致機能。(i) の MATCH 関数は、マッチ (A1, Experimental2_vs_Control!たとえば、0)、セル A1 に値になります (ENSEMBL ID) という名前の Experimental2_vs_Control シートの A 列 (たとえば) で (Experimental2_vs_Control!)。" 0 " 完全一致を検索することを示しますの値を返す、正確な一致が見つかった場合、" 1 "、一致が見つからなかった場合、関数はエラーを返します " N/A "。(ii) MATCH 関数の結果は ISERROR (一致 (A1、Experimental2_vs_Control、ISERROR 関数に入力され、!たとえば、0))、どこで、入力がある場合 " 1 " 戻ります一致を示すが見つかりました、" 偽 "、入力がある場合、" N/A " を示す一致するものは見つかりませんでした、それが返されます " 真 "。(iii) の " 真 " または " 偽 " 場合、結果は、IF 関数に入力 (ISERROR (一致 (A1, Experimental2_vs_Control!たとえば、0))、" "、" 複製 ")、どこで、入力がある場合 " 真 " を示す一致が見つかりませんでした、最初の引用符のセット間の値が返されます (" ") では空で、したがってセルは空になります。入力がある場合 " 偽 " 発見された一致を示す、2 番目の引用符セットの間の値が返されます (" 複製 ")、セルと " を複製 ".
      2. プレス " を入力してください " または " を返す " 式を実行します。式を含むセルを選択し、セルの右下隅にあるボックスをクリックします。クリックしたマウスを維持し、最後まで列のすべての方法を選択した領域をドラッグして ' 機能 ID '、列内の各セルに式をコピーする
      。
      3. 選択 " カスタム並べ替え " もう一度、クリックして並べ替えの第 2 レベルを追加、" + " 左下隅のアイコンです。最初のレベルで " 順 "、[列の選択] " を複製する "、並べ替えを選択] の下 ' 値 '、順序選択してください] ' Z A から '。2 番目のレベルでは、" によって、"、[列の選択] ' LFC '、並べ替えを選択] の下 ' 値 '、順序選択してください] ' 最大最小から ' 選択 " OK ".
         注: これは表情変化の方向性に基づく 4 つのグループに遺伝子のリストを並べ替えられます。確実に両方または反対の方向の同じ方向で表情に変化の両方の実験条件で見つけられた遺伝子をチェックすることが重要です
      。
      4. は、遺伝子記号列から任意のかっこは削除前に進むまたは結果はありませんデータベースで発見しました。遺伝子記号を含む列全体を選択します。選択 " 編集 "、" 交換 " ドロップ ダウンで ' ファイル ' メニュー。タイプ " (*) " で、" 検索: " 置換ウィンドウ、および休暇のバー、" で置き換えます: " 空バー。選択 ' すべて置換 ' かっこのすべてのインスタンスを削除します
         。 注: * 何もない、それらを削除するのに置き換えられます任意のプログラムは、強調表示されたセル内の任意のインスタンスを検索するよう求められます 2 つのかっことかっこの任意のインスタンスとの間のこの文字を配置することによって文字数を表します
      。
2. 決定濃縮経路
   1. コピー クリップボードに豊かな経路を決定する 1 つのセットの遺伝子記号を希望します。ConsensusPathDB ¹² に行きます。選択 " 遺伝子解析の設定 " の web ページの左のサイドバーに続いて " 過剰表現解析 ".
   2. は、遺伝子のリストを貼り付け、" 遺伝子/タンパク質の識別子のリストを貼り付け " ボックス。選択遺伝子の記号、" 遺伝子/タンパク質識別子型 " ボックスし、クリックして、" 続行 "。次にボックスをオン " 経路データベースで定義された経路 " 経路ベースの下でセクションを設定します
      。 注: 解析のオプションの数を検索する使用可能なデータベースのリストを含むが表示されます。彼らは、最も確立された、包括的なデータベース Kegg と Reactome データベースを除くすべてのデータベースを選択解除をお勧めします。入力リストと p 値カットオフ設定と最低の重複部分をニーズに基づいて調整もできます。これらの設定をデフォルトの 2 遺伝子の最小のオーバー ラップおよび 0.01 p 値カットオフを残してお勧めします
   。
   3. 選択 " 豊かなセットを見つける " 入力リスト内の遺伝子を含む経路のリストを取得します
      。 注: 出力に続いて各経路の名を含む表形式になる " サイズを設定 " (合計遺伝子経路の数を示す)、" 含まれている候補者 " (その経路は、入力リスト内の遺伝子の数を示す)、および p 値と q 値 (FDR)、経路が確認されたデータベース
   。
3. 経路ネットワークの世代
   1. 上記のように豊かな経路を決定します
   。
   2. をすべて視覚化される経路名の横にある各ボックスを選択するか、またはをクリックして経路ネットワークの視覚化する豊かな経路の選択 " すべて " の下で " 選択 " 選択ボックスの上の列ヘッダーの選択 "選択したセットを視覚化する " です
      。 注: をお勧め未満 30; がある場合は、すべての経路を可視化します。30 経路より大きいがある場合 (これらの入力リストから遺伝子の最大数を含む) 上の 30 の最も豊かな経路を選択することをお勧めします
   。
   3. 調整、" 相対的な重複 " と " 候補を共有 " desir ページの上部中央でどちらかのボックスを選択し、入力フィルター、ed % の相対的な重複またはより適切なために厳しくする、共有の候補者の数が明確、かつ選択経路ネットワーク内で重複 " 適用 ".
      注: 我々 は、それらを接続する 2 経路と 2 共有候補者の最低 20% の遺伝子重複を示す 0.2、最小相対的な重複をお勧め。グラフの凡例は、ページの左上のグラフの凡例をクリックして見ることができる
   。
4. 富ませてターム行くの決定
   1. 1 つ希望クリップボードに濃縮遺伝子オントロジーを決定するグループの遺伝子記号をコピーします。' 行く濃縮分析ツール ' 遺伝子の Ontology の借款団 ¹³。下のページの左側にあるボックスに遺伝子シンボルのリストを貼り付け " ここにあなたの遺伝子の Id … "
   2. 遺伝子の Id] ボックスの下に一覧表示を使用して、囲碁用語の一連を選択: 細胞成分や分子機能生物学的プロセス。(推奨) を選択 ' 生物学的プロセス '。選択 ' 動脈分布 ' 外出先の下にある語句をボックスしてクリックして " 送信 ".
      注: 0.05 の既定 p 値カットオフ] を使用してお勧めします
   。

5。QRT PCR による検証

注: レプリケート実験ではターゲットを絞った qRT PCR による RNASeq の重要な遺伝子発現変動で識別される個々 の遺伝子を確認必要があります

。

1. cDNA を合成する
   1. は、セクション 3.1 で説明した方法を用いた胚から RNA を抽出します。RNA の抽出します
   。
   2. CDNA 変換を用いた cDNA に RNA の変換 1 μ g はキット (材料の表 を参照してください)。DNTPs、RNA や逆転写酵素酵素を組み合わせます。メーカーによるとたちの反応を実行 ' s 仕様
   。
   3. は cDNA 1:3 DEPC 処理水で希釈します。4 ° C、1-2 ヶ月で店
   。
2. qRT PCR 検証
   1. 遺伝子 RNA シーケンスの結果から qRT PCR によることを確認するを選択します。式で高いフォールドの変更遺伝子を識別します。これは豊かな表情を示すこれらの遺伝子も高い読み取り数を含む決定します
   。
   2. は、高フォールドの変更を遺伝子の高い読取りカウント リストから 10-12 のターゲットを選択します。少なくとも 1 イントロン ・ エクソンの境界にまたがる標的遺伝子を増幅するプライマーを設計します
   。
   3. は、qPCR プライマー デザイン サイト ¹⁴ に遺伝子または遺伝子のターゲット領域を入力します。選択、" 2 の qPCR のプライマーを設計 " プライマー セットを作成するサイトをプロンプトと
      。 注: するサンプル間比較を正規化する β-アクチン などの内部統制のプライマーを含めるようにしてください。Β-アクチン プライマーが 5 f: ' - TCGAGCTGTCTTCCCATCCA - 3 ' と r: 5 ' - TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG - 3 '.
   4. は、cDNA、前方のプライマー、逆プライマーおよびポリメラーゼを組み合わせます。QRT PCR 増幅遺伝子 ¹⁵ の相対的な表現を決定するを実行します
   。
   5. 相対的な定量化測定 ¹⁵ 興味の遺伝子の相対的な mRNA の発現を分析します
   。
   6. 差動表現の方向性が一致していることを確認する RNASeq 結果に qRT PCR を比較します
   。

Results

遺伝子を発現特異的の並べ替え。

ゼブラフィッシュ モデル Alström 症候群とバルデ-ビードル症候群 (BBS) の幼虫の段階で発現が異なる遺伝子を識別するためには、いずれかのalms1を対象としたまたは注入によってbbs1の成績証明書は以前に MOs のスプライス ブロックを検証野生型のゼブラフィッシュの胚の^16,17。5 日目にポスト受精 (dpf) は、上記のセクション 3 で説明した、コントロール、MO 注入胚と同様に、それぞれの条件から抽出したの RNA の 2 つの複製。各サンプルからの RNA の深さに配列された 〜 の読み込み 1 億 2000 万 〜 1 億 700 万読み取りゼブラフィッシュ ゲノムへの配置。ゲノムの exonic 領域にマップされている一直線に並べられた読み取りの ...

Discussion

このプロトコルで記述されているアプローチでは、全体の動物または特定のソートされた細胞集団のトランスクリプトーム レベル分析のため比較的迅速かつコスト効果の高い戦略を提供しています。ゼブラフィッシュのため使いやすさと出発物質、遺伝の実装の容易さや実験環境と大規模な可用性の大量の生成で、急速に研究のこのタイプの有利なモデルを提供します。細胞型の特定および組織固有の人口の分離を可能にする遺伝子改変レポーター線のスペクトル。

ここ詳細、一方このメソッドは簡単に FACs やコレクションの代わりとして青少年や成人の魚から収集した組織切片を収容できます。基本的なスプレッドシート コマンドと既存の経路と移動データベースの使用に依存する基本的な追跡調査解析戦略を構築しました。このアプローチの主な利点は、コンピューターのプログラミングやデータベースの管理に高度な専門知識を必要とせずユーザー補助の使いやすさです。そのため、この戦略は、大規模遺伝子発現データセットの有益な分析のためのすべての背景の調査官には適用です。

我々 のアプローチは、RNAS...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
市販試薬
TriZol	Thermo Scientific	15596026	溶解試薬
TrypLE	Gibco	12604013	解離バッファー 1
FACSMax	Genlantis	T200100	解離バッファー 2
DEPC 処理水	Sigma	95284
FirstStrand cDNA変換	Thermo Scientific	K1621	cDNA変換キット
2X SYBR Green Master Mix	Roche	4707516001	qRT-PCR Master
Mix FACSバッファー	Fisher Scientific	50-105-9042
クロロホルム	Sigma Aldrich	288306
酢酸ナトリウム	Sigma Aldrich	S2889
名前	会社	カタログ番号	コメント
ゼブラフィッシュ株
Tuebingen	ZIRC	ZL57
ins2a:mCherry	ZIRC	ZL1483
Name	Company	カタログ番号	コメント
strong>Equipment
40ミクロンセルストレーナー		Sigma CLS431750
FACSチューブ	BD Falcon	352063
血球計算盤	Sigma	Z359629
解剖顕微鏡	ツァイス
倒立顕微鏡	ツァイス
ナノドロップ	サーモサイエンティフィック
イルミナ HiSeq	イルミナ
ライトサイクラー 480	ロシュ
メイティングタンク 1.0L クロッシングタンクセット	アクアニアリング	ZHCT100
FACSチューブ 5mLポリプロピレンチューブ	BDファルコン	352063
名前	会社	カタログ番号	コメント
ソフトウェア
Excel	マイクロソフト
コンセンサスパスDB	http://cpdb.molgen.mpg.de/
GO濃縮分析	http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis