概日時間の関数としてのザリガニ光受容体の脱感作と感度回復の研究のためのプロトコルが提示される。
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この記事について
サマリー
要約
ザリガニ光受容体の脱感作と回収を研究する方法を提示する。不連続な単一電極交換電圧クランプ構成を用いて、単離されたアイズトークにおける光受容体細胞の細胞内電気記録を行った。まず、カミソリの刃で、網膜へのアクセスを得るために、後角膜に開口部を作りました。その後、開口部を通してガラス電極を挿入し、負電位の記録により報告された細胞を貫通した。膜電位は、光受容体の休止電位でクランプされ、電流を活性化するために光パルスを適用した。最後に、2つのライトフラッシュプロトコルを用いて、現在の脱感作と回復を測定しました。最初のライトフラッシュトリガは、ラグ期間の後、転起イオン電流、ピーク振幅に達した後、脱感作状態に向かって減衰します。2番目のフラッシュは、様々な時間間隔で適用され、光活性化導電率の状態を評価する。光誘発電流を特徴付けるために、1)遅延(ライトフラッシュ配信と電流が最大値の10%を達成するまでの経過時間)の3つのパラメータを測定しました。2)ピーク電流;3)脱感作時間定数(現在の減衰相の指数時間定数)。すべてのパラメータは、最初のパルスの影響を受けます。
脱感作からの回復を定量化するために、比p2/p1はパルス間の時間と比較して採用された。p1は第1の光パルスによって呼び起こされるピーク電流であり、p2は第2パルスによって呼び起こされるピーク電流である。これらのデータは、指数関数の合計に適合しました。最後に、これらの測定は概日時間の関数として行った。
概要
視覚刺激として知覚されるためには、眼に到達する光を電気信号に形質転換する必要があります。したがって、すべての視覚生物において、光は形質転換イオン電流を引き起こし、光受容体細胞の膜電位、いわゆる受容体電位の変化を引き起こす。このため、眼の光感度は、主に光活性化導電率の状態に依存し、活性化または脱感作することができます。
ザリガニの光受容体では、光はゆっくりとした一過性のイオン電流1を引き起こす。照明時に、転移電流は、最大に達する前に遅れまたは遅延の後に発生します。その後、それは減衰し、伝達チャネルが脱感作状態に陥り、それらはさらなる光刺激に応答しない2。すなわち、光は、視覚を担う形質転換電流を活性化することに加えて、感光体細胞の感受性の一過性の減少も誘導する。脱感作は、適切な刺激への過度の暴露に対する一般的な保護メカニズムを表し得る。転帰伝導が脱感作から回復するにつれて、光に対する眼の感受性が回復する。
細胞内記録は、興奮性細胞3、4、5、6、7、8の電気活動を測定するのに有用な技術である。
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プロトコル
注:実験はメキシコの動物保護法に準拠しています。
1. 実験的なセットアップ
- 一般的な接続
- アナログ/デジタルコンバータを使用してアンプを適切なコンピュータに接続し、オシロスコープを使用して実験を監視します(図1)。
- 変換したA/Dにフォト刺激装置を接続します。
- レコーディングチャンバー
- 防振テーブルの上に記録室を置き、ファラデーケージの中に置きます。
メモ:これにより、録音に影響を与える可能性のある機械的振動や電気ノイズを防ぐことができます。私たちのファラデーケージは、暗い金網で作られました。自家製、2mL、アクリル記録室を使用しています(図2)。 - 準備を生き続けるためにお風呂の溶液を準備13: 205 mM NaCl;5 mM KCl;2 mM MgSO4;13 mM CaCl2;5 mM ヘペスナオ、 pH 7.3.
注:実験手順は電気記録による損傷を検出するのに十分短いため、溶液はデキストロースまたは95%O2、5%CO2混合物による任意のバブリングを含みません(完全性についてはステップ....
- 防振テーブルの上に記録室を置き、ファラデーケージの中に置きます。
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結果
まず、ザリガニ光受容体細胞の代表的な受容体電位が得られる(図4)。その後、光伝達電流をトリガするためにテストライトフラッシュを適用しました(図5)。カチオン伝達電流1は、ラグの後に活性化し、最大に達し、その後ゆっくりと吸収脱感作状態に落ち、そこからゆっくりと回復する。
光誘発電流の長遅延L(数十ミリ秒)は、Gタンパク質経路を含む光によって引き起こされる生化学的事象に依存すると考えるのが妥当である。ピーク電流の振幅は、開いていけるチャネルの割合と、現在の活性化と不活性化の相対速度に依存します。後者は減衰時間定数Tによって評価される。
一方、L回収は.......
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ディスカッション
ザリガニは、非自然条件下で生き残る能力のために優れたモデルであることが証明されています。インビボおよびインビトロ電気生理学的分析への容易なアクセスがある。また、甲殻類は、比較時間生物学21の分野における神経生物学的研究に有利な群である。
本論文では、ザリガニ光受容体細胞の光活性化伝達電流の脱感作と回収に関する研究を、細胞内記録技術を用いて示す。しかし、光受容体細胞にアクセスできる限り、同じ技術を他の無脊椎動物の視覚系に適応させることができると考えています。
許容可能な実験結果を得るには、すべての機器を接地して電気ノイズを除去し、十分に微細な先端を有する電極を構築し、光受容体セルは、2パルスプロトコルが始まる前に完全に暗い適応である。
膜の損傷などの細胞内記録の限界にもかかわらず、さらに進み、ザリガニ(または他の動物)光受容体電気信号の基礎となる生物物理学的メカニズムに関する詳細な情報を得る.......
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開示事項
開示するものは何もない。
謝辞
この作業は、DGAPA-UNAM IN224616-RN224616 補助金によってサポートされました。著者たちは、この原稿の英語版を編集するために、UNAMのナカルト・デ・メディチーナのディビシオン・デ・インベスティガシオンの科学論文翻訳部門長のジョセフィーナ・ボラド夫人に感謝したいと考えています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アクソクランプ2A | Axon Instruments Inc | Amplifier | |
| Digidata 1200 Interface | Axon Instruments Inc | Digitizer | |
| Oscilloscope TDS430A | Tektronix | Analogic Oscilloscope | |
| Photostimulator PS33 Plus | Grass | Lamp | |
| Puller PC-100 | Narishige | Micropipette | |
| Puller P-97 | Sutter Instruments | マイクロピペットプーラー | |
| ガラスキャピラリーチューブ Kimax-51 | Kimble Products | 34502 | 0.8, 1.10, 100 mm |
| HS-2 Headstage | Axon Instruments Inc | Headstage | |
| Micromanipulator MX-4 | Narishige | Mechanical Micromanipulator | |
| Stereoscopic Microscope | Zeiss | Microscope | |
| pClamp | AxonInstruments Inc | digidata 1200インターフェース用データ収集ソフトウェア | |
| Clampfit | Axon Instruments, Inc | にリンクされた解析ソフトウェア | |
| データ分析・グラフ作成ソフト | |||
| 塩化ナトリウム | シグマ | S7653 | >99.5%) |
| 塩化カリウム | シグマ | P-9333 | 99% |
| 以上 硫酸マグネシウム | Σ M7506 | 99.5% | |
| 以上 塩化カルシウム | Σ C5080 | 99.0% | |
| 以上 ヘプ | スシグマ | H7523 | >99.5% |
| 水酸化ナトリウム | シグマ | S8045 | 98.00% |
| 次亜塩素酸ナトリウム溶液 | シグマ | 425044 | 利用可能な塩素、10-15% |
参考文献
- Barriga-Montoya, C., Gómez-Lagunas, F., Fuentes-Pardo, B. Effect of pigment dispersing hormone on the electrical activity of crayfish visual photoreceptors during the 24-h cycle. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 157 (4), 338-345 (2010).
- Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F.
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再版と許可
