方法論記事

透過型電子顕微鏡における微生物の連続超薄切片を得る方法

DOI：

10.3791/56235

⸱

2018年1月17日

 , 
1Medical Mycology Research Center, Chiba University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究は、透過型電子顕微鏡の高価な機器なし微生物の連続超薄切片を得るため信頼性が高く、簡単な手順を示します。

要約

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細胞と細胞成分を透過型電子顕微鏡の高倍率で 3 次元観察試料の超薄切片を準備する必要があります。連続超薄切片の準備は非常に困難であると考えられている適切な方法を使用する場合より簡単です。本稿では微生物の連続超薄切片を安全に取得するためのステップバイ ステップの手順を紹介します。このメソッドの重要なポイントは、: 1) 標本の大部分を使用し、互いに平行になるので、試料の表面とナイフのエッジを調整するには2) グループの連続切片をカット、スリット格子; に連続切片のグループを取得するときに髪の毛のペアを使用してセクションを分離することの難しさを避けるために3) 'セクション保持ループ' を使用してセクション グループの順序を混合しないように4)「水表面調達ループ」を使用してセクションは水頂点に配置され、こと; グリッドの目的の位置に配置するためのグリッドを最初タッチを確認するには5) アルミ ラック支持フィルムを使用し、容易にグリッド上のセクションを回復するしサポート フィルムのしわを避けるために・ 6) 染色チューブを使用し、誤ってピンセットでサポート フィルムを破ることを避けます。この新しいメソッドは、難なく連続超薄切片を取得できます。メソッドは、自動テープ収集ウルトラミクロトーム メソッドとシリアル ブロック顔または集束イオンビーム走査電子顕微鏡を使用して達成することができない、3 D の高解像度で微生物の細胞構造を解析することが可能になります。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

適切なシリアル極薄断面法は細胞および三次元電子顕微鏡レベルでの細胞成分の研究に不可欠であります。酵母細胞の細胞周期におけるスピンドル極体のダイナミクスを検討し、, 細胞周期と重複1,2,3,の時間の間に彼らの微細構造の形態学的変化を明らかにいる4,5。2006 年に「構造」を組み合わせることで新しい単語 'ストラクトーム」を造語と '-青梅 '、'構造情報、電子顕微鏡レベルで全体細胞の、定量的および三次元' 6,7として定義。

シリアルの極薄断面法を必要とするストラクトーム解析による酵母とExophiala dermatitidisの酵母細胞が約 200,000 リボゾーム7、8、を持っていたことがわかった。大腸菌セル 26,000 リボゾーム9、結核菌細胞いた 1,700 リボゾーム10明神らせん状細菌のみ 300 リボゾーム11を持っていた。この情報だけでなく各有機体、9種の同定にも成長率の推定に役に立ちます。

さらに、ストラクトーム解析; 新しい有機体の発見につながったParakaryon myojinensisは、細胞構造が原核生物と真核生物12,13,14,15の間中間日本の海岸沖の深海で発見されました。現時点では、シリアルの極薄断面法マスターに長い時間がかかるので困難であると見なされます。本研究では難なく極薄シリアルセクショニングを実行できます誰も信頼性の高い方法を開発しました。

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プロトコル

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注: この研究で使用される標本は、プロパンと液体窒素で急速凍結された微生物を凍結置換アセトン 2% オスミウム四酸化二を含むとエポキシ樹脂1,2,3、埋め込み 4,5,6,7,8,9,10、11,12,13 ,14,15,16,17,18。

1. 支持膜 (図 1-3) の準備

注:19ガラスの上の鋳造法を使用しての銀色のホルムバール支持フィルムを用意しています。

  1. 1.5 %100 mL を加えるホルムバール作る装置 (図 1) に二塩化エチレンでホルムバール。ゴム製ボール19を使用して ' を通る空気とソリューションを押すことによって装置の上部の列でホルムバール ソリューション (76 × 26 × 1.3 mm) スライド ガラスの半分を浸しなさい。
    1. 三方活栓を開いて、圧力を減らすために 'b' を通る空気を解放によって列からソリューションをドレインします。スライド ガラスの表面に膜を形成する装置から空気で乾燥してスライド ガラスを取り出してください。ホルムバール フィルムの乾燥を加速するのに白熱ランプを使用します。
  2. (図 2 a)、かみそりの刃でスライド ガラス上のフィルムの 4 つのエッジを削り、スライド20日から映画の分離を容易にするスライドに呼吸にスライド ガラスを浸すことによって水のフィルムをフロートした後、水をゆっくりと低い水平角度 (約 10 °、図 2 b)。
  3. 穴 (直径 4 mm) アルミ ラック (30 mm × 25 × 3 mm) を使用して水からホルムバール映画スクープ (図 3 a)。乾燥器で使用 (図 3 b) までホルムバール フィルムでラックを保ちます。

2. 超音波トリム ブレードと実体顕微鏡 (図 4) の下でかみそりの刃21試料ブロックのトリミング

  1. ブロックの先端 (図 4 a) 光学顕微鏡で観察することによって、ブロックの表面に細胞があることを確認します。
  2. チャック (ブロック ホルダー) で試料ブロックをマウントし、トリミング ステージ21 (図 4 b) のチャックをマウントします。このトリミング ステージには、供試体の背面から照明メカニズムがあります。
  3. 0.7 mm × 1.0 mm (図 4 c、5 d) のサイズにブロックをトリムします。エポキシ樹脂は非常に難しいため、まず超音波トリム ブレードを使用してブロックをトリミングします。超音波トリム ブレードは新たに導入されたマシン、ブロックは簡単に切り捨てられます。それからさらにかみそりの刃が付いているブロックをトリムします。(図 5 d、図 8を参照) を切削方向をマークする 1 つの肩をカットします。

3. ミクロトーム (図 5) を使用してダイヤモンド ナイフで試料ブロックのトリミング

  1. ウルトラミクロトームの試料ホルダーのチャックの試料ブロックを設定します。試料を置くシリアル極薄断面が場合の実際の位置に対して反時計回り 90 ° 実行 (参照してください図 5 d)。
  2. ダイヤモンド トリミング ナイフ (参照してください図 5 d) ブロックの表面をカットします。ダイヤモンド ナイフ エッジを標本ブロック面に平行に設定し、全ての試料 (図 5 d) を失うように試料表面の最小量をカットします。
    注: この手順は、試料の表面を滑らかに行われます。スリムな一部の試料表面の一部はそのまま (したがってこの部分は輝いていない鏡、図 5 dのような)、シリアル区分のため試料の任意の部分を失うように。供試体はブロックの表面にさらされるためにです。
  3. (図 5 c) 試料ブロックの切断を監視するナイフ ステージ上ミラー (メサ カット、M) を配置します。
  4. ナイフ ステージ (図 5 a) 左に 30 ° 回転させてトリミング ナイフを使用してブロックの左端 (上側、図 5 d、シリアルセクショニングでサンプルになります) をカットします。
  5. (シリアル断面、図 5 dで試験片の下側になります) 標本の左端からナイフ ステージ (図 5 b) 右に 30 ° を回転させることにより約 100 μ m でのブロックの顔をカットします。
    注: 連続切片は、約 90 の標本のスリムの部分からカットされますサイズ約 1 mm x nm。大きい部分が平行になるよう試料表面とナイフのエッジを調整する使用されます。ナイフ エッジに平行に試料表面を調整した後、大部分はかみそりの刃で削除されます。ミクロトームを用いた試験体の上下を切断することによって試料の両側になり滑らかな正確に平行互い (図 5 d) ストレートと切れ目のないリボンのセクションを取得する必要があります。

4 21を互いに平行に顔を試料表面とナイフのエッジの調整

  1. トリミング ナイフを削除し、標本ブロック 90 ° 右回りに回転します。
  2. 極薄のセクショニング ナイフをナイフ ステージに設定します。
  3. 試験片表面の大きい一部分を使用して互いに平行に顔を試料表面と、鋭利なエッジを調整します。
    注: シリアル断面の切断面が小さいので、特に垂直方向でのみ、この部分を使用して試料表面とナイフ エッジを調整し難いので、標本の大部分は調整に使用です。このように、標本の大部分を使用して容易に調整。

5. 試料ブロック (図 6) のネオプレン ソリューションの広がり

  1. 試料チャックを配置すると、元の位置と同じ位置でするには、チャックとミクロトームのチャック ホルダー テープを適用し、(図 6 a) 境界でカットします。
  2. 試料チャック、ミクロトームから取り出して (図 6 b) 顕微鏡の下に置きます。連続切片の取得元となる、スリムな部分を残してかみそりの刃をもつ試料の大部分を遮断します。
  3. パスツール ピペットを使用して、セクションの側面の接着剤を作るために, 使用する試料に約 1 μ L 0.5% ネオプレン ソリューション (図 6 b) をドロップします。ネオプレン ソリューション全体の標本をカバーします。試料のそばにフィルター紙の部分で余分なネオプレン ソリューションをすぐに吸収します。セクションのリボンを取得シリアル細胞の断面の写真を撮るために不可欠、ネオプレン接着剤は非常に有用なセクションを一緒に付けるため。
  4. 3 スリット グリッドの準備 (スリットのサイズ: 中間、0.4 mm x 2.2 mm、両方側面 0.2 mm × 2.2 mm) (図 6 c) 60 ° にグリッドのハンドルを曲げることによって連続切片を拾う、ため治療 0.5% ネオプレン ソリューション、グリッドとグリッドによって親水性を作るグロー放電22。

6. シリアル セクション (図 7-9) を作る

  1. 試料ブロックの場所は、によって録音された部品を整列させる 5.1 (図 6 a) と同じ位置にミクロトームのチャックします。これによりブロックの顔とナイフ エッジお互いに完全に平行。供試体の近くにナイフをもたらします。
  2. ナイフ ボートを水で埋めます。
  3. ミクロトームを気流 (図 7) を防ぐためにプラスチック製のカバーでカバーします。
    注: 問題が発生する極薄切片としばしばセクションの検索中に空気の流れ。プラスチック製のカバーは 3 つの穴: 両眼のレンズの 1 つの穴があり、他の 2 つの穴は、カバーが上にあるときに操作を許可するように腕。木製アームレストは、グリッドと連続切片の取得などの繊細な作業をしながら腕を配置するために使用されます。木製アームレストは、トームにオペレーターの手の振動を送信しないようにミクロトーム テーブル (図 7矢印) から別のテーブルに配置されます。
  4. 200 nm 厚 (図 8) で試料の切削を開始します。200 nm の厚さで設定は、供試体の表面にナイフを持って来ることで時間を節約します。
  5. 最初のセクションは、カット後切片厚を 70 に設定 nm (図 8)。
  6. 連続切片数が 20 (正確に言えば、約 1.8 mm; セクションの数のセクションの幅によって異なりますリボン到達後) に達したとき、切片厚を 10 に設定をカットしながら nm (図 8)。
    注: ミクロトームは、10 nm 厚のセクションを切り取ることはできません、ので新しいセクションが表示されない、以前の断面は、ナイフエッジ離れ離れになっています。髪の毛のペアを使用して手動でセクションを分離することの難しさを避けるために連続切片を拾うため分離されたセクション グループ (図 9) を取得することが重要です。透過型電子顕微鏡の視野は 2.0 mm なのでセクションはせいぜい 1.8 mm をする必要があります。
  7. 切片厚を 60 に設定 nm (図 8)。マシンは以前の 10 nm の厚さを追加しますので、これは 70 nm セクション (図 8) になります。
  8. 切片厚を 70 に設定 nm (図 8) 長 1.8 mm のセクションを取得するまで切断を継続。
  9. 6.6 6.8 を繰り返して 5 1.8 mm 長いセクションが (図 9) を得られます。私たちの研究室で利用できる透過型電子顕微鏡で 5 つの標本のホールダーがあるが、5 は制限されていませんので、通常 5 つのセクション グループを行います。

7. シリアル セクション (図 10-12) を拾う

  1. 'セクション保持ループ'23を配置 (ループの内径: 5.0 mm) (図 10 a) の 3 番目のセクション グループ (図 10 b)。
    注: 正しい順序で写真を撮るための区分の順序でセクションを取得するために必要です。ただし、ナイフ ボートに 5 つのセクション グループがある、のでそれしばしば取得混乱しているグループが。ループを 3 番目のグループに配置することによって、オペレーターの近くに 2 つのグループは、明らかになればオペレーターから遠い 2、2 番目の最初と 4 番目と 5 番目のグループ (図 10 b)。これは順序を混合を防ぐ。
  2. '水表面調達ループ'23を配置 (WSRL、ループの内部の直径: 4.0 mm) (図 11 a) ナイフ ステージ (図 11 b)。WSRL は、底に磁石を備えているためナイフ舞台にしっかりと立つが。
    1. 連続切片のすぐ上のシャフトとのハンドルを移動することによって、WSRL のループを配置します。ループ セクションを取り囲むように水面の上に WSRL のループを下げます。
    2. 水の表面が表面張力 (図 11 c d) によって発生するので下ネジを回してループを押し下げます。ループの中央セクションに移動、水の頂点に位置、髪のストランド21を使用して、断面の方向を調整します。
    3. 裸スリット-グリッド、ピンセットによる開催は、水の表面 (図 11 d) に平行に触れることにより、セクション グループを拾います。セクション最初に、グリッドに触れることがなく、水 (図 11 d) のグリッドの中央に正確にセクションを配置するが重要です。
  3. ホルムバール サポート フィルム16 (図 12)、水の小さなドロップと一緒にセクションでグリッドを配置し、ろ紙を使用して余分な水分を削除します。
    注: 支持膜のしわは、しばしば問題のセクションは、膜 (セクション) は、直接膜 (フィルム) を触れるので支持フィルムとグリッドを使用してピックアップです。サポート フィルムのしわを取得の問題がホルムバール サポート フィルム16水の小さなドロップと一緒にセクション軸受グリッドを配置することによって削減します。

8. 染色のセクション16,24 (図 13)

  1. セクションが完全に乾いたら、グリッド、周りからホルムバール フィルムを引き裂くし、セクションを軸受グリッドを削除します。
  2. 適切な順序 (図 13) で染色チューブ16の溝にグリッドを設定し、ウラニル酢酸および鉛のクエン酸のための24のセクションを染色します。
    注: ある溝深さ 0.6 mm 管の長軸に沿ってかみそりの刃でカットします。チューブは16染色、洗浄プロセスの間にグリッドへ直接な取り扱いは必要ありませんので、ピンセットを使用する場合にサポート フィルムの破損事故を防止するために役立ちます。

9. シリアル セクション (図 14) の観察

  1. 試料ホルダーの軸に垂直なグリッド スリットの長軸を方向づけるマルチ ホルダー (図 14 a)、適切な順番で 5 グリッドを設定します。'グリッド フィクサー' はハンドルを触れないので、カットがグリッドのハンドル (矢印) にはありません。
  2. ' グリッド fixers' (図 14 b) のグリッドを修正し、透過型電子顕微鏡試料ホルダーに挿入します。
    注: それターゲット細胞の写真を撮影する前にすべてのセル セクション (図 15) 汚染なしと良好な固定性、良好な状態で興味深い微生物や細胞を見つけるための低倍率の画像を撮影する便利です。
  3. 高倍率でのすべてのセルのセクションで標的細胞の写真を撮る。

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結果

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このプロトコルでは、3 スリット格子は連続切片を拾うために使用されていました。グリッドは、ニッケルや銅の作られています。連続切片は、真ん中のスリットに配置されます。両側スリットは、グリッドとそれらを拾うときにセクションを表示する必要があります。グリッド連続切片と平行するときしてピンセット (図 11 d) でそれらを拾い、ハンドルが曲がっている (図 6 c右)。小さなハンドルはセクションを拾いに深刻な問題が発生したグリッドの主要な部分の曲げを防ぐために、染色中にセクションを落下防止に便利です。このグリッドには、従来 2.0 mm × 1.0 mm シングル ホール グリッド上の利点があります。すなわち、セクションは 2 つの金属バー 0.4 mm 間隔で直接サポートされます (1.0 mm より狭くする)、ホルムバール サポート フィルム 3 スリット グリッド、間のセクションは、従来単孔グリッドの支持フィルムでのみサポートされます。3 スリット格子を...

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ディスカッション

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ここで紹介した方法は、高価な機器を必要としません。染色管 (図 13)、水表面を上げるループ (図 11 a)、ループ セクションを保持 (図 10 a) 3 スリット グリッド (図 6 c) アルミ ラック (図 3) のみが必要です。現在のメソッドの多くの機能があります。標本の大部分は、互いに平行に顔を試料の表面とナイフのエッジを調整する使用されます。連続切片は、グループのスリット グリッド上にシリアル セクションのグループを取得するときに髪の毛のペアを使用して分離のセクションで困難を避けるためにカットされています。セクション グループの順序との混同を避けるために「セクション保持ループ」を使用。'水表面調達ループ' を使用して、セクション、水の頂点に配置され、グリッド上の目的の位置に配置するためのグリッドを最初、タッチを確認します。アル...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々 は心から彼の貴重な提案や議論の茂雄北をありがちましょう。我々 はまた原稿の彼らの重要な読書のジョンとすみれエクスタインをありがちましょう。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Formvar 作製装置日新EM株式会社, 東京652W 180 x D 180 x H 300 mm
スライドガラス松波 (株), 大阪-76 x 26 x 1.3 mm
穴あけアルミラック(株) 日新EM株式会社, 東京658W 30 x D 25 x H 3 mm (
実体顕微鏡ニコン株式会社, 東京-SMZ 645
実体顕微鏡用LED照明ニコン株式会社,Tokyo-SM-LW 61 Ji
トリミングステージサンマグ Co.Ltd, 東京-チルト機構搭載, トリミング
ステージ用LED照明サンマグ Co.Ltd., 東京-この論文参照
超音波トリミングブレード日新EM株式会社, 東京5240EM-240、この紙
ダイアトム株式会社、スイス-45°をトリミングするためのダイヤモンドナイフ
極薄切片用ダイヤモンドナイフDiatome Co. Ltd.、スイス-45°
ウルトラミクロトームライカマイクロシステムズ, ウィーン-ウルトラカット S
メサカットライカマイクロシステムズ, ウィーン-ミラー
0.5% ネオプレン W溶液日新EM株式会社, 東京605
特殊3スリットニッケルグリッド日新EM株式会社, 東京2458この論文参照
特別3スリット銅グリッド日新EM株式会社, 東京2459この論文を参照してください
切片保持ループ日新EM株式会社, 東京526この論文を参照してください
水面上昇ループ日新EM株式会社, 東京527この論文を参照してください
染色管日新EM株式会社, 東京463この論文を参照してください
マルチ試料ホルダー日本電子株式会社, 東京-EM-11170
JEM-1400日本電子(株) 東京-透過型電子顕微鏡
株) 本論文参照 を参照してください 。

参考文献

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