ここでは、TIP60 枯渇 MCF10A 乳房の上皮細胞を用いた創傷治癒のアッセイで細胞遊走のリアルタイム モニタ リングを提案します。生細胞イメージング プロトコルの実装を分析し、リアルタイムの時間の単一細胞運動を可視化することができます。
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この記事について
サマリー
要約
創傷治癒の試金は効率的な細胞移行の培養を研究する最も経済的な方法の一つ。従来、画像は位相差顕微鏡を用いた実験の前後に撮影が、傷の閉鎖によって細胞の移行の能力が評価されます。ただし、細胞運動は動的な現象を単一セルの動きを追跡するため、従来の方法を指定することはできません。現在の創傷治癒のアッセイを向上させるため、生細胞イメージング技術を使用して、リアルタイムで細胞の移動を監視します。このメソッドは、追跡システムのセルに基づいてセル移行レートを決定することができます、細胞遊走と細胞増殖との間の明確な区別を提供します。ここでは、我々 は TIP60 の存在によって影響を受ける乳房の上皮細胞のさまざまな移行能力を研究するためのアッセイの創傷治癒の生きているセルイメージ投射の使用を示します。細胞の運動性は非常にダイナミックな私たちのメソッドは創傷創傷閉鎖創傷治癒の試金のためのイメージングの伝統の技術で撮影したスナップショットよりも治癒のプロセスに洞察力を提供します。
概要
HIV Tat インタラクティブ蛋白質 60 kDa (TIP60) はヒストンと非ヒストン蛋白質1,2の両方ことができる従ってリジン アセチルトランスフェラーゼです。その機能は転写、DNA 損傷修復、およびアポトーシス1,3,4,5,6,を含む複数のシグナル伝達経路に影響があることが判明します。7,8しますさらに、TIP60 はしばしば癌のダウンレギュ レートのダウンレギュレーションがん転移と相関していると貧しい人々 の生存率は9、10、11,12、。
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プロトコル
1. 準備
- MCF10A 培養液の準備: ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) F12 (1:1) 5% 馬の血清、20 ng/mL 上皮成長因子、0.5 mg/mL ヒドロコルチゾン、100 ng/mL コレラ毒素、10 μ g/mL インスリン/。
- 無血清培地の準備: 20 ng/mL 上皮成長因子、0.5 mg/mL ヒドロコルチゾン、100 ng/mL コレラ毒素と 10 μ g/ml インスリン DMEM/f12 キー (1:1)。
- 次の siRNA シーケンスを使用します。
siControl:
フォワード: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
逆: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
siTIP60:
フォワード: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
逆: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3' - 10 cm の細胞培養皿および 24 ウェルのプレートを使用します。
2. 一時的な枯渇 TIP60 による siRNA の
- 1 日目、トランスフェクション試薬 (例えば、 Lipofectamine RNAiMAX) の 15 μ L 分注、2 mL の血清媒体 (例えば、オプティ MEM) ....
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結果
生細胞イメージングに基づく細胞移行試験の一般的なスキーマ
図 1 aは、このプロトコルのスキーマです。典型的な上皮形態を示した siControl MCF10A セルをトランスフェクトしました。TIP60 の枯渇後、MCF10A 細胞いたより間葉系細胞 (図 1 b) と比較しています。
TIP60 ノックダウン効率の検討
TIP60 ノックダウン効率を図 2に示します。TIP60 発現レベルは siTIP60 治療後大幅に減少しました。TIP60、ほかのいくつかの細胞の移行関連タンパク質の式でしたも検査された20。たとえば、上皮性マーカーである上皮.......
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ディスカッション
細胞移動の過程で細胞は付着性シートの形でどちらかの移動ことができます知られています。ゆるい房;または、隔離された単一のセルです。モードと細胞浸潤の動的することができます 1 つの条件ごとに異なると表現型が時間内で変更できます。伝統的な創傷治癒のアッセイは、12 または 24 h など、長い時間間隔と顕微鏡から撮影したスナップショット画像に基づいています。傷の閉鎖のダイナミックと細胞運動のパターンをキャプチャするは困難します。
その一方で、生細胞イメージング システムは細胞遊走はるかに短い間隔 (30 分または 1 時間) と手動で撮影した画像の実現されていない、正確に同じ位置を監視します。システムは自動化されており、研究者が実験の終わりにデータをエクスポートするだけ必要があります。これは細胞運動のパターンとリアルタイムでの創傷閉鎖のプロセスを監視することが可能になります。本研究では定量的アッセイの創傷治癒の生細胞イメージング システムの組み込むことでコントロールまたは TIP60 枯渇細胞の創傷閉鎖のプロセスと同様に、動的な細胞運動のキャプチャで。生細胞イメージング システムを使用.......
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開示事項
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
謝辞
私たちは彼らの役に立つ議論とコメントの Jha 研究室のメンバーに感謝します。スバールバルヤンマイエン島がん科学研究所シンガポール (R-713-006-014-271)、国立医学国立研究財団にシンガポール、シンガポールの教育省卓越性イニシアチブの各研究センターの下からの補助金に支えられ研究協議会 (CBRG 遺伝研;BNIG11nov001 と CS-IRG;R-713-000-162-511)、文部省学術研究基金 (萌え AcRF 層 1 T1 2012 10 月 -04)。Y.Z.、G.S.C.、および C.Y.T. は、がん科学研究所のシンガポール、シンガポールの国立大学によって授与卒業後奨学金によって支えられました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| MCF10A細胞 | ATCC | CRL-10317TM | 乳房上皮細胞 |
| DMEM/F12培地 (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A 培養培地 |
| 上皮成長因子 (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | MCF10A 培養培地用サプリメント |
| コレラ毒素 | Sigma-Aldrich | C-8052 | MCF10A用培地 |
| 用サプリメントヒドロコルチゾン | Sigma-Aldrich | H-0888 | MCF10A培地用サプリメント |
| インスリン | Sigma-Aldrich | I-1882 | MCF10A用サプリメント |
| ハウス血清 | Gibco | 16050-122 | MCF10A用サプリメント |
| トリプシン | Gibco | 25200-056 | MCF10A用 |
| プレートから取り外す 血球計算盤 | フィッシャーサイエンティフィック | 267110 | 細胞のカウント用 |
| Opti-MEM 還元血清培地 | Gibco | 31985-070 | siRNA混合物用 |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | トランスフェクト試薬 |
| Trizol 試薬 | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | mRNA抽出用 |
| iScript cDNA 合成キット | Bio-Rad | 170-8891 | cDNA用世代 |
| iTaq ユニバーサル SYBR グリーン スーパーミックス | バイオ・ラッド | 172-5125 | リアルタイム qPCR |
| 7500 高速リアルタイム PCR システム | バイオシステム | リアルタイム qPCR メカイン | |
| 10 cm ディッシュ | グライナー バイオワン | 664160 | ノックダウン実験用 |
| 24 ウェルプレート | セルスター | 662160 | 創傷治癒アッセイ |
| siControl siRNA | 自己設計 | 自己設計 | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | 自己設計 | 自己設計 | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| ライブセルオブザーバー | ツァイ | 逆セルオブザーバー 生細胞実験用 |
参考文献
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).
- Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B.
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再版と許可
