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方法論記事

G2-seq: 高スループット シーケンス ベースを識別する方法後半ゲノムの領域を複製します。

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DOI:

10.3791/56286

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2018年3月22日

 ,  , 
1Division of Clinical Research, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Departments of Medicine and Biochemistry, University of Washington

この記事について

サマリー

フローサイトメトリーとゲノムの後半の複製領域を識別する高スループット シーケンスを結合する手法について述べる。

要約

多数の技術は、細胞周期の S 期で DNA 複製の進行状況を追跡する開発されています。これらの技術のほとんどは、場所の解明とゲノム重複ではなく、その完了の開始時期に向かって指示されています。しかし、我々 はこれらの地域の染色体の破損や、突然変異レベルが上昇に苦しむので、レプリケーションを完了する最後はゲノムの領域を理解し、彼らは病気と高齢化に関連付けられていることが重要です。ここで我々 は我々 が代わりにレプリケーションを完了する最後のゲノムのこれらの領域を識別するために複製開始反応を監視するために使用されている技術を拡張する方法について説明します。このアプローチは、フローサイトメトリーと高スループット シーケンスの組み合わせに基づいています。このレポートは、この手法の酵母への応用に焦点を当て、アプローチは DNA の内容によると流れの cytometer で並べ替えることができます任意のセルで使用できます。

概要

真核生物ゲノムのレプリケーションは、レプリケーションでは、レプリケーションからフォーク (Fragkosら2015年1文献) 両方の方向で進むの起源と呼ばれる複数の個別サイトで開始されます。起源が異なるタイミングと、焼成の効率とレプリケーション元のアクティビティを監視し、この変化の原因を解明するいくつかの手法が開発されました。個々 の原点の活動は、単一座礁させた DNA2、アクティブな起源の周りのフォームのレベルから推論できるまたは特定の複製中間体3を監視する第 2 ゲルの電気泳動を使用して、どちらで検出できます。放射性プローブ。起源は、前者の特定の知られていたシーケンスに制限され、これらの手法の両方はより簡単に出芽酵母よりも哺乳類セルので適用されます。マイクロ アレイの出現により、世界的に焼成の起源を評価することが可能になりました。これは最初重い同位体と DNA の分類、中含まれている軽い同位体に G1 ブロックから細胞を放出、重・軽ハイブリッド DNA ゲノム4の形成を監視によって行われました。高スループット シーケンスの導入許可同様ゲノムは、高価な同位体ラベリングの要件なしで活動を起源の監視します。細胞は、DNA の内容によると流れの cytometer のディープ シーケンスを受ける DNA ソートされます。シーケンスのカバレッジが S 期にわたって 2 倍に 1 x から進むにつれて、ので相対的なレプリケーションのタイミングは G1 あるいは G25,6S 期細胞の読み取りの深さを比較することによって評価できます。特に酵母に適用これらのテクニックは、dna 塩基配列、クロマチン構造と DNA 複製タンパク質起源タイミングと効率の規制方法のより深い理解につながった。

細胞増殖の中に遺伝情報の忠実な伝達には、DNA の複製の起源で行われるの唯一の成功の開始だけでなく、複製フォークが満たすために発生するレプリケーションが正常に完了が必要です。レプリケーションの開始のようなレプリケーションの完了のタイミングは、残りの細胞周期の後半でもレプリケートされていない特定の領域にゲノム間で異なります。このような領域は特にアクティブな複製の起源から遠いかシーケンスやクロマチン構造の DNA ポリメラーゼを阻害する場合があります。後期地域をレプリケートする染色体の破損および高い突然変異率と関連付けられ、がんと老化7,8,9に関与している壊れやすいサイトとして自分自身のマニフェストことができます。しかし、ゲノムの安定性の維持に DNA の複製が正しく完了の重要性にもかかわらずこれが起こる場所と方法の理解が遅れてレプリケーション開始。後半レプリケーションは病気に関連付けられている個々 の遺伝子の中で、たとえば、qPCR10場所の解明と後半のレプリケーションを欠けている原因の基礎となるグローバル研究検討されています。ここで我々 は"G2 seq"高スループット シーケンスのゲノム複製の完了に光を当てるとフローサイトメトリーを組み合わせる我々 として酵母の11を参照手法について述べる。軽微な変更は、このプロトコルは DNA 量順の流れをすることができます任意のセルに合わせることができます。

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プロトコル

1 のセルの準備の流れ Cytometry の並べ替え

  1. 文化一晩成長後 5 x 106 1.5 mL あたり7セルを 10 倍の密度に達するような YEPD 液 8 mL を含む 15 mL の試験管を接種する (注 1 の議論」を参照)。
  2. 酵母 (1,400 × g、室温、4 ° C で) 5 分 15 mL スクリュー キャップ遠心管でスピンダウン、1.5 mL 70% エタノールで 1.6 の mL および microfuge の管に転送この座っている部屋の温度で 1 時間または氷 (少なくとも 3 h をさせる細胞を再懸濁します4 ° C で不明確に保存されることができます) (議論点 (2) を参照)。
  3. 1 分の microfuge (14,000 x g、4 ° C) で酵母をスピン、1 分の 1 mL 50 mM クエン酸ナトリウム、pH 7.2、スピン ・ ダウン (14,000 x g, 4 ° C) で再懸濁します、上清を吸引、1 mL 50 mM クエン酸ナトリウム、pH 7.2 で再懸濁します、0.25 mg/mL 50 ° c または一晩熱ブロックまたは水浴で 37 ° C で 1 h RNAse ソリューションを含みます。
  4. 50 μ L, プロテイナーゼ K 溶液 (20 mg/mL 10 mM Tris pH 7.5、2 mM CaCl2、ボリューム グリセリン 50% の重量で再停止される) を追加し、50 ° C で 1 時間インキュベート
  5. Cells (14,000 × g, 4 ° C) スピンダウン、1 mL 50 mM クエン酸ナトリウム、pH 7.2 細胞を再懸濁します、スピン ・ ダウン (14,000 x g、4 ° C)、真空上清を吸引、クエン酸ナトリウム 50 mM で再停止される 1 mL 1 μ M 緑核酸ひずみで再懸濁します、pH 7.2 室温で 1 時間暗闇の中で孵化、2 x 2 の超音波 s 各 (出力 2 ワット)。

2. 細胞選別

  1. 図 1のように各細胞周期の段階から、少なくとも 160 万単相細胞を収集フェーズ G1、S、"初期 G2 は、"、「後半 G2」は、DNA 内容に従ってセルを並べ替えるセルの並べ替えアイコンを使用して、(議論点 (3) を参照)。
  2. Microfuge の管にセルを転送およびスピン ・ ダウンで 4 ° C、および microfuge 14,000 x g で 20 分間細胞と真空上清を吸引 (ペレットは、無期限に-20 ° C で凍結保存ことができます; ポイント (4) の議論を参照)。

3. DNA の抽出とシーケンシング ライブラリの準備

注: 次の手順に基づいて酵母ゲノム DNA 抽出キットで「議定書 I」(材料の表を参照してください).

  1. 酵母細胞壁溶解酵素細胞壁や酵母細胞壁溶解酵素の 5 μ L を消化、ボルテックス、によって再懸濁します、37 ° C、40-60 分インキュベートすることができる独自のバッファー「消化バッファー」の 120 μ L を追加します。
  2. 「換散バッファー、」洗剤と渦 10-20 s ハードを含む独自のバッファーの 120 μ L を追加します。
  3. 250 μ L のクロロホルムを追加 - 徹底的にミックス 1 分。
  4. 2 分間および microfuge の最高速度で回転します。
  5. DNA 結合列と、および microfuge の最高速度で 1 分間遠心上清をロードします。
  6. 「DNA 洗浄バッファーの「エタノール、および、および microfuge の最大の速度で 1 分間遠心を含む独自バッファー 300 μ l を追加します。流れを破棄 DNA 洗浄バッファーの 300 μ L を追加し、洗浄プロセスを繰り返します。
  7. 新鮮なおよび microfuge の管にスピン列を転送、水 (ない TE) の 60 μ L を追加 - 1-3 分待って、10 の遠心分離機、DNA を溶出します。
  8. された dsDNA 高感度バッファーで希釈 1: 200 と、指定された規格の 10 μ L を用いた校正、蛍光光度計で測定蛍光 dsDNA 高感度試薬の 195 μ L DNA の 5 μ L を追加することによって濃度を測定します。10 と 50 ng の DNA 収量の間期待します。
  9. 超音波 (ピーク事件電源 450、デューティー比 30%、サイクル/バースト 200、治療時間 60 秒、水レベル 6) 250-350 bp の断片を DNA を破壊します。
  10. DNA サンプル調製キットを使用してライブラリを準備し、高速モードで DNA シーケンス楽器でシーケンス処理するそれ (少なくとも 1000 万 50 bp シングル エンド ヒット) (議論注 (5) を参照)。

4. データ ・ レプリケーションの世代シーケンスの解析のプロファイルします。

  1. Gsnap12を用いた出芽酵母sacCer3 ゲノム シーケンスを配置 (ディスカッション注 (6) を参照)。
  2. 塩基あたりを読む Bedtools の"genomeCoverageBed"ソフトウェア13を使用して深さを決定します。
  3. 存在する場合、読み取りの深さで artefactual スパイクを削除 (ディスカッション注 (7) を参照)。
  4. 滑らかな読む深さ r"runMean"関数を使用してウィンドウをスライド 20 kb で中央分離帯を用いた染色体によってパッケージ"caTools"(ディスカッション注 (8) 参照)。
  5. プロットは完全にレプリケートされた読み取りの深さ (ディスカッション注 (9) を参照) の割合として S 段階、初期 G2 後半 G2 で深さを読みます。

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結果

我々 は出芽酵母における後半の複製サイトを識別するために上記の手順を使用しています。人工染色体の知られている遅い複製領域を使用してこの方法をテストを正確かつ信頼性の高い技術を証明しました。我々 の結果も示しているレプリケーションのタイムリーな完了の生物学的重要性染色体 7、我々 は G2 seq 結果に基づいて後期複製として識別、後期複製領域が失われたことを示すことによって約散布地域11同等より頻繁制御します。

G2 seq と結果の具体的な例を図 2に示します。私たちと仮定したが欠けている Sir2 と呼ばれる蛋白質脱アセチル化酵素を細胞で特に遅くレプリケートされたゲノムの領域でしょう。図 2 aは、(赤) (青) 野生型とsir2データ分析の進行を示しています。(上...

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ディスカッション

一方、この手法は堅牢で、比較的まっすぐな前方、特に注意は次に捧げられるべき。

(1) 以来、文化は接種後必要な密度だけ 4 h に到達した後収穫される場合細胞周期の分布に相違が顕在ログ段階に達する前に少なくとも 12 時間の文化が成長するを推奨します。我々 の仮定では比較的安定した平衡に達した細胞周期の分布はより飽和させた文化は、最近では新鮮な媒体に転送されているときにまだ流動的で配布よりも「本物の」ログ位相分布を表します。

(2) 固定する前にセルを回転の代わりに細胞は、酵母の培養にエタノールの最終濃度が 70%、100% エタノールを直接追加しても修正できます。細胞は合成またはリッチ (YEPD) 培地で育てることができます。

(3) 細胞周期の段階は、530 nm の発光領域の関数としてプロットのセル番号で並べ替えの可視化します。我々 は S と G2 と G1 と S の間の変曲点が S 段階の輪郭を描くため堅牢なランドマークとなる、我々 は初期と後期の G2 を...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この仕事は a. b. に NIH GM117446 助成金によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
YeaStarゲノムDNAキットGenesee Scientific11-323
1 µM SYTOX GreenThermoFisher5702050 mM クエン酸ナトリウム、pH 7.2
50 mM クエン酸ナトリウム、pH 7.2
RNase 溶液 (0.25 mg/mL)SigmaR65130.25 mg/mL RNaseA 50 mM クエン酸ナトリウム、pH 7.2 に再懸濁し、RNase 溶液を初回使用前に 10 分間煮沸し、その後は -20°C で保存します。
プロテイナーゼK溶液(20 mg / mL)ThermoFisher / Invitrogen25530-01510 mM Tris、pH 7.5、2 mM CaCl2、50%グリセロールに再懸濁し、-20°Cで保存します。C
Model 50 Sonic DismembratorFisher ScientificFB50A220
BD Biosciences FACSAria IIBD Biosciences644832
Zymo-spin III カラムZymo ResearchC1005
Qubit dsDNA HS Assay KitThermoFisherQ32851
Qubit 3.0 FluorometerThermoFisherQ33216
CovarisモデルLE220焦点超音波装置Covaris500219
イルミナTruSeq DNA LTサンプル調製キットイルミナ15026486
イルミナHiSeq 2500機器イルミナSY–401–2501
gsnap アライメントソフトウェアオープンソースソフトウェア / Genentechhttp://research-pub.gene.com/gmap
を

参考文献

  1. Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).
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  4. Raghuraman, M. K., et al. Replication dynamics of the yeast genome. Science. 294, 115-121 (2001).
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