ゼブラフィッシュの再生モデルと網膜変性のレーザー誘起のミュラー グリア細胞の活性化

ビジョンは、おそらく人間の最も本質的な意味とその損傷が高い社会経済的影響。工業化された世界で網膜変性疾患は視力低下や失明成人人口の¹間の大半を占めています。網膜色素変性症 (RP) は、約 150 万人世界^2,3に影響を与える 60、および 20 の年齢間の人々 の失明の最も一般的な継承された原因です。遺伝性網膜疾患網膜色素上皮細胞と、その後神経膠症の変性が続くし、内部のニューロン⁴の改造 (PRs) 光受容細胞の進歩的な損失によって特徴付けられる異種族です。病気のコースは、通常、薄暗い光と色検査および視力⁵に欠かせないコーンで明暗視に責任がある棒で開始 2 つの PR セル型の増分の損失によって説明できます。単一の遺伝子異常は、RP を引き起こすのに十分です。これまでのところ以上 130 以上 45 遺伝子変異は⁶疾患に関連付けられています。これは、さまざまな疾患の表現型につながる、遺伝子療法は非汎化可能な理由の 1 つ、従って複雑な治療アプローチ。したがって、まばゆいばかりの疾患で網膜変性を治療する新しい一般的な治療方法を開発する急務があります。

しばしば網膜変性を含む PR 損失;そのため、PR 細胞死、⁷網膜の変性プロセスの特徴です。すでに、広報細胞死がミュラー グリア細胞 (MC) 活性化と増殖⁸を刺激することが実証されています。MCs、脊椎動物の網膜では、主要なグリア細胞型が網膜ニューロン間「接着剤」以外の何物であると考えた。近年、多くの研究は、MCs 行動以上の単なる構造は⁹をサポートすることを示しています。別の関数に MCs は神経新生にも関与し、¹⁰を修復します。確かに、変性網膜から拡散性因子に応答して、MCs は大幅、グリア線維性酸性蛋白 (GFAP) 表現を高めます。したがって、GFAP のラベリングは、網膜損傷し変性¹¹二次応答として MC 活性化のマーカーとして使用できます。

最近では、(動脈分布) ゼブラフィッシュの網膜変性を誘発するレーザーを用いた焦点損傷のグラフィックノベルの適応を開発しました。焦点の損傷は、損傷部位に細胞の移動と網膜再生¹²中に行われるイベントの正確なタイミングなど特定の生物学的過程を研究するため有利です。さらに、ゼブラフィッシュは、その視覚システムと他の脊椎動物との間の類似性のため視覚研究で重要になりました。人間と魚類の網膜の総の形態学的および組織学的特徴は、いくつかの違いを表示します。人間とゼブラフィッシュの網膜が網膜投射神経細胞、神経節細胞は内側に存在しながら、光を感じる視細胞が最も外側の層を占める同じ層状パターンで構成されて同じの主要な細胞クラスを含むしたがって、レンズに近位の神経層。網膜の介在神経細胞、アマクリン細胞、バイポーラ、水平細胞の光受容細胞と神経節細胞層¹³の間にローカライズします。さらに、ゼブラフィッシュの網膜はコーンを支配し、したがってより、集中的に調査の齧歯動物の網膜など、人間の網膜に近い。硬骨魚と哺乳類の魅惑的な違いは、魚網膜と損傷後の網膜の再生に永続的な神経です。ゼブラフィッシュ、MCs が脱分化し、負傷した網膜^14,15再生を仲介できます。鶏肉, MCs 脱分化して細胞周期を再入力にもいくつかの容量があります。成魚で網膜外傷後に MCs は前駆細胞および幹細胞の特定の特性を採用する、損傷した網膜組織に移行し、新しいニューロン¹⁶を生成します。網膜前駆細胞に予期しない類似点を明らかに哺乳類の MCs の遺伝子発現プロファイリングとチキン、齧歯動物、人間の網膜で MCs の組み込み神経因性潜在性のための証拠は¹⁷に成長しています。それにもかかわらず、鳥類や哺乳類の再生応答は魚で頑健な応答とに比べて低い理由はまだ分かっていません。したがって、ゼブラフィッシュの内因性の修復メカニズムを理解することは、哺乳類と人間の刺激的な網膜再生のための戦略を提案するかもしれない。網膜変性症患者の治療のため治療のツールとしては、MCs の内因性修復機構を採用私たちの社会の顕著な影響を与えるでしょう。

本明細書では、眼科研究の変性・再生モデルを採用するための手順を提供します。我々 はまず損傷部位と隣接する MCs の最後に可視化の関与を開発イベントのイメージングで、麻痺の網膜で焦点の損傷を誘発するのに焦点を当てた。一般的なプロトコルは、比較的簡単に行うさまざまな網膜をその後評価のための可能性を開きます。

すべての実験眼科・視覚・眼科 (ARVO) 研究会のビジョン研究の動物の使用のための声明を遵守し、政府当局の関係法規を尊重します

1 です動物

1. 維持 TgBAC (gfap:gfap-GFP) ゼブラフィッシュ 167 (AB) ひずみが 26.5 ° C の温度の水の標準的な条件下での 6-9 ヶ月と 14/10 h/明暗サイクル ¹⁸ 歳です。
。
2. 政府当局による承認後動物実験関係機関の動物のケアのガイドラインに従ってください
。

2。リバーシブルの全身麻酔

1. 97.9 mL タンクの水と 1 M トリスの 2.1 mL tricaine 粉の 400 mg を溶解することによりエチル 3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩 (tricaine) の貯蔵液の準備緩衝生理食塩水 (TBS)。暗い 1 ヶ月までに 4 ° C で 1 M トリス (pH 9) とストア Ph7.0 に調整
   。 注: Tricaine は、動物の自然な生活条件のような水で準備されるべき、できれば元の水槽の水を使用必要があります
。
2. 、原液 1:25 を水槽の水で希釈してすぐにします
。
3. 10 cm シャーレまで不動なり外部刺激 (約 2-5 分、体重、年齢によって) に応答しない麻酔溶液 50 mL を含むにゼブラフィッシュを配置します
。
4. はレーザー治療 ( 図 1 a) のためのカスタムメイドのシリコン pin ホルダーにそれぞれの魚を手で転送します
   。 注意!魚は麻酔まで 10 分だけタンクの外側に残ることができる
。
5. 逆に麻酔は治療および/またはイメージング後、タンクの水を含むコンテナーにゼブラフィッシュを配置します
。
6. 回復をサポートする顔の上の新鮮なタンクの水の流れを水にゼブラフィッシュを移動することによって作成します
。

3。網膜に焦点の傷害をレーザー

注: ゼブラフィッシュの網膜に焦点の光損傷を作成する A 532 nm ダイオード レーザーを使用します。レーザーの実験の設定により大人のゼブラフィッシュで再現可能な焦点網膜傷害を確立

1. : 70 mW; 空中直径: 50 μ m; パルス持続時間: 100 さん
   注意!エリアの分類および適切な個人用保護具、レーザー光の使用が必要です
。
2. 局所的に治療前に目で 2% ヒドロキシプロピルメチル セルロースの 1 〜 2 滴を適用し、2.0 mm 眼底レーザー レンズを使用して焦点を網膜にレーザー照準ビーム
   。 注意!ヒドロキシプロピルメチル セルロース滴は粘性、鰓に行く場合を呼吸に問題を引き起こす可能性があります
。
3. 左の視神経乳頭周囲の場所 4 レーザー スポット目し、内部統制として、未処理の目を使用します
。

4。生体内で網膜の形態のイメージング

1. 0 日に、ゼブラフィッシュの網膜レーザー誘導後に直接麻酔からそれらを復活することがなく視覚化します。他のすべての時間ポイントを用いる全身麻酔 (セクション 2 を参照してください: リバーシブルの全身麻酔)。( 図 1 B、B.1) カスタムメイドのシリコン pin ホルダーに固定されたゼブラフィッシュを配置します
。 最適な画像を得るための
2. カット ゼブラフィッシュ眼に合わせて市販のハイドロゲル コンタクト レンズ (Ø 5.2 mm、r = = 2.70 mm、中央の厚さ = 0.4 mm) による穴パンチ。セルロースとレンズの凹面を埋めるし、角膜の上に置きます
。
3. 78 D の非接触スリット ランプ レンズと OCT システムを装備します
。
4. フォーカス ir 赤外線 (IR) イメージ + 10 月モード ( 図 2 a) 眼の眼底を視覚化し、IR の写真をクリックして、" 取得 " ボタン ( 図 2 b) をローカライズするのにはレーザー システムを使用して網膜上のスポット ' s ソフトウェア
。
5. IR + OCT 網膜層部の三次元視覚化モードをクリックして写真を取るし、" 取得 " ボタン ( 図 2 b)。外の核層 (ONL) で損傷の重傷度を観察 (セクション 3 を参照してください: レーザー網膜に焦点の傷害) これらのイメージに
。
6. 治療および/または画像はタンクの水を含むコンテナーに、ゼブラフィッシュを配置後、麻酔を逆にします
。
7. 回復をサポートする顔の上の新鮮なタンクの水の流れを水にゼブラフィッシュを移動することによって作成します
。
8. 網膜形態の似たような 生体内 イメージングを実行日 1、3、7、14、6 週目
。

5。ヘマトキシリン & エオシン (H & E) 染色

1. 冷 (4 ° C) に水没によるゼブラフィッシュを安楽死させる氷少なくとも 10 分のため、摘出に麻酔ソリューション目すぐににより小さいカーブタイプ鉗子
。
2. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 20 h 4 ° C で 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の全体の目の修正し、傾斜アルコール シリーズのサンプルを脱水 (キシレン 5 分二度 100%、エタノール 100 %5 分間 2 回、3 分 2 回エタノール 96%、エタノール 70 %3 min 回).
   注意!PFA は、目、鼻、および上部の呼吸の経路を刺激することができます。PFA は、既知のひと発癌物質と疑われる生殖危険
。
3. パラフィン サンプルを埋め込む、視神経乳頭のレベルで 5 μ m のセクションをカット、スライド ガラスにそれらをマウントします
。
4. 5 分 0.1% 酸ヘマトキシリン液と deparaffinized のセクションを染色し、塩酸ミックスでスライドを浸漬した後、蒸留水で 2 回スライドをディップ (2 mL 25 %250 mL に塩酸蒸留水) とミックス (250 mL の 2 mL 25% アンモニア アンモニア蒸留水)。ヘマトキシリンで少なくとも 10 分間水道水で染色の開発後エオシン G 水溶液 0.5 %3 分のセクションを染色
5. アクリル樹脂取付中の脱水のスライドをマウントし、光学顕微鏡下でスライドを観察
。

6。MC の活性化のための免疫組織化学

1. 抗原検索バッファー (トリス EDTA + 0.05% 非イオン性洗剤、pH 9.0) 適切な蒸し器または電子レンジ 10-15 分で 3 分間の deparaffinized セクションを熱し、洗って 3 回 TBS 5各分
。
2. サークルであるシリコーン セクション ペンし、100 μ L を追加ブロック 1 における室温でのソリューション (TBS + 10% ヤギ血清 + 1% ウシ血清アルブミン、pH 7.6)
3. 染色抗グリア線維性酸性蛋白 (GFAP) ウサギ ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体抗グルタミン合成酵素 (GS)、1: 200 希釈 (1 サンプルあたり 40 μ L) の両方。4 ° C で加湿チャンバー内でスライドを一晩インキュベートします。TBS + 0.1% で 3 回洗って 5 分トゥイーン 20
。
4. 適切な仕上げ可視化二次抗体。このプロトコルは使用ヤギ抗うさぎ IgG H & GFAP とヤギ抗マウス IgG H L 緑二次抗体 & L 両方 1 時間室温で 1: 500 希釈で GS の明るい赤
5. 取付培 DAPI でスライドをマウントし、蛍光顕微鏡下でスライドを観察
。

リアルタイム 10 月: ゼブラフィッシュの網膜の損傷のよく線引きゾーンを誘導レーザー損傷モデルを用いて網膜の修復における MCs の役割を分析するために。(0 日) 損傷 (図 3) 60 分以内の初めて生体内でOCT による損傷のサイトをイメージしました。魚の眼の光学系を補うためにカスタムメイドのコンタクト レンズは、角膜に置かれました。レーザー治療後すぐに拡散ハイパー反射信号は網膜の外側 (矢印) にローカライズされました。それは網膜色素上皮 (RPE) から (OPL) 外網状層に拡張。同じような信号は、1 日目も検出可能。3 日後この拡散信号はより組織的かつ高密度になった。それは一貫して視細胞層に拡張する外核層 (ONL) で見られました。次の最初の 1 週間 (7 日)、平均の病巣の大きさの大幅な減少があったし、だけ小さな超反射信号が検出されました。最新時点調査 (週 6) まで、14 日目から始まって、レーザー スポット IR および OCT の画像に表示されていたもはや。

網膜の変性・再生の組織学的評価: 程度と網膜変性・再生、H の動力学を調査するために & 損傷誘導 (日 0、1、3、7、14 の後別の時点で採用された E 染色・ 6 週目) (図 4)。3 つの魚の 3 つ目の実験を行った。ただし、本稿の目的は方法を示すことです、統計分析が実行されません。内部の核層 (INL) の微妙な変化でき、ONL 見たすぐ後レーザー (ONL のわずかな浮腫など) および減らされた間隙 INL 次のレーザー治療 60 分以内。変性はレーザー損傷の誘導後 6 週間続いた。形態学的変化は、PRs の解体と空洞形成、ONL および網膜の領域で 1 日後一貫して観察されました。確かに、1 日から 7 日間の被害地域における ONL 内核の損失があった。最大の PR の損失は、3 日目で発見されました。14 日から始めて 6 週間、網膜の外側はその正常な形態を再確立していた。

グリアの関与中に網膜変性・再生: 異なる時点 (日 0, 3, 14) で MC の活性化を評価するために次の網膜変性症の誘導、GS グリア細胞マーカーの免疫組織化学的解析を実行し、GFAP (図 5)。実験は、定量分析をせず 3 つの魚の 3 つ目に再度行った。GS 細胞外グルタミン酸のレベルを制御するに重要な役割を果たしているし、MC 相馬とそのプロセス19,20で表されるのみであります。GFAP は誘導老化と網膜が損傷または重点を置かれるときです。それは MC の終わりフィートでローカライズし、21を処理します。弱い GFAP 発現は他のグリア細胞、アストロ サイトなどをラベリング無傷コントロール網膜の内側の部分にもわかった。PR 外側セグメントの蛍光も ONL の信号を提供が、これは明確に区別することができます。GFAP 信号受傷後 3 日目で亢進していた。これにより、網膜の ONL の傷害のサイト内でのみ GFAP 陽性 MCs を示したレーザー治療後 3 日で解析が実行されます。14 日から再生されたほぼ完了と GFAP 信号は被害地域のベースライン レベルにダウンレギュ レート。GFAP とは異なり GS 式のレベルにかなりの変化がありませんでした。ただし、傷害のサイトで GS のローカライズされたダウンレギュレーションされてありますいる可能性があります。

図 1: ゼブラフィッシュ網膜と OCT 分析、次のレーザー損傷の誘導のためのセットアップ。(A) 治療前に、レーザー システムのアレンジメント。(A.1) ゼブラフィッシュは、レーザービームのアプリケーションの前にちょうど眼底コンタクト レンズ シリコン pin ホルダーに配置されます。(B) 前にイメージング OCT システムのアレンジメント。10 月による被害サイトの検出前に 78 D スリット ランプ レンズの前に置かれた (B.1) ゼブラフィッシュこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: IR および OCT の画像を取得するためのセットアップ。(A) イメージ投射の間のソフトウェアのウィンドウのスクリーン ショット。IR および OCT のモードが描かれています。(B) 画像の取得に使用するパネルの概要です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: IR (左) と 10 月 (右) 画像同じ網膜の負傷と無傷のサイトの別の時間に目指す (日 0、1、3、7、14、週 6) 網膜変性のレーザー誘起後。IR 画像の緑色のボックスを示しますが網膜の部分を分析して緑色の線が網膜上 OCT 画像の場所を示しています。矢印を示すサイト 10 月スケール バーでハイパー反射信号として検出レーザー スポット = 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: H & 負傷者と対側無傷の染色時点の異なるゼブラフィッシュ眼は網膜変性のレーザー誘起後 (日 0、1、3、7、14、週 6) をポイントします。GC、神経節細胞層。INL、内部の核層;ONL、核外層。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 5: MC 活性化の免疫組織化学的検出します。GFAP (緑)、GS (赤) 網膜変性のレーザー誘起後 (日 0, 3, 14) を指す異なる時に負傷し、無傷のゼブラフィッシュの網膜における染色します。PR o の自家蛍光のため ONL に緑色の信号が配属セグメント。細胞の核が染色 DAPI で (青)。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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