方法論記事

無菌を緩める CoCrMo 粒子への暴露によるマウス頭蓋骨融解モデルの構築と評価

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DOI：

10.3791/56276

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2018年2月17日

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1Department of Orthopedics, Jinling Hospital, School of Medicine, Nanjing University, 2Center for Translational Medicine, Nanjing University Medical School, 3Jiangsu Key Laboratory for Molecular Medicine, Nanjing University Medical School

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本稿では、摩耗粒子と無菌を緩める様々 な細胞間の相互作用を評価するための理想的な動物モデルを構成する CoCrMo 粒子への暴露によってマウス頭蓋骨融解モデルについて説明します。

要約

摩耗粒子誘起融解は無菌ゆるみ、膝関節障害の主な原因が、基になるメカニズムは不明のまま。長いフォロー アップ必要な検出と散発的な発生のためのための臨床例で病原性 ofparticle 誘起融解を評価することは難しい。したがって、最適な動物モデルはさらなる研究の必要があります。CoCrMo 粒子への暴露によって確立された頭蓋骨の融解のマウスモデルは粒子と無菌を緩める様々 な細胞間の相互作用を評価するための効果的かつ有効なツールです。このモデルで CoCrMo 粒子は最初高真空 3 電極直流電流によって得られ、リン酸緩衝生理食塩水 50 Mg/ml の濃度で再停止されます。政教分離によって頭蓋骨膜シャープ郭清後、結果の懸濁液を 50 μ l 添加されたマウス頭蓋骨の中央に適用されます。2 週間後、マウスが犠牲になったし、頭蓋骨標本が収穫されました。ヘマトキシリンとエオシン染色とマイクロ コンピューター断層撮影による定性的および定量的な評価を行った。このモデルの長所は、手順のシンプルさ、骨の損失の定量的評価、融解開発、遺伝子の潜在的な使用またはノックアウト モデル、および比較的安価の速さ。ただし、このモデルは機械的な力と無菌ゆるみにおける粒子の慢性的な影響を評価するために使用することはできません。CoCrMo 粒子への暴露によって生成されたマウス頭蓋骨融解モデルは、摩耗粒子と様々 な細胞、例えばマクロファージ、線維芽細胞、骨芽細胞や破骨細胞、無菌を緩める間の相互作用を評価するための理想的なツールです。

概要

最も一般的な原因は、無菌を緩める (THA) 人工股関節、人工膝関節全置換術 (TKA) 障害の修正手術1必要があります。ただし、基になるメカニズムは、不明2残ります。長期フォロー アップが必要検出粒子誘起融解、その発生はまれです。したがって、臨床症例でその病因を探ることは難しい。したがって、細胞およびティッシュの複雑なメカニズムに焦点を当ててさらなる研究が必要で両方生体内で実験摩耗粒子誘起融解モデルおよび生体外の試金骨の恒常性3に関係する細胞です。有効な動物モデルは、さらに細胞試金のための証拠を提供する骨の損失に及ぼす摩耗粒子を明らかに重要です。

CoCrMo 粒子への暴露によって作成したマウス頭蓋骨融解モデルは粒子と無菌を緩める様々 な細胞間の相互作用を評価するための効果的かつ有効な方法です。このモデルでは、CoCrMo 粒子は、マクロファージの炎症性サイトカインを誘導し破骨細胞を活性化、骨芽細胞の増殖を阻害する、骨芽細胞のアポトーシスを促進して頭蓋骨の融解を引き起こします。

このモデルを確立する 2 週間たった。融解の可視化し、ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 染色による定量化マイクロ計算された断層レントゲン写真撮影 (マイクロ CT)2することができます。さらに、このモデルは、比較的低コスト、トランスジェニック、ノックアウト マウス モデルは様々 な用量3化合物の数が多いを画面に使用できます。

確立し、このモデルを評価する手順は簡単です。まず、CoCrMo 粒子に高真空 3 電極直流電流によって得られ、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 50 mg/mL の濃度で再停止されます。政教分離によって頭蓋骨膜シャープ郭清後、結果の懸濁液を 50 μ l 添加されたマウス頭蓋骨の中央に適用されます。2 週間後、マウスが犠牲になったし、頭蓋骨のサンプルを採取しました。H & E 染色及び CT による定性・定量分析を行った

CoCrMo 粒子への暴露によって作成したマウス頭蓋骨融解モデルは CoCrMo 粒子、マクロファージ、線維芽細胞、骨芽細胞、破骨細胞、無菌を緩めるなどの様々 な細胞間の相互作用を評価するための理想的なツールです。

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プロトコル

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 南京大学によって承認されています。

1. CoCrMo 粒子の作製

  1. 作製した高真空 3 電極直流4CoCrMo 粒子を取得します。現在 10-3 Pa の真空、0.04 MPa アルゴン、水素 3:2 (v/v)、下で楽器の CoCrMo 合金と 650 A 陰極を配置します。
  2. CoCrMo 粒子の直径を測定します。
    1. 1.5 mL の無水エタノールに CoCrMo 粒子の 1 mg を追加します。
    2. 28 kHz、600 W 5 分の超音波振動による CoCrMo 粒子を無水エタノールで再懸濁します。
    3. 透過電子顕微鏡 (TEM) の目的のテーブルに生成される懸濁液の一滴 (約 20 μ L) を適用します。一連の 200 kV 加速電圧と 0.24 nm 分解能の TEM 写真をキャプチャします。
    4. 付属のソフトウェアを使用して、TEM 顕微鏡写真の平均直径と粒度分布を計算します。
  3. エンドトキシンを消毒します。
    1. オートクレーブで 121 ° C、15 psi 15 分の粒子の 50 g。
    2. カブトガニ含まライセート (ラル) 定量によるエンドトキシンの検出 (< EU/mL はエンドトキシンの不在を示すと考えられた 0.25%)5。
  4. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 原液6として 50 mg/mL の濃度で粒子を再懸濁します。

2. 頭蓋骨融解モデルの構築

  1. 6 週古い C57BL/J6 マウス (グループごと 6 マウス) withpentobarbital (50 mg/kg) を麻酔します。ピンチのテストを使用すると、麻酔のレベルを評価します。通常生理食塩水で目の乾燥を防ぐ。
  2. 傾向がある位置にマウスを配置します。髭剃りと頭蓋に毛皮を削除し、75% のエタノールを含む医療脱脂綿を使用して皮膚を消毒します。
  3. ポイントのローカリゼーションの 2 つの目と耳の間の中点をそれぞれ含む 2 つの点を識別します。上記の点を 2 つのラインを決定し、ハサミ (図 1 a) 上記のラインに沿って皮膚を切開します。
  4. メス (図 1 b)6と頭蓋骨から頭蓋骨膜を削除します。
  5. 簡単な縫合と両端に皮膚を縫合します。
  6. 切開部を縫合線を作る結びなし。縫合線の両端を保持します。
  7. Calvarias (図 1)2の途中で CoCrMo 粒子懸濁液 (PBS で 50 mg/mL) の 50 μ L を埋め込みます。
  8. 簡単な縫合 (図 1) 内で最後のステッチを結び目。
  9. 別の 2 週間のマウスを維持します。

3. マイクロ Ct で頭蓋骨融解モデルの評価

  1. 二酸化炭素とマウスを犠牲に。水平面内マウスの首をはねます。内部では、脳組織と皮膚を削除し、毛皮の外。さらに実験の calvarias を収穫します。
  2. 軽くピンセットで、頭蓋骨にすべての軟部組織をオフにします。マイクロ CT スキャンの前に PBS の 24 h で calvarias 24 時間浸 4 ° C で 4% パラホルムアルデヒドでクリアの calvarias を修正します。
  3. 18 μ m の等尺性解像度と 45 の x 線エネルギー設定で高分解能マイクロ CT を用いたマウス calvarias を分析 kV と 550 mA。
  4. ソフトウェアとマイクロ CT データの三次元再構成を行います。
  5. 定性・定量分析。
    1. まず、関心領域として正中縫合糸の周りの正方形の領域を選択します。
    2. 第二に、骨のミネラル密度 (BMD) の測定、骨量/総ボリューム (BV/TV)、骨梁数 (Tb.N)、骨梁の厚さ (Tb.Th)、海綿分離/間隔 (Tb.Sp)、マイクロ CT の提供されたソフトウェアと総気孔率の割合
    3. 第三に、一方向の分散分析による様々 な測定の 3 つのグループを比較します。事後分析の分散、ボンフェローニの方法2が適用されます。

4. H & E 染色による頭蓋骨融解モデルの評価

  1. 15% エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の頭蓋冠由来サンプルをめし-4 ° C で PBS脱灰液に 3 週間毎日を変更します。
  2. 2 cm × 1 cm × 1 cm キューブのパラフィンで脱灰試料を埋め込み、粒子沈着の領域で 2 μ m のセクションにそれらをスライスします。
  3. ヘマトキシリンでセクションを汚し、エオシン前述した7。
  4. 光学顕微鏡検査によって全体的な pathomorphism の顕微鏡写真をキャプチャします。

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結果

社内生産ナノスケール CoCrMo 粒子が約 50 nm (3.56 の標準誤差) 直径、量 TEM (図 2)。マウス calvarias の CoCrMo 粒子、動物への暴露後 (n = グループあたり 6) 別の 2 週間を維持されました。2 週間以内頭蓋骨切開は、完全に癒されましたし、の縫合が落ちることがあります。任意の局所感染や偽関節 5 月骨損失の評価に影響を与えます。マウス犠牲後頭蓋冠由来サンプルが収穫されました。すべての軟部組織が優しく晴れたし、マイクロ CT は、骨の損失を定量化に使用されました。三次元再構成画像と断面で代表的なコロナの写真の両方で、重要な骨の損失 CoCrMo 粒子 (図 3) を投与したマウスで観察されました。骨のミネラル密度 (BMD)、骨のボリューム/総ボリューム (BV/TV)、骨梁数 (Tb.N)、骨梁の厚さ (Tb.Th) は有意に小さく全孔隙率と骨分離/間隔 (Tb.Sp) が有意に、CoCrMo で増加...

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ディスカッション

摩耗粒子誘起融解マウスの 2 つの主な方法がある: 空気袋モデルと頭蓋骨融解モデル。空気袋モデルで生成された皮下の空気袋は最初設立、骨組織8に摩耗粒子導入と注入が続いてポーチ壁は、無菌を緩める骨膜を模倣します。ただし、骨移植は粒子と骨組織との直接の相互作用を評価するために難しくありませんの生物学的活性を持つ非血管性。頭蓋骨融解モデルには、空気袋相手にいくつかの利点があります。まず、摩耗粉は、直接摩耗粒子間の相互作用を行い、骨の恒常性は、骨吸収と骨芽細胞、破骨細胞とマクロファージの活動9,10 を含むこと、頭蓋骨にさらされています。.第二に、骨の損失の定量的測定が骨損失予防11のさまざまな潜在的な遺伝子解析と生物学的製剤の評価することが可能。第三に、摩耗粒子と様々 な形質転換などの遺伝的背景や遺伝子ノックアウト マウス12,...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

本研究は、中国の国家自然科学基金 (81572111)、臨床科学技術プロジェクト財団の江蘇省 (BL2012002)、南京の科学研究プロジェクト (201402007)、自然科学に支えられました。江蘇省 (BK20161385) の基礎と中国医師協会 (2015COS0810) の特別な基礎。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
プロテーゼWaldemar Link GmbHからのCoCrMo合金 &CoGEMINI MK IICoCrMoナノ粒子を得るための原料
作製した高真空3電極直流材料科学部 &エンジニアリング、南京工科大学設計マシン
6週齢男性C57BL / 6Jマウス京大学のモデル動物研究センターN000013
100%エタノール南京試薬C0691514023透過型電子顕微鏡走査用CoCrMoナノ粒子の溶媒
1.5ml微量遠心チューブ泰州Weierkang医療用品有限公司W603
マイクロアナリティカルバランス深センQunロング機器機器株式会社。株式会社EX125DZH
超音波シェーカー上海Yuhao科学機器有限公司YH-200DHCoCrMoナノ粒子を懸濁
透過型電子顕微鏡FEITecnai G20
SimplePCIソフトウェアCompix Inc.6.6バージョン平均直径と粒度分布を計算します。
高利きの滅菌パンQIULONGYIQIKYQL-100DSエンドトキシンを除染するには
リムルス変形細胞溶解物 (LAL) アッセイチャールズリバーR13025エンドトキシンを検出するには 
15 mLのマイクロ遠心分離機の管Taizhou Suyi MedicalB122
リン酸塩緩衝生理食塩水Boster Biological TechnologyAR0030CoCrMoナノ粒子ストック溶液の溶媒
ペントバルビタールナトリウムΣ P3761マウスを麻酔するには
通常の生理食塩水SACKLERSR8572EP-15マウスの目の乾燥を防ぐには
75% エタノール南京試薬C0691560275消毒
医療用綿球Shuitao1278298933消毒
シェーバーKemeiKM-3018皮を剃るには
さみRWDライフサイエンスS12005-10を切開するために
合RWDライフサイエンスF34001-01を縫合する
ニードルホルダーRWDライフSCIENCEF33001-01皮膚を縫合する
ニードルRWD LIFE SCIENCER14003-12皮膚を縫合する
血管鉗子RWD LIFE SCIENCEF22003-09皮膚を縫合する
メスRWD LIFE SCIENCES31010-01カルバリア
RWD LIFE SCIENCEF12006-10カルバリア
100を収穫するには & マイクロ;Lピペットエッペンドルフ3120000240calvatias
100 & micro;LピペットチップAXYGENT-200-Ycalvatias
5 ml MicrotubesTaizhou Weierkang Medical Supplies co., LTDW621
4% パラホルムアルデヒドServicebioG1101固定
マイクロコンピュータ断層撮影 SkyScan1176
エチレンジアミン四酢酸ServicebioG1105脱灰
パラフィンServicebio#0001
パラフィンスライシングマシンライカRM2125RTS
ガラススライドServicebioG6004
カバーガラスServicebio200
HE染色キットServicebio#1-5HE染色
光学顕微鏡ニコンE200
自己南する 毛は皮膚縫糸皮膚ピンセットを収穫する

参考文献

  1. Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
  2. Deng, Z., et al. SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening. Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).
  3. Langlois, J., Hamadouche, M. New animal models of wear-particle osteolysis. Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).
  4. Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method. Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).
  5. Wang, Z., et al. The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s. Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).
  6. Wang, Z., et al. Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis. Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).
  7. Wang, R., et al. Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening. Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).
  8. Yang, S. Y., et al. Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model. Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).
  9. Liu, N., et al. Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha. Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).
  10. Wang, Z., et al. ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts. PLoS One. 10 (9), e0137774(2015).
  11. Wang, Z., et al. TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes. Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).
  12. Chen, S., et al. Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo. Sci Rep. 5, 12853(2015).
  13. Neuerburg, C., et al. The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis. Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).
  14. Catelas, I., Jacobs, J. J. Biologic activity of wear particles. Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).
  15. Liu, A., et al. The biological response to nanometre-sized polymer particles. Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).

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