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方法論記事

ゼブラフィッシュの再生モデルと網膜変性のレーザー誘起のミュラー グリア細胞の活性化

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DOI：

10.3791/56249

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2017年10月27日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University Hospital of Bern, University of Bern, 2Department of Clinical Research, University of Bern, 3Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

この記事について

サマリー

ゼブラフィッシュは、脊椎動物の網膜変性・再生のメカニズムを勉強する人気動物モデルです。このプロトコルでは、ローカライズされた外傷の内側の網膜に最小の被害で網膜の外側を中断することを誘導する方法について説明します。その後、我々 は生体内で網膜の形態と網膜再生を通してミュラー グリア細胞応答監視します。

要約

硬骨魚と哺乳類の魅惑的な違いは、魚類の網膜網膜神経新生と重度の損傷後の再生のための生涯の可能性です。ゼブラフィッシュにおける再生経路の調査は哺乳類の網膜変性疾患の治療のための革新的な戦略を開発する新しい洞察力をもたらす可能性があります。ここで、532 nm ダイオード レーザーによる大人のゼブラフィッシュの網膜の外側に病巣の誘導に注力しました。ローカライズされた損傷は、網膜変性・損傷の領域で直接再生時起こる生物学的プロセスを調査できます。我々 は、破損した領域とモニター以降再生の場所を定義するができた非侵襲的光コヒーレンストモグラフィ (OCT) を使用して、体内。確かに、OCT イメージングは、組織学的分析でだけ以前利用可能だった情報を提供するゼブラフィッシュ網膜の断面、高解像度の画像を生成します。組織切片を行ったリアルタイム 10 月からデータを確認するために、免疫組織化学による網膜損傷の誘導後の再生の応答を調べた。

概要

ビジョンは、おそらく人間の最も本質的な意味とその損傷が高い社会経済的影響。工業化された世界で網膜変性疾患は視力低下や失明成人人口の1間の大半を占めています。網膜色素変性症 (RP) は、約 150 万人世界2,3に影響を与える 60、および 20 の年齢間の人々 の失明の最も一般的な継承された原因です。遺伝性網膜疾患網膜色素上皮細胞と、その後神経膠症の変性が続くし、内部のニューロン4の改造 (PRs) 光受容細胞の進歩的な損失によって特徴付けられる異種族です。病気のコースは、通常、薄暗い光と色検査および視力5に欠かせないコーンで明暗視に責任がある棒で開始 2 つの PR セル型の増分の損失によって説明できます。単一の遺伝子異常は、RP を引き起こすのに十分です。これまでのところ以上 130 以上 45 遺伝子変異は6疾患に関連付けられています。これは、さまざまな疾患の表現型につながる、遺伝子療法は非汎化可能な理由の 1 つ、従って複雑な治療アプローチ。したがって、まばゆいばかりの疾患で網膜変性を治療する新しい一般的な治療方法を開発する急務があります。

しばしば網膜変性を含む PR 損失;そのため、PR 細胞死、7網膜の変性プロセスの特徴です。すでに、広報細胞死がミュラー グリア細胞 (MC) 活性化と増殖8を刺激することが実証されています。MCs、脊椎動物の網膜では、主要なグリア細胞型が網膜ニューロン間「接着剤」以外の何物であると考えた。近年、多くの研究は、MCs 行動以上の単なる構造は9をサポートすることを示しています。別の関数に MCs は神経新生にも関与し、10を修復します。確かに、変性網膜から拡散性因子に応答して、MCs は大幅、グリア線維性酸性蛋白 (GFAP) 表現を高めます。したがって、GFAP のラベリングは、網膜損傷し変性11二次応答として MC 活性化のマーカーとして使用できます。

最近では、(動脈分布) ゼブラフィッシュの網膜変性を誘発するレーザーを用いた焦点損傷のグラフィックノベルの適応を開発しました。焦点の損傷は、損傷部位に細胞の移動と網膜再生12中に行われるイベントの正確なタイミングなど特定の生物学的過程を研究するため有利です。さらに、ゼブラフィッシュは、その視覚システムと他の脊椎動物との間の類似性のため視覚研究で重要になりました。人間と魚類の網膜の総の形態学的および組織学的特徴は、いくつかの違いを表示します。人間とゼブラフィッシュの網膜が網膜投射神経細胞、神経節細胞は内側に存在しながら、光を感じる視細胞が最も外側の層を占める同じ層状パターンで構成されて同じの主要な細胞クラスを含むしたがって、レンズに近位の神経層。網膜の介在神経細胞、アマクリン細胞、バイポーラ、水平細胞の光受容細胞と神経節細胞層13の間にローカライズします。さらに、ゼブラフィッシュの網膜はコーンを支配し、したがってより、集中的に調査の齧歯動物の網膜など、人間の網膜に近い。硬骨魚と哺乳類の魅惑的な違いは、魚網膜と損傷後の網膜の再生に永続的な神経です。ゼブラフィッシュ、MCs が脱分化し、負傷した網膜14,15再生を仲介できます。鶏肉, MCs 脱分化して細胞周期を再入力にもいくつかの容量があります。成魚で網膜外傷後に MCs は前駆細胞および幹細胞の特定の特性を採用する、損傷した網膜組織に移行し、新しいニューロン16を生成します。網膜前駆細胞に予期しない類似点を明らかに哺乳類の MCs の遺伝子発現プロファイリングとチキン、齧歯動物、人間の網膜で MCs の組み込み神経因性潜在性のための証拠は17に成長しています。それにもかかわらず、鳥類や哺乳類の再生応答は魚で頑健な応答とに比べて低い理由はまだ分かっていません。したがって、ゼブラフィッシュの内因性の修復メカニズムを理解することは、哺乳類と人間の刺激的な網膜再生のための戦略を提案するかもしれない。網膜変性症患者の治療のため治療のツールとしては、MCs の内因性修復機構を採用私たちの社会の顕著な影響を与えるでしょう。

本明細書では、眼科研究の変性・再生モデルを採用するための手順を提供します。我々 はまず損傷部位と隣接する MCs の最後に可視化の関与を開発イベントのイメージングで、麻痺の網膜で焦点の損傷を誘発するのに焦点を当てた。一般的なプロトコルは、比較的簡単に行うさまざまな網膜をその後評価のための可能性を開きます。

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プロトコル

すべての実験眼科・視覚・眼科 (ARVO) 研究会のビジョン研究の動物の使用のための声明を遵守し、政府当局の関係法規を尊重します

。

1 です動物

  1. 維持 TgBAC (gfap:gfap-GFP) ゼブラフィッシュ 167 (AB) ひずみが 26.5 ° C の温度の水の標準的な条件下での 6-9 ヶ月と 14/10 h/明暗サイクル 18 歳です。
    2. 。
  2. 政府当局による承認後動物実験関係機関の動物のケアのガイドラインに従ってください
    3. 。

2。リバーシブルの全身麻酔

  1. 97.9 mL タンクの水と 1 M トリスの 2.1 mL tricaine 粉の 400 mg を溶解することによりエチル 3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩 (tricaine) の貯蔵液の準備緩衝生理食塩水 (TBS)。暗い 1 ヶ月までに 4 ° C で 1 M トリス (pH 9) とストア Ph7.0 に調整
    。 注: Tricaine は、動物の自然な生活条件のような水で準備されるべき、できれば元の水槽の水を使用必要があります
    2. 。
  2. 、原液 1:25 を水槽の水で希釈してすぐにします
    3. 。
  3. 10 cm シャーレまで不動なり外部刺激 (約 2-5 分、体重、年齢によって) に応答しない麻酔溶液 50 mL を含むにゼブラフィッシュを配置します
    4. 。
  4. はレーザー治療 ( 図 1 a) のためのカスタムメイドのシリコン pin ホルダーにそれぞれの魚を手で転送します
    。 注意!魚は麻酔まで 10 分だけタンクの外側に残ることができる
    5. 。
  5. 逆に麻酔は治療および/またはイメージング後、タンクの水を含むコンテナーにゼブラフィッシュを配置します
    6. 。
  6. 回復をサポートする顔の上の新鮮なタンクの水の流れを水にゼブラフィッシュを移動することによって作成します
    7. 。

3。網膜に焦点の傷害をレーザー

注: ゼブラフィッシュの網膜に焦点の光損傷を作成する A 532 nm ダイオード レーザーを使用します。レーザーの実験の設定により大人のゼブラフィッシュで再現可能な焦点網膜傷害を確立

。 レーザーの出力を設定する
  1. : 70 mW; 空中直径: 50 μ m; パルス持続時間: 100 さん
    注意!エリアの分類および適切な個人用保護具、レーザー光の使用が必要です
    2. 。
  2. 局所的に治療前に目で 2% ヒドロキシプロピルメチル セルロースの 1 〜 2 滴を適用し、2.0 mm 眼底レーザー レンズを使用して焦点を網膜にレーザー照準ビーム
    。 注意!ヒドロキシプロピルメチル セルロース滴は粘性、鰓に行く場合を呼吸に問題を引き起こす可能性があります
    3. 。
  3. 左の視神経乳頭周囲の場所 4 レーザー スポット目し、内部統制として、未処理の目を使用します
    4. 。

4。生体内で網膜の形態のイメージング

  1. 0 日に、ゼブラフィッシュの網膜レーザー誘導後に直接麻酔からそれらを復活することがなく視覚化します。他のすべての時間ポイントを用いる全身麻酔 (セクション 2 を参照してください: リバーシブルの全身麻酔)。( 図 1 B、B.1) カスタムメイドのシリコン pin ホルダーに固定されたゼブラフィッシュを配置します
    2. 。 最適な画像を得るための
  2. カット ゼブラフィッシュ眼に合わせて市販のハイドロゲル コンタクト レンズ (Ø 5.2 mm、r = = 2.70 mm、中央の厚さ = 0.4 mm) による穴パンチ。セルロースとレンズの凹面を埋めるし、角膜の上に置きます
    3. 。
  3. 78 D の非接触スリット ランプ レンズと OCT システムを装備します
    4. 。
  4. フォーカス ir 赤外線 (IR) イメージ + 10 月モード ( 図 2 a) 眼の眼底を視覚化し、IR の写真をクリックして、" 取得 " ボタン ( 図 2 b) をローカライズするのにはレーザー システムを使用して網膜上のスポット ' s ソフトウェア
    5. 。
  5. IR + OCT 網膜層部の三次元視覚化モードをクリックして写真を取るし、" 取得 " ボタン ( 図 2 b)。外の核層 (ONL) で損傷の重傷度を観察 (セクション 3 を参照してください: レーザー網膜に焦点の傷害) これらのイメージに
    6. 。
  6. 治療および/または画像はタンクの水を含むコンテナーに、ゼブラフィッシュを配置後、麻酔を逆にします
    7. 。
  7. 回復をサポートする顔の上の新鮮なタンクの水の流れを水にゼブラフィッシュを移動することによって作成します
    8. 。
  8. 網膜形態の似たような 生体内 イメージングを実行日 1、3、7、14、6 週目
    9. 。

5。ヘマトキシリン & エオシン (H & E) 染色

  1. 冷 (4 ° C) に水没によるゼブラフィッシュを安楽死させる氷少なくとも 10 分のため、摘出に麻酔ソリューション目すぐににより小さいカーブタイプ鉗子
    2. 。
  2. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 20 h 4 ° C で 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の全体の目の修正し、傾斜アルコール シリーズのサンプルを脱水 (キシレン 5 分二度 100%、エタノール 100 %5 分間 2 回、3 分 2 回エタノール 96%、エタノール 70 %3 min 回).
    注意!PFA は、目、鼻、および上部の呼吸の経路を刺激することができます。PFA は、既知のひと発癌物質と疑われる生殖危険
    3. 。
  3. パラフィン サンプルを埋め込む、視神経乳頭のレベルで 5 μ m のセクションをカット、スライド ガラスにそれらをマウントします
    4. 。
  4. 5 分 0.1% 酸ヘマトキシリン液と deparaffinized のセクションを染色し、塩酸ミックスでスライドを浸漬した後、蒸留水で 2 回スライドをディップ (2 mL 25 %250 mL に塩酸蒸留水) とミックス (250 mL の 2 mL 25% アンモニア アンモニア蒸留水)。ヘマトキシリンで少なくとも 10 分間水道水で染色の開発後エオシン G 水溶液 0.5 %3 分のセクションを染色
  5. アクリル樹脂取付中の脱水のスライドをマウントし、光学顕微鏡下でスライドを観察
    6. 。

6。MC の活性化のための免疫組織化学

  1. 抗原検索バッファー (トリス EDTA + 0.05% 非イオン性洗剤、pH 9.0) 適切な蒸し器または電子レンジ 10-15 分で 3 分間の deparaffinized セクションを熱し、洗って 3 回 TBS 5各分
    2. 。
  2. サークルであるシリコーン セクション ペンし、100 μ L を追加ブロック 1 における室温でのソリューション (TBS + 10% ヤギ血清 + 1% ウシ血清アルブミン、pH 7.6)
  3. 染色抗グリア線維性酸性蛋白 (GFAP) ウサギ ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体抗グルタミン合成酵素 (GS)、1: 200 希釈 (1 サンプルあたり 40 μ L) の両方。4 ° C で加湿チャンバー内でスライドを一晩インキュベートします。TBS + 0.1% で 3 回洗って 5 分トゥイーン 20
    4. 。
  4. 適切な仕上げ可視化二次抗体。このプロトコルは使用ヤギ抗うさぎ IgG H & GFAP とヤギ抗マウス IgG H L 緑二次抗体 & L 両方 1 時間室温で 1: 500 希釈で GS の明るい赤
  5. 取付培 DAPI でスライドをマウントし、蛍光顕微鏡下でスライドを観察
    6. 。

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結果

リアルタイム 10 月: ゼブラフィッシュの網膜の損傷のよく線引きゾーンを誘導レーザー損傷モデルを用いて網膜の修復における MCs の役割を分析するために。(0 日) 損傷 (図 3) 60 分以内の初めて生体内でOCT による損傷のサイトをイメージしました。魚の眼の光学系を補うためにカスタムメイドのコンタクト レンズは、角膜に置かれました。レーザー治療後すぐに拡散ハイパー反射信号は網膜の外側 (矢印) にローカライズされました。それは網膜色素上皮 (RPE) から (OPL) 外網状層に拡張。同じような信号は、1 日目も検出可能。3 日後この拡散信号はより組織的かつ高密度になった。それは一貫して視細胞層に拡張する外核層 (ONL) で見られました。次の最初の 1 週間 (7 日)、平均の病巣の大きさの大幅な減少があったし、だけ小さな超反射信号が検出されました。最新時点調査 (週 6) まで、14 日目から始まって、レーザー スポット IR および OCT の画...

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ディスカッション

ゼブラフィッシュの網膜再生/変性は、毒素による細胞死22、機械的損傷23、熱傷24などさまざまなアプローチが検討されています。ゼブラフィッシュの網膜を損傷する 532 nm ダイオード レーザーを採用しました。これにより、我々 のモデルは、いくつかの利点を提供しています。例えば、我々 は急速に PRs 層の具体的には、網膜の外側におけるローカライズの損傷の明確に定義されたエリアを作成しました。さらに、この実験のセットアップは、脈絡膜血管新生を誘導するブルッフ膜の損傷によって、たとえば、他の生物学的過程を研究への損傷の大きな領域を生成する変更できます。最小限の巻き添え被害があるし、正確かつ再現性をもって再生応答のタイミングを変調することができます。

表現型の変化を時間の経過に従って、ハイデルベルク Spectralis システムおよびハイデルベルク目エクスプ ローラー ソフトウェアを採用しました。したがって、眼底 IR イメージング ゼブラフ...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

彼女の優秀な技術的な支援のモデルとデリカ Bisignani の確立で彼女の科学的な入力をマーティン ツィンカーナーゲル、MD、PhD、ミリアム Reisenhofer、PhD を感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
酸性ヘマトキシリン溶液Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland2852
AlbuminSigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandA07030
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland5470
Dako PenDako, Glostrup, DanmarkS2002
DAPIマウントメディウムVector Labs, Burlingame, CA, USAH-1200
Eosin G 水溶液 0.5%Carl Roth, Arlesheim, SwitzerlandX883.2
EthanolSigma-Aldrich, Buchs, Switzerland2860
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)Sigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandED
EukittSigma-Aldrich, Buchs, Switzerland3989
ヤギ抗ウサギIgG H&L アレクサ フルオラ®488Life Technologies, Zug, SwitzerlandA11008
ヤギ抗マウスIgG H&L アレクサ フルオラ®594Life Technologies、ツーク、スイスA11020
ヤギの正常な血清Dako、Glostrup、デンマークX0907
ハイドロゲル コンタクト レンズジョンソン &Johnson AG, Zug, Switzerlandn.a.1-DayAcuvue Moist
Hydroxypropylmethylcellulose 2%OmniVision, Neuhausen, Switzerlandn.a.Methocel 2%
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonateSigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandA5040Tricaine, MS-222
Visulas 532sCarl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germanyn.a.532nm laser
Mouse抗GSモノクローナル抗体Millipore, Billerica, MA, USAMAB302
HRA + OCT Imaging SystemHeidelberg Engineering, Heidelberg, Germanyn.a.Spectralis
Heidelberg Eye ExplorerHeidelberg Engineering, Heidelberg, Germanyn.a.Version1.9.10.0
パラホルムアルデヒド (PFA)Sigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandP5368
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)Sigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandP5368
Rabbit anti-GFAP polyclonal antibodyInvitrogen, Waltham, MA, USA180063
シリコンピンホルダーHuco Vision AG Switzerlandn.a.滅菌トレイのシリコンピンマットから手でカットします。
スリットランプ BM900Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerlandn.a.Slit
lamp adapterIridex Corp., Mountain View, CA, USAn.a.Superfrost
Plus glass slidesGehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany10149870 TgBAC
(gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strainKIT, Karlsruhe, Germany15204http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3
Tris buffered saline (TBS)Sigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandP5912
Tween 20Sigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandP1379
78D 非接触スリットランプレンズVolk Optical, Mentor, OH, USAV78C
XyleneSigma-Aldrich, Buchs, Switzerland534056
Ocular Fundus laser lensOcular Instruments, Bellevue, WA, USAOFA2-0
2100 RetrieverAptum Biologics Ltd., Southampton, United KingdomR2100-EUスチーマー

参考文献

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