方法論記事

CLIC4 ノックダウン誘起 HN4 細胞アポトーシスの in Vitro研究にミトコンドリア膜電位の検出

DOI：

10.3791/56317

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2018年7月17日

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1School of Basic Medical Sciences, Anhui Medical University, 2Department of Orthopedics, Anhui Provincial Hospital, Anhui Medical University

この記事について

サマリー

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ローダミン 123 ミトコンドリア膜電位 (MMP) を識別し、CLIC4 ノックダウン誘起 HN4 細胞アポトーシスの生体外の研究の適用のための詳しいプロトコルをご紹介します。一般的な蛍光顕微鏡、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡下で MMP のリアルタイム変更が記録されました。

要約

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ミトコンドリア膜電位 (MMP, ΔΨm) の枯渇は、アポトーシスのカスケードの最も早いイベントと見なされます。それは先に核のアポトーシス特性、chromatin の凝縮、DNA の破損なども発生します。一度 MMP 崩壊、細胞のアポトーシスは不可逆的に開始されます。脂溶性のカチオン染料のシリーズ細胞膜を通過し、ミトコンドリアのマトリックス内の集計、や MMP の変化を評価するための蛍光マーカーとして役立ちます。Cl-細胞内チャネル (CLIC) 家族の 6 人のメンバーの 1 つとして CLIC4 はミトコンドリア経路を中心に細胞アポトーシス プロセスに参加します。ローダミン 123 (Rh123) CLIC4 ノックダウンで誘導されるアポトーシスを学ぶ私たちの蛍光変動の監視を通じて MMP を測定する詳細なプロトコルについて述べる。利点および共焦点レーザー走査と詳しくは、通常の蛍光顕微鏡のアプリケーションの制限について説明し、また他の方法と比較します。

概要

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Rh123 は、膜電位を指標として機能するカチオン性蛍光色素です。Rh123 は、細胞膜を貫通し、1膜内外の電位差によってミトコンドリアのマトリックスを入力が可能です。アポトーシスは、ミトコンドリア膜の完全性の損傷に します。ミトコンドリア透過性遷移ポア (MPTP) が開き、mmp に関しては、ミトコンドリアの外に Rh123 のリリースで、結果の崩壊に 。最後に、蛍光顕微鏡下で強い緑色蛍光シグナルが検出されます。MMP と昇格した膜の透過性の減少が細胞アポトーシス2の初期の兆候であることをも記載されています。したがって、Rh123 は、MMP の変化の検出と細胞のアポトーシスの発生に適用可能性があります。

世界の第 6 最も一般的な癌、頭頸部癌が人の健康3大幅に劣化します。多くのアプローチは、近年開発された、頭頸部扁平上皮癌 (各種) を患っている患者のための治療の治療成績はまだ理想的ではない4。新しい治療法を探る各種5の処理を改善できます。多数の生物学的プロセスを含むイオン チャネルは、さまざまな癌6の開発に重要な役割を表示します。Cl-チャンネルの一部または全部の参加は高メタアナライシス アクティブな移行、増殖、侵襲性の率が高いなどのさまざまなプロパティに関与しています。この点を踏まえて、CLIC、新規なタンパク質ファミリーを治療標的癌治療6、7のための有望なクラスとして記載されています。最近の研究が明らかにした CLIC1、CLIC4、CLIC5 など CLIC の家族のメンバーを心臓のミトコンドリアにローカライズ、活性酸素種 (ROS) レベルは、CLIC5 で誘導されるミトコンドリアにある Clの機能的役割を示す-アポトーシス応答8チャンネル。CLIC4、CLIC の家族 (として知られている mtCLIC、P64H1、および RS43) の 1 つのメンバーは、がん細胞とヒトのミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体を含む細胞レベル下の場所でアポトーシス制御プロパティの最も広く研究されています。ケラチノ サイト7,9,10。CLIC4 の発現は、腫瘍壊死因子-α (TNF-α)、P53 と外部からの刺激によって規制されていた。過剰発現および CLIC4 のカスケードはカスパーゼの活性化とチトクローム C11,のリリース Bcl 2 家族の不均衡を伴うミトコンドリア経路を中心にアポトーシス反応を誘発します。12,13。 したがって、MMP 測定が CLIC4 関連アポトーシスを探索することが重要で、Rh123 は理想的な蛍光インジケーターとして機能します。

本研究では、HN4 細胞における CLIC4 ノックダウンによるアポトーシス誘導を研究する MMP の検出のための詳しいプロトコルについて説明します。Rh123 は、MMP の変化を観察する蛍光プローブとして使用されます。一般的な蛍光顕微鏡、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡下で MMP のリアルタイム変動を解決可能性があります。利点および共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡詳細、アプリケーションの制限について説明し、また他の方法と比較します。このプロトコルは、他のアポトーシス関連の研究にも適用できます。

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プロトコル

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1. 細胞培養とトランスフェクション

  1. 細胞培養
    注: HN4、各種細胞株、各種14患者から派生しました。
    1. ダルベッコ HN4 細胞 10% 牛胎児血清と抗生物質 (100 U/mL ペニシリンおよび 100 μ g/mL ストマイ) イーグル培 (DMEM、4.5 G/L グルコース) に変更。5% CO2と 37 ° C でセルを孵化させなさい。
  2. 細胞のトランスフェクション
    1. トランスフェクション、前日プレート 5 x 10 の5セル 2 mL/培地 6 ウェル プレートで抗生物質がないのです。
    2. 軽く 100 pmol CLIC4 siRNA または低下した血清中メディアの 250 μ L でスクランブル SiRNA を希釈します。低下した血清中メディアの 250 μ L で 5 μ L リポソーム試薬を希釈しインキュベートする 5 分結合試薬の希釈したリポソームと希釈した siRNA、優しく、ミックス、室温で 20 分間インキュベートします。
    3. よく細胞と培地を含む各混合物を追加します。ロッキング プレートを行ったり来たりで優しく混ぜます。次の Rh123 ラベル付けの手順に進む前に 24 h のための CO2インキュベーターで 37 ° C でセルを孵化させなさい。トランスフェクション後、正常な成長媒体 4 h で媒体を置き換えます。

2. Rh123 ラベル

注: Rh123 は HN4 セル1で MMP を測定するために利用されました。

  1. CLIC4 siRNA の治療 (セクション 1) 後、次の治療のため 6 ウェル プレートで HN4 セルを使用します。HN4 細胞それぞれの量も 10 倍 coverslips に実験を繰り返して十分であります。
  2. 新しい 12 ウェル プレートの下部に円形 coverslips するのにピンセットを使用します。プレートの番号は、実験的なデザイン (図 1A) に従って設定されます。
  3. 12 ウェル プレート内すべての coverslip の途中 100 μ g/mL ポリリジンの 150 μ L を入れ、2 分、coverslips 外ポリリジンをかけないように注意を払うを待ちます。Pipettor、ポリリジンを徹底的に削除 (図 1B)。
  4. 料理中 HN4 細胞の培養液を削除し、セルをデタッチする 1 mL 0.25% トリプシンを追加します。6 分後、トリプシンを中和するために培地 2 mL を追加します。優しく円形 coverslips 上の 10 の4セル 5 回とシード 2 6 х pipettor による HN4 細胞を混ぜます。5% CO2 (図 1C) 37 ° C の定温器に配置します。
  5. 8 時間培養後 2 µmol/l Rh123 37 ° C で 40 分間 HN4 細胞を孵化させなさい。培地 (図 1D) で Rh123 の均一な配分を確保するため中上下数回を優しく混ぜます。
  6. 準備十分な通常の生理食塩液 (高);ように (でモル/L) 高: 140 塩化ナトリウム、5 5 HEPES、10 グルコース 1 CaCl21 MgCl2KCl pH 7.4)。水お風呂で 37 ° C に予熱します。
  7. ピンセットを使用して、coverslips を削除し、残りを洗う液体を介して簡単に、coverslips を予熱した NPBS バッファー (図 1E) に配置します。
  8. 500 μ L のステンレス製チャンバーの下部に、coverslips に配置 (材料の表を参照してください) 交換可能な 25 mm ガラス coverslip 底の o リングを用いる場所で密封します。商工会議所 (図 1E) の蓋を締めで解決します。
  9. 450 μ L 組み立て室高バッファーを予熱し、蛍光顕微鏡や共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡 (図 1E) の視野下でお風呂を入れて追加します。

3. MMP の検出

  1. 一般的な蛍光顕微鏡
    1. 製造元の指示に従って蛍光顕微鏡を入れます。
      注: 一般的な蛍光顕微鏡で水銀ランプ光ファイバー光源、FITC フィルター Rh123 のセット完了しました (480/40 励起フィルター、505 の LP ダイクロイック ミラー、535/40 排出フィルター) 室温で。20 × 対物は、住セルイメージ投射を行うためだった。
    2. イメージング システム ソフトウェアを開き、新しい実験 (図 2A) を開始するコマンド バーから「新規」ボタンを選択します。
    3. 視野と白色のセルの場所を見つけるにフォーカスを調整します。
    4. ライトの電源を切り、白色光を閉じるボタンをプッシュします。コマンド バーから「フォーカス」ボタンをクリックし、「開始焦点」の蛍光に切り替えるを選択します。507 nm 励起と 529 nm ロングパス発光顕微鏡を介して再び細胞の場所を見つける波長 (実験前にセット)。(図 2B) を必要に応じて視野と焦点を再度調整します。
    5. 視野だけ 20 に 30 で区切られた HN4 セルを含むを選択します。各セルの細胞内の蛍光信号の変化が正確に記録されます。
    6. 明確な視野が達成されれば、フォーカス バーから「近い焦点」をクリックします。イメージの 1 つのセットを取得するコマンド バーから「Acq 1」をクリックしてします。コマンド バーから「地域」、測定領域を編集するのには「OK」ボタンをクリックしますします。
      注意: リージョンの編集バーから別の地域の図形は研究によって使用できます。
    7. 個々 のセルのさまざまな形状に合わせて、「トレース地域」ツールを選択して円の 1 つのセルの領域としたらダブルクリックします。までのすべてのセルの手順丸 (図 2C) を繰り返します。"Done"をクリックし、保存されている場所を検索する「画像を保存」を選択します。
    8. クリックして"Zeroclock"とすぐに蛍光強度の変化を監視を開始する f4 キーを押して。リアルタイム記録を一度すべて 5 蛍光強度の変更 5 分 (図 2D) s。
    9. ベースラインが安定になると、追加の 50 μ L 高 100 ミリ モル/l ATP pipettor 経由で室に 0.5 μ L で混合します。視覚的なフィールド (図 2E) を削除を避けるために商工会議所を触れないように覚えています。
      注: 20 分について蛍光画像を記録して、実験を手動操作で終了することができます。時間が 20 分間全体を観察するために日常的に決済される蛍光変化。しかし、プロセス全体の所要 20 分未満、曲線の安定性に影響を及ぼす予期せぬ要因、キャプチャを停止して手動操作が適用されます。
  2. 共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡
    1. 共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡の製造元の指示に従ってを有効にし、バンドルされたソフトウェアを開きます。
      注: ここでは、Rh123 は、488 に設定アルゴン レーザーによる興奮をしていた nm、出力される信号は、TD488/543/633 フィルターのアプリケーションを介して 545-700 nm の範囲にわたって記録されました。
    2. 63 X を選択するには、「取得」メニューの下で「客観的」をクリックして/1.4 オイル対物レンズ。標本を観察し、光のフィールドの下で明確な視野を見つけます。
    3. 蛍光モードに切り替え、顕微鏡を介して暗闇の下のセルの場所を見つけるために正しい蛍光フィルターを選択する「TL/IL」ボタンを押します。観測が終わったら、供試体を保護するために「シャッター」を押してください。
    4. 「取得」メニューの下適切な PMT チャンネルを調整し、「達成」(図 3A) 解決された光パスをアクティブにするをクリックします。「設定」メニューをクリックしてし、必要なレーザー種類を決定する「レーザー」を選択します。このプロトコル (図 3B) には「アルゴン」をお勧めします。
    5. "Live"のリアルタイム画像を取得し、視覚的なフィールドにのみ 20 に 30 で区切られた HN4 セルが含まれているかどうかを確認するをクリックします。各セルの細胞内の蛍光信号の変化が正確に記録されます。
    6. アクイジション ・ モードで「獲得」メニュー (図 3C) の下で「取得」サブメニューで「xyt」を選択します。それぞれ、時間間隔と期間、5 s と 20 分を設定してください。「適用」をクリックして"すべてのパラメーターが決済されます。
    7. 「数量」メニューの下には、サークルの各セルの記録領域に「ポリラインを描画」ツールを使用します。「行プロフィール」を選択し、観測を実施する「開始」を選択します。5 分 (図 3D ~ E) の蛍光強度のリアルタイムの変更を記録します。
    8. ベースラインが安定になると、追加の 50 μ L 高 100 ミリ モル/l ATP pipettor 経由で室に 0.5 μ L で混合します。視覚的なフィールドの削除を避けるために商工会議所を触れないように覚えています。
      注: 20 分について蛍光画像を記録する実験が完了し.

4. 統計解析

  1. 一般的な蛍光顕微鏡
    1. 日常的に次のオペレーターのマニュアル蛍光顕微鏡を入れます。イメージング システム ソフトウェアを開き、保存されている実験を開くにコマンド バーから「開く」ボタンを選択します。「コマンド バー」から「地域」、測定領域編集するには「OK」ボタンをクリックします。
    2. 「トレース領域」ツールを選択して円の 1 つのセルの領域としたらダブルクリックします。手順を繰り返して、すべてのセルが囲まれています。「完了」をクリックし、選択、"F4: 前方"蛍光強度を示すトレースを取得します。
    3. 完了すると、グラフの右下隅にある下矢印ボタン、「グラフ データの表示」(図 2F) をクリックします。[OK] を 2 回クリックし、データ処理ソフトウェアのインターフェイスを開くには、「ログ データ」ボタンを選択します。「ログ データ」をもう一度クリックし、スプレッドシートに表示される蛍光強度のリアルタイム変動の記録を見つけます。
      注: 各セルの MMP の変更された蛍光 ATP または TG (F1/F0) のアプリケーションの前に強度基準の比率として表示されます。各蛍光強度データ 20-30 セルの平均であった。Rh123 のデータは、平均 ± SE 2 グループから結果でテストした独立の両側t検定とP値として表示 < 0.05 は、統計的有意性として考慮されました。統計解析ソフトウェアは、この実験の統計分析に適用されました。
  2. 共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡
    1. 共焦点レーザー顕微鏡をオンにし、製造元の指示に従って、バンドルされたソフトウェアにログインします。
    2. 記録された実験を開くには「火」を選択します。
    3. 「数量」メニューの下の「プロファイル スタック」ツールを選択し、「チャンネル ・ ロワによって並べ替えグラフ」から「オールインワン」を選択
    4. 観察のため円のセル領域に「多角形描画」ツールを使用します。
    5. 「グラフ」メニューを選択して、マウス右ボタンをクリックしてし"excel にエクスポート"を選択蛍光強度の値をスプレッドシートに追加します。以下の分析は、通常の蛍光顕微鏡 (図 3F) と一致。

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結果

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本研究では、Rh123 は MMP を検出に適用されました。当初、HN4 細胞以下の蛍光染色実験培養。6 ウェル プレート (図 1A) の下部にピンセット使用された円形 coverslips。Coverslips が 5 分ポリリジンでコーティングした、pipettor (図 1B) 経由でのポリリジンの削除されます。その後、HN4 細胞トリプシン, 6 ウェル プレートの底に置かれた coverslips にシード.次に、Rh123 の適切な量を追加され、混合よく (図 1C D)。予熱した高洗浄後、coverslip の視聴室に組み立てられました。高の適切な量は、以下の実験 (図 1E) を追加さ...

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ディスカッション

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Cl−チャネルの内部環境の止血に欠かせない細胞増殖およびアポトーシス15,16で重要な役割を果たすとされています。したがって、さまざまな癌17より治療的なアプローチを見つけるための大きい必要性と意義はイオン チャネル標的介入とアポトーシスの関係を理解すること。ミトコンドリアは、セルの通常の生物学的状態を維持し、その機能は高度の膜透過性と膜電位に関連します。ミトコンドリア異常を感音性難聴、小脳失調症、認知症を含む神経学的症状、心血管疾患、ミオパチーに貢献する癌から離れて蓄積 neuropathological 調査に記載しています。、およびてんかん18,19。これらはすべてミトコンドリア絞った介入する臨床治療を改善するために研究に拍車をかけた。Rh123、ミトコンドリアをターゲットとした蛍光色素は、MMP を検出する普遍的な蛍光色素をプロ...

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞培養のため氏チャオ牙に感謝致します。この作品は中国の自然科学財団 (81371284 許可第 81570403 号); からの補助金によって支えられました。安徽省の自然科学基金 (許可番号 1408085MH158)。安徽省医科大学の優秀な若手研究者安徽省の大学の優秀な若い才能を支援するプログラム。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
HNSCC細胞ATCCCRL-3241
PolylysineThermo Fisher ScientificP4981
Specific siRNA for human CLIC4BiomicsNM_013943(アクセッション番号、NM_013943;cDNA配列に対応する
5-GCTGAAGGAGGACAAAGA-3)およびスクランブルsiRNA(5 ACGCGAACGCGGGAAUUU-3)を設計し、Biomics Company
から入手しましたリポフェクタミン2000トランスフェクション試薬 サーモフィッシャーサイエンティフィックL3000-015
Opti-MEM I 還元型血清培地、GlutaMAXサーモフィッシャーサイエンティフィック51985-042
ローダミン 123、フルオロピュア グレーデサーモフィッシャーサイエンティフィックR22420
ダルベッコ'smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose)Gibco11965-084
Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia OriginGibco10099141
Trypsin-EDTA SolutionBeyotimeC0201
Antibiotic-Antimycotic, 100XGibco15240062
Laser Scanning Confocal MicroscopyLeica Microsystems GmbHLEICA.SP5-DMI6000-DIC
ニコン エクリプス TE300 倒立顕微鏡ニコンN/A
メタフラワー, v7.5.0.0ユニバーサルイメージングコーポレーションN/A
ライカアプリケーションスイート, v2.6.0.7266ライカ マイクロシステムズ GmbHN/A
Microsoft office Excel 2007マイクロソフトN/A
シグマプロット 12.5Systat ソフトウェアN/A
Attofluor Cell ChamberThermo Fisher ScientificA7816

参考文献

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