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方法論記事

架橋反応性無料、スポッター無料多重サンドイッチ免疫測定用チップをスナップします。

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DOI:

10.3791/56230

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2017年11月13日

 ,  ,  , 
1McGill University and Génome Québec Innovation Centre, 2Biomedical Engineering Department, McGill University, 3Parallex BioAssays Inc.

この記事について

サマリー

単に 2 つのスライドをスナップすることによって十字反応性無料多重サンドイッチ免疫測定を実行するためのスナップ チップ技術を紹介します。スナップの装置は、マイクロ アレイ-マイクロ アレイから試薬を確実に転送するために使用されます。スナップ チップは、クロス汚染せず異なる試薬の共存に注目を必要とする任意の生化学的な反作用に使用できます。

要約

多重蛋白質の分析は優れた診断感度と単一蛋白質と比較して精度を示しています。抗体のマイクロ アレイ マイクロ スケール イムノアッセイ単一チップ上で同時に実行の数千人を可能にします。サンドイッチ試金形式 2 抗体各ターゲットを検出することによりアッセイの特異性を向上させるが、したがって、多重化機能、制限試薬の交差反応性に苦しんでいます。抗体マイクロ アレイの共存 (ACM) 多重化タンパク質の架橋反応性無料検出用に開発されたアッセイ中マイクロ アレイ作製のため、高価なスポッター敷地内が必要です。この作品で一緒に、こうして偵察する必要はありませんサンプルの培養と検出抗体 (指紋) に後続のアプリケーションの間に単にスナップ 2 つのチップによってマイクロ アレイ-マイクロ アレイから試薬を転送スナップ チップ技術を紹介します。試金の実行からのスライドの準備を解離斑点を付けられた前のスライドのストレージ。2 つのマイクロ アレイ間の正確な配置を達成するために両方のシングルとダブルの転送方法と両方の方法のスライド作製を説明しました。結果を示す < 40 μ m の位置合わせは、二重譲渡、625 スポット/cm2の配列密度に到達を達成されています。多重化されたタンパク質解析のスナップ チップの使いやすさを実証する 50 plexed 免疫測定法を実施しています。35 蛋白質の検出限界は、範囲の pg/mL にあります。

概要

高い感度と特異度癌1,2のような複雑な疾患の診断における単一マーカーよりも複数のタンパク質を含むバイオ マーカーのパネルがあります。酵素結合抗体法 (ELISA) はゴールド スタンダード技術を臨床研究所プラズマにおける低 pg/ml 検出限界がアッセイ3,4,5あたり 1 つのターゲットに制限を達成するために使用されています。抗体のマイクロ アレイは、単一顕微鏡スライド6,7、8に並行して実施小型の試金の何千もの収容のために開発されています。ただし、このメソッドの多重化機能は、指紋の混合物のアプリケーションから生じる試薬駆動の交差反応によって制限されます、それはターゲット9,10数の増加により問題となります。,11. Plaら。多重サンドイッチ試金の結果として脆弱性スケール N は目標12の番号 4N(N-1) として表明しています。

抗体のマイクロ アレイ、抗体の共存のマイクロ アレイでの交差反応性を軽減するために (ACM) 多重サンドイッチ試金12の私たちの研究室で開発しました。キャプチャー抗体 (タクシー) はマイクロ アレイのスポッターと基板上斑点を付けられます。ブロック サンプルが表面に適用され、cAb 抗原複合体と同じスポットに個々 の指紋を発見し。抗体と抗原との間のすべての交差反応性シナリオことができます ACM、軽減して pg/ml 検出限界が達成されています。ただし、試金のプロトコルは高価で時間のかかる配置目的のため精度の高い敷地内マイクロ アレイ スポッターを使用して、この技術の広い適用を制限する実験中に、指紋をスポッティングの準備と必要になりますその他の研究所。スナップ チップの名前、ハンドヘルド ACM は架橋反応性自由のために開発されている、サンドイッチ免疫測定13,14,15を多重化スポッター無料します。タクシーや指紋は事前の試金スライドとマイクロ アレイ フォーマットのそれぞれ転送スライドに斑点を付けるし、格納されています。アッセイ中にスライドを取得、指紋のマイクロ アレイは単に 2 つのチップを一緒に撮ってアッセイのスライドにまとめてに転送されます。スナップの装置は、信頼性の高い試薬転送に使用されます。比較的大きな抗体結合能を持つニトロセルロース コーティング スライドは、液体の液滴を吸収するアッセイ スライドとして使用されている、ため、試薬譲渡が容易、しかし、スライドがより規則的なガラスのスライドとマイクロ アレイよりも高価です非透明スライドと互換性のあるスキャナー信号集録が必要です。

この作品は、スナップ チップを搭載した多重サンドイッチ免疫測定法を実行するプロトコルを示す.新しいスナップイン装置マイクロ アレイ-マイクロ アレイからより便利で信頼性の高い試薬譲渡しました。重要なは、ここでスナップ チップと通常のガラス スライド上に試薬転送法を確立しました。1024 点は正常に移され、ほとんどの実験室でこの技術の使用を大幅に広げてスライド ガラス上に配置されます。

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プロトコル

1 作製との貯蔵スナップ チップ

  1. シングル転送メソッド ( 図 1 a)
    1. 400 μ g/mL の抗体を含むスポット cAb 溶液とリン酸緩衝生理食塩水で 20% グリセロール。(PBS)、ニトロセルロース (または機能性ガラス) に 60% の相対湿度でインク ジェット マイクロ アレイ スポッター 13 試金スライド (1.2 各スポットに nL) 800 μ m センター - 間隔。スライドは 1 つのコーナーによるとスポッター デッキの固定を確認してください (ここでは、左下隅を使用).
    2. 相対湿度 60% で 1 時間室温で斑点を付けられたアッセイ スライドをインキュベートします
      3. 。
    3. クランプ 16 井戸に分割するアッセイ スライド 16 区画を持つスライド モジュール ガスケットです。0.1% を含む PBS の 80 μ L を追加することによって、スライドを 3 回リンスそれぞれも、シェーカー、5 分毎回で 450 回転で振動にトゥイーン 20 (pbst;).
    4. もそれぞれ、450 rpm で 1 h に振る解決を妨げるを追加 80 μ L.
    5. ガスケットを外し、乾燥窒素の流れとアッセイ スライドです
      6. 。
    6. はスポッター デッキで転送スライドを修正し、スポッター デッキの左下隅にスライドの左下隅をプッシュします。インク ジェット スポットは、タクシーと同じレイアウトで配置マーク (ポリスチレン ビーズのソリューション) の配列です
      7. 。
    7. は、乾燥アライメント マークをしましょう。転送スライドを反転し、左下隅に対して修正スポッター デッキの上に戻す
      8. 。
    8. DAb 溶液 20 μ g/mL の抗体があり、20% グリセロールおよび 1 %bsa をスポッティングを準備します
      9. 。
    9. 、スポッターを使用して ' s カメラ、位置合わせマークの写真を取る。基準としてスポッティングのプログラムにこの写真を実装し、最も一番上の左のマークを識別するためにインク ジェット偵察の画像認識システムを取得します。軽打の配列の最初のスポットとしてその座標を使用します。スポット 8 nL あたり 800 μ m の間隔でセンターに液滴
      10. 。
  2. ダブル転送方式 ( 図 1 b)
    1. 左下隅に対してインク ジェット偵察デッキに転送スライド 1 を配置。60% の相対湿度でインク ジェット マイクロ アレイ スポッターとスライドに 400 μ g/mL の抗体があり、20% グリセロール、PBS で 1 %bsa を含むタクシー溶液をスポット (0.4 各スポットに nL と 〜 200 μ m)。センターへの間隔は 400 μ m.
    2. はスナップ スナップ装置 ( 図 2) を使用して試金スライド上に cAb 滴を転送する転送被覆硝酸セルロース (または機能性ガラス) を使用してスライドの試金スライドです。 90 度開いた位置ですべてのプランジャーをロックを取り出してスナップ装置側
      1. ターンすべての六つのボタン。そのコンセントでスライド ホルダーにクリップの角を固定ポゴピンを直面している転送スライドを挿入します。黄金ポゴピンでプランジャーをリリース スライドの位置合わせピンに対して押されるかどうかを確認する 3 つのボタンの最初のセットを有効にします
        2. 。
      2. は、4 ポゴピンの座っているスナップイン装置逆さまに硝酸セルロース コーティング スライドを挿入します。銀のピンでプランジャーをリリースし、スライドが位置合わせピンに対して押されるかどうかを確認する 3 つのボタンの 2 番目のセットを有効にします
        3. 。
      3. スライド ホルダーを配置柱や穴を使用して正確な位置決めのためにトップのシェルを置くことによってスナップ装置を閉じます
        4. 。
      4. そのケージに閉じられたスナップイン装置を挿入し、マイクロ アレイの適切な圧力を適用している間対面させる完全に閉鎖タブを押します。1 分の閉じた状態に保つ
    3. スライドを分離します。アッセイ スライド 60% の相対湿度で 1 時間室温で孵化させなさい。洗ってブロック、およびアッセイ スライドを乾燥で手順に従って 1.1.3 - 1.1.5
      4. 。
    4. はインク ジェット偵察デッキと左下隅にプッシュ転送の別のスライドを配置します。50 または 100 μ g/mL の抗体 (表 1 参照)、20% グリセロール、PBS で 1 %bsa を含むスポット dAb 溶液。確実に 0.8 各スポット nL とセンターのセンター スポット間隔は 400 μ m.
    5. は、アッセイおよび転送スライドを格納します。乾燥剤を含む密閉袋にアッセイと転送の両方のスライドを密封し、-20 ° C のフリーザーに置く
      6. 。

2。スナップ チップを用いた免疫を多重

  1. 冷凍庫からアッセイ スライドを取得します。スライドに部屋の温度になるまで 30 分間密封袋のままにします
    2. 。
  2. 準備 7 点シリアル 0.05% を含む PBS でタンパク質を打ちつけることによって試料溶液を希釈したトゥイーン 20
    。 注: ここでは、割増の希釈係数が使用されます。蛋白質ごとの開始濃度が表 1 に記載されています
    3. 。
  3. 適切なサンプル ソリューションを準備します。たとえば、4 回 PBST バッファーでひと血清を希釈します
    4. 。
  4. 試金スライド 16 コンパートメント ケットをクランプします
    5. 。
  5. は、ピペッティングして 7 タンパク質の希釈溶液とタンパク質無料 pbst; 緩衝液 8 井戸の 1 つの列を入力します。同じスライド上の他の 8 の井戸の試料溶液をピペットします
    。 注: 80 μ L ソリューションはそれぞれに合うことができるも。さらにスライドを使用して、必要に応じて追加のサンプルを測定できます
    6. 。
  6. は、室温で 1 時間、または一晩 3 回で 450 rpm、5 分たびにシェーカーの pbst; 4 ° C 洗うスライドで 450 rpm でシェーカーでサンプルをインキュベートします。ガスケットを外し、乾燥窒素ガスの流れの下でスライドです
    7. 。
  7. は、冷凍庫から指紋と転送スライドを取得します。室温で 30 分間密封された袋をしてください。その後、水分補給のために 20 分間 60% 湿度安定化ビーズを含む密閉容器 (例えば 空ヒント ボックス) のスライドをインキュベートします
    8. 。
  8. は、アッセイのスライドがスナップ装置 ( 図 2) を使用して軽く水滴を転送する転送スライドをスナップします。セクション 1.2.2 スナップ装置の操作を参照してください
    9. 。
  9. は、スライドを区切ります。1 h. クランプ 16 コンパートメント ケットとアッセイ スライド用 60% 湿度安定化ビーズを含む密閉室内で試金スライドをインキュベートし、4 回スライドをすすいでください 450 rpm、5 分たびにシェーカーの pbst; を使用しています
    10. 。
  10. 溶液を各ウェルに PBS で 2.5 μ g/mL ストレプトアビジン fluorophore のピペット 80 μ L。450 rpm でシェーカーで 20 分間インキュベートします
    11. 。
  11. は、450 rpm でシェーカーの PBST で 3 回スライドと蒸留水をすすいでください。ガスケットを外し、乾燥窒素ガスを用いたスライドです
    12. 。

3。スキャンとデータ分析をスライド

  1. 635 nm レーザーを用いた蛍光マイクロ アレイ スキャナーでアッセイ スライドをスキャンします
    2. 。
  2. 解析ソフトウェア (例えば配列 pro アナライザー) 16 を使用して各スポットのネットの強度を抽出します
    3. 。
  3. 統計解析ソフトウェアを使用して各蛋白質の検出 (LOD) の制限を計算して試料中のタンパク質の濃度を決定します
    。 注: LOD は銅の標準の Y 切片の値として定義されています。3 つの独立した測定の標準偏差を 3 回ずつ rve
    4. 。

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結果

両方のシングルとダブルの転送方法の試金プロシージャは図 1に示します。単一の転送でアッセイ スライドに直接タクシーを発見され、指紋は、タクシー (図 1 a) のミラー パターンで使用時に試金のスライドに転送されます。1 つだけ転送手順が必要ですがズレ、スライドとインク ジェット ガントリー (図 2) との間の角度のミスアラインメントによって主に引き起こされる 2 つのマイクロ アレイ、苦しんでいるこのメソッド。この課題に取り組む方法の 1 つ、スポッティング スコープと適切にスナップイン装置でスライドを修正後タクシーとアッセイ スライドの順に指紋を転送することです (図 1 b)。このメソッドを使用して、両方のマイクロ アレイは、正確に同じ位置に転送されます。画像認識システムまたはアライメント マーカーは二重譲渡方法の必要ありません...

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ディスカッション

この作品は、私たちは基本的な実験のセットアップを持つ研究者の多重相互反応性無料イムノアッセイは広く利用可能、スナップ チップ技術を発表しました。既存の抗体のマイクロ アレイとは異なり、マイクロ アレイ スポッターは不要エンドユーザーです。、両方のシングルとダブルの転送方法をデモンストレーションし、二重譲渡提供に優れたアライメント精度 〜 98% スポット、63 μ m14の最大のずれを 40 μ m。新しいスナップイン装置は便利なこの技術を研究者にアクセスできるように、一貫した圧力で 2 つのスライドに合わせて開発されました。信頼性の高い試薬転送を実現硝酸セルロース コーティング スライドのみならず、通常のガラス スライドにも広範なトレーニングを必要とせずこの技術の応用を大幅拡大します。スナップ チップの有用性を示すためには、50-プレックス イムノアッセイを行った事前斑点、ストアドのスライドを使用してと蛋白質の 70% の範囲の pg/mL14で Lod を達成しました。混合物として指紋を適用する既存の多重イムノアッセイと比べ、ACM とス...

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開示事項

マギル大学は、Huiyan 李とデビッド ユンカーとこの仕事のいくつかの側面に発明者として特許出願を提出は。

謝辞

インク ジェット偵察の使用ありがとう博士ロブ スラデック。我々 は最終的なカナダの機関からのサポート健康研究 (機構)、自然科学と工学研究審議会のカナダ (レベル)、カナダの癌協会の研究・ カナダ基礎技術革新 (CFI) を認めます。D. j. のおかげでは、カナダの研究の椅子からサポートします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
リン酸緩衝生理食塩水錠剤フィッシャーサイエンティフィック5246501EA
ストレプトアビジン結合Cy5ロックランドs000-06
Tween-20Sigma-Aldrichp1379
ウシ血清アルブミンJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc001-000-162
グリセロールSigma-AldrichG5516
ブロッキングソリューション:BSAフリー StabilGuard Choice マイクロアレイ スタビライザーSurModics, IncSG02
ニトロセルロースコーティングスライドGrace Bio-Laboratories, Inc305116
アミノシランコーティングスライドSchott North America1064875
Snap DeviceParallex BioAssays Inc.PBA-SD01
インクジェットマイクロアレイスポッターGeSiMナノプロッター 2.0
スライドモジュールガスケットグレース・バイオラボラトリーズ204862
湿度安定化ビーズパラレックス・バイオアッセイPBA-HU60
Array-Pro Analyzer softwareMedia CyberneticsVersion 4.5
蛍光マイクロアレイスキャナーAgilentSureScan Microarray Scanner
Biostatistics softwareGraphPad SoftwareGraphPad Prism 6
Endoglin capture antibodyR&Dシステムズ MAB10972
エンドグリンタンパク質R&D Systems1097-EN
エンドグリン検出抗体R&DシステムBAF1097
IL-6a(表1参照)R&Dシステムズ
IL-6b(表1参照)Invitrogen

参考文献

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