遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌緊張せず遺伝子クローニングの生成

サマリー

遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌の世代の簡易・迅速かつ比較的安価な手法について述べる株;この手法は、様々 な種の遺伝子破壊系統の世代の適応可能性があります。

要約

特定遺伝子の機能解明のための典型的な方法は、野生型株および興味の遺伝子が崩壊したひずみの比較の表現型解析を含みます。適切な抗生物質耐性マーカー遺伝子を含む遺伝子破壊 DNA コンストラクトは細菌の遺伝子破壊株の生成に役立ちます。しかし、遺伝子クローンの手順を必要とする従来の工法は、複雑で時間のかかるプロトコルを伴います。ここでは、比較的簡易、迅速かつコスト効果の高いミュータンス連鎖球菌の遺伝子破壊法を説明します。2 段階核融合ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 中断構築および形質転換をエレクトロポレーションを生成する方式します。このメソッドは、PCR 以外の酵素反応を必要としませんし、また中断構築のデザインの面での柔軟性を提供しています。エレクトロポレーションの雇用は有能なセルの準備を容易に、変換効率を向上します。本法は、様々 な種の遺伝子破壊系統の世代の適応可能性があります。

概要

遺伝子機能解析は通常興味の特定の遺伝子が崩壊したひずみと野生型株の表現型の比較を行います。この遺伝子破壊法は、イチイ、哺乳類に細菌からの広い範囲で遺伝子機能解析のために利用されています。遺伝子破壊ひずみ; の生成に必要な遺伝子破壊コンストラクトとはこのデオキシリボ核酸 (DNA) の構築は上流と下流の並ぶターゲット遺伝子の領域を融合した抗生物質耐性マーカー遺伝子から成り、相同組換えによってゲノムに組み込まれています。遺伝子破壊ひずみは、抗生物質を含んでいる選択的なメディアを使用して分離することが。遺伝子破壊株の建設に使用される従来の方法ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR)、適切なプラスミドの制限の消化に遺伝子の結紮によるターゲット遺伝子の増幅などの複雑な手順が必要酵素、および抗生物質耐性マーカー遺伝子を挿入する桿菌。このプロセスは時間がかかり、各ステップの成功に応じて、数週間に数日を取るです。さらに、混乱の構造のデザインはターゲット遺伝子の制限酵素サイトに依存です。これらの問題を解決するには DNA の PCR によるスプライシング方法^1,2遺伝子破壊変異体キイロタマホコリカビ³と阻害の sp PCC6803⁴のデザインが報告されています。本研究では混乱の建設のため (融合 2 ステップ PCR を指定) 変更された PCR ベース法を活用、比較的簡易、迅速かつ安価な方法で遺伝子破壊の連鎖球菌株を生成する方法を開発しました。構築および形質転換をエレクトロポレーション。

PCR ゲノム DNA、抗生物質耐性マーカー遺伝子 PCR のテンプレートとして、4 つのペアを適切に必要な 2 段階核融合には、オリゴヌクレオチドのプライマーが設計されています。最初のステップ (1^st PCR)、ターゲット遺伝子、ターゲット 1 kb の並ぶ下流域の 1 kb の並ぶ上流域と抗生物質耐性マーカー遺伝子は PCR によって増幅されます。逆のプライマーの前方のプライマーは、増幅の上流と下流の 5' 領域には並ぶ領域、それぞれ、15 拠点マーカー遺伝子の両端に相補的なが含まれます。マーカー遺伝子増幅の前方および逆のプライマーの 5' 領域は同様に 15 拠点の標的遺伝子の上流の並ぶ領域の下端およびターゲット遺伝子の下流の並ぶ領域の上部の端に補足を含めるそれぞれ。したがって、3 つの増幅されたフラグメントは融合サイトで重複する 30 塩基対の領域を含みます。2 番目のステップ (2^nd PCR)、1^st PCR テンプレートとしてによって増幅される 3 つの断片を使用して入れ子になった、PCR のプライマーと PCR が行われます。テンプレートの相補的な領域はさらに、2^nd PCR によって互いにリンクされます。最後に、相同組換えの構造は、電気穿孔法による野生型株に導入です。成功した遺伝子破壊は、特異的プライマーを用いた PCR による検証可能性があります。中断構築は高忠実度 DNA ポリメラーゼを使用して増幅される DNA の ligation または DNA 消化など、追加の酵素反応は構成要素を生成する必要ありません。さらに、ゲノム上の削除または保存領域はプライマー デザインに応じて柔軟に選択されるかもしれない。

現在の仕事では、連鎖球菌種の迅速で簡単な遺伝子の中断方法を示すことミュータンス連鎖球菌グルコシルトランスフェラーゼをエンコード、 gtfC遺伝子のコーディングの地域の全体の削除を行った。さらに、 gtfB-破壊ひずみは、同じ方法で生成されました。GtfCとgtfBの両方でエンコードされた花色は、齲蝕原性歯科バイオ フィルム開発^5,6に貢献します。野生型のバイオ フィルム形成能力ひずみ (s.mutans WT) gtfC-ひずみ (, S. mutans ΔgtfC)、およびgtfBを中断-中断ひずみ (, S. mutans ΔgtfB) を評価しました。比較の表現型解析。このプロトコルは、追加種に遺伝子破壊の二段階法のアプリケーションを拡張し、幅広い分類群の遺伝子機能の研究の変更可能性があります。

プロトコル

1 プライマー デザイン

1. 遺伝子破壊の検証と融合 2 ステップ PCR のプライマーを準備します。
   。 注: 表 1 は、このプロトコルで使われるプライマー シーケンスを示しています。S. mutans Δ gtfC を生成するために使用 2 段フュージョン PCR 法の模式図を 図 1 に示します。
   1. スペクチノマイシン耐性遺伝子 (spc ^r) ⁷ をゲノムのターゲット領域の交換用プライマーを設計します。このプロトコルは spc ^r gtfC 遺伝子のコーディング領域の全体を置き換えます
   。
   2. には 5 に 15 拠点 spc ^r の上部と下部の両端に相補的なが含まれて ' を逆の地域とそれぞれのプライマーをダウン-フォワード。同様に、5 に 15 拠点 gtfC の上流の並ぶ領域の下端および gtfC の下流の並ぶ領域の上部の端に補足を含める ' spc ^r の地域-前方および spc ^r-プライマーをそれぞれ反転 ( 図 1 a).
      注: シーケンスを逆、ダウン-前方の spc ^r - 前方、および spc ^r - 逆プライマー、中断構築定款のサイトによって自動的に決まります
   。
   3. 設計を構成するまで進むと上下逆プライマー > 上流と下流に並ぶ gtfC 遺伝子の領域がそれぞれ 1 kb。最大フォワードの融解温度 (T _m) を設定し、ダウン前後を逆プライマーの溶ける温度に従ってプライマーをそれぞれ上下逆 ( 図 1 a).
      注: T _m を決定する次の数式を参照して: T _m (° C) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * NG) - 5、* N はプライマー ヌクレオチド (A、T、C、または G) 指定した id の数を表します
   。
   4. デザイン 2 ^nd PCR ( 図 1 b) の入り込まれたプライマー (N_up リバース N_up 前後).
      注: 最も外側のプライマー (アップ前方と上下逆) は、2 ^nd PCR のプライマーとして使用することがあります、ただし、入り込まれたプライマー (N_up リバース N_up 前後) はこのプロトコルで設計されました。入り込まれたプライマーが 2 ^nd PCR、代表結果 に示すとおりの頻繁に要求します
   。
   5. Spc ^r 特定設計プライマー。GtfC 混乱の画面にコロニー PCR のプライマーを使用します
   。
   6. GtfC の検証のための設計プライマー中断します
      。 注: これらのプライマーを使用して増幅される PCR の製品は、gtfC または spc ^r 上流または下流の並ぶ gtfC の領域との境界を跨ぐ。プライマー セット ' gtfC 最大フォワードと gtfC を逆 ' と ' gtfC ダウン-前方および gtfC ダウン逆 '、gtfC と ' gtfC 最大フォワードと spc ^r 2-逆 ' と ' spc ^r 2 前方および gtfC ダウン逆 ' spc ^r 固有です
   。

2。ゲノム DNA の抽出 , S. mutans

1. 連勝株式 s. 変異体 の UA159 脳心臓注入 (BHI) 寒天プレート上に。嫌気条件下 37 ° C で一晩プレートをインキュベートします
。
2. 滅菌つまようじを使用して単一コロニーをピックアップし、5 mL BHI ブイヨンに接種します。嫌気条件下 37 ° C で一晩 s. 変異体 の文化をインキュベートします
。
3. 2,000 × g. で 15 分間遠心する細菌の細胞培養は、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 5 mL の細胞ペレットを再懸濁します
。
4. 2,000 × g に 15 分間の遠心分離は、200 μ L の PBS で細胞ペレットを再懸濁します
。
5. 製造元によって提供される指示に従ってビード暴行ベース ゲノム DNA 抽出キットを使用して懸濁液からゲノム DNA を抽出します。
   1. 転送懸濁液 2.0 mL のサンプル チューブ ガラス ビーズ (キットに付属) を含みます。細胞懸濁液に溶解液 (キットに付属) の 750 μ L を追加します
   。
   2. は、しっかりとキャップし、ビーズの破壊装置のチューブ ホルダーでチューブを対称的に配置。5 分間最大速度で処理。スピン フィルター (キットに付属) 2.0 mL 管で 7,000 × g . で 1 分間遠心 10,000 × g に 1 分間遠心ビーズ殴られてサンプル転送清
   3. DNA 結合の追加 1,200 μ 濾液のバッファー (キットに付属)。2.0 mL 管および遠心 10,000 × g に 1 分間に 800 μ L の混合物 (キットに付属) スピン列を転送
   4. フローから破棄追加予備洗浄バッファー (キットに付属) を 200 μ l 添加スピン列を列行列を洗って、10,000 × g の流れを破棄に 1 分間遠心、スピンを 500 μ L の洗浄バッファー (キットに付属) を追加します。列に列行列を洗浄し、10,000 × g に 1 分間遠心
   5. スピン列を新しい 1.5 mL 遠心チューブに配置し、列のマトリックスに 100 μ L の溶出バッファー (キットに付属) を追加します
   。
   6. 30 の遠心分離機 s 10,000 × g ゲノム DNA を溶出します。260 で吸光度を測定することによって DNA 濃度・純度を推定 nm と 280 nmusing 分光光度計 A ₂₆₀/A ₂₈₀ 比が 1.8 より大きいことを確認します
   。

3。PCR 増幅

1. 1 ^st PCR テンプレート (表 1 参照) として s. 変異体 の WT ゲノムおよび合成 spc ^r 遺伝子を使用して PCR を実行します。GtfC 遺伝子の上流の並ぶ領域、gtfC 遺伝子のプライマーとして 1 ( 図 1 a)、上記の 3 つのセットを使用して spc ^r 遺伝子下流並ぶ領域を増幅します。表 2 および 表 3.
   注: PCR のプライマーおよび試薬、増幅サイクルが要約 表 1 表 2、および 表 3 にそれぞれします
。
2. 1% アガロースゲルの各 PCR の製品を分別し、ゲルのバンド カッターを使用して対応するバンドをです
。
3. 回転カラムとシリカ膜ベースのゲル抽出キットを使用してゲルから各増幅 DNA 製品を浄化します。
   1. 転送きれいな遠心にゲルのスライスはチューブし、500 μ L (キットに付属) バッファーをバインドのミックスします。ゲルのスライスを完全に溶解するまでに 55 ° C 15 分で混合物をインキュベートします
   。
   2. (キットに付属) コレクション チューブ (キットに付属) スピン列に配置、スピンの列にサンプルをロードし、30 の遠心分離機 11,000 × g で s。流れを破棄、シリカ膜を洗浄し、30 の遠心分離機回転カラムを洗浄バッファー (キットに付属) の 600 μ L を追加 11,000 × g で s.
   3. フロー ・ スルーとシリカ膜を乾燥する 11,000 × g で 2 分間遠心を破棄します
   。
   4. スピン列を新しい 1.5 mL 遠心チューブに配置、50 μ l 添加溶出バッファー (キットに付属)、2 分間室温でインキュベートして
   増幅された DNA を溶出する
   5. 11,000 で 2 分間遠心分離機 × g。260 で吸光度を測定することによって DNA 濃度・純度を推定 nm と 280 nmusing 分光光度計 A ₂₆₀/A ₂₈₀ 比が 1.8 より大きいことを確認します
   。
4. 実行、2 ^nd 2 段階核融合 表 2 に従って、PCR のテンプレートとして 3 つの約モルの断片を用いた PCR の PCR および 表 3.
   注: これらのフラグメント増幅された、ネストされたプライマーを使用して融着接続 ' N_up 進むと N_down リバース ' または最も外側のプライマー ' を前方と上下逆 ' ( 図 1 b)。PCR のプライマーおよび試薬、増幅サイクルはそれぞれ 表 1 表 2、および 表 3 に要約が
。
5. 0.8% の agarose のゲルの PCR 反応混合物 (5 μ L) の 10 分の 1 をロードし、適切な増幅 ( 図 1) の生成を確認する期待されるバンドのサイズの増幅バンドのサイズを比較します
。
6. 残り最終的な PCR の製品を精製することがなくエタノール沈殿物によって集中。
   1. 追加 55 μ L の超純粋な水 100 µL.Add に全体の音量を調整する残りの PCR の混合物 3 M 酢酸ナトリウム (10 μ L)、pH 5.2、100% エタノール (250 μ L) の 2.5 倍量の順の 10 分の 1 のボリューム。混合し、-80 で 30 分間凍結 ° C
   2. 4 ° C で 15,000 × g で 20 分間遠心管の底にペレットをチェック、上澄みを廃棄します。70% エタノール、4 ° C で 15,000 × g で 5 分間遠心の 1 mL にペレットを洗浄し、上澄みを廃棄します。約 30 分のペレットを風乾、10 μ L の超純水で溶解する
   。

4。有能なセルの準備および細胞形質転換

1. 連勝株式 s. 変異体 の UA159 BHI 寒天培地プレート上に。嫌気条件下 37 ° C で一晩プレートをインキュベートします
。
2. 滅菌つまようじを使用して単一コロニーをピックアップし、5 mL BHI ブイヨンに接種します。嫌気条件下 37 ° C で一晩 s. 変異体 の文化をインキュベートします
。
3. BHI スープ 50 mL に 2 mL の変異体米 の文化を転送し、600 の光学濃度 37 ° C で 6-8 時間インキュベート嫌気条件下で 0.2 0.4 nm (外径 ₆₀₀).
4. 4 ° C で 2,000 × g で 15 分の細胞を遠心分離機、上澄みを廃棄、40 mL の 10% グリセロールの 40 mL に続いて冷たい水で二回セルを洗浄しています
   。 注: 残留物質に影響を与える後続エレクトロポレーション
。
5. は、10% のグリセロールの細胞ペレットの付着を低減、パスツール ピペットと慎重に上清を吸引します。新鮮な 10% のグリセロールの 1 mL の細胞を再懸濁します、各 1.5 mL 遠心チューブに懸濁液の 50 μ L を分注、使用直前まで-80 ° C で保存します
。
6. は、冷たいの有能なセルのセクション 3 で説明した中断のコンストラクトの 5 μ L の 50 μ L 約数をミックスします。エレクトロポレーション キュベット (電極間の 0.2 cm 距離) の混合物に追加します。黄色ブドウ球菌 モードを採用 (1.8 kV、600 Ω、10 μ F、1 パルス) electroporate エレクトロポレーション装置の
。
7. エレクトロポレーションの直後に BHI ブイヨンの 500 μ L のセルを中断し、スペクチノマイシン含む BHI 寒天培地プレートに懸濁液の 50 μ L を追加します
   。 注: 余分な培養時間後電気穿孔法は必須ではありません。ただし、エレクトロポレーション後 1-2 時間インキュベーションは、変換効率が向上します
。
8. 嫌気条件下 37 ° C で 2-6 日のプレートをインキュベートします
   。 注: 上記のよう に, S. mutans Δ gtfB が構築されます。GtfB 遺伝子のコーディング領域の全体は , S. mutans Δ のエリスロマイシン耐性遺伝子 ⁸ に置き換えられます gtfB。各 , S. mutans 緊張は嫌気条件下 37 ° C で BHI ブイヨンで培養です
。

5。遺伝子破壊と記憶域の検証

1. ランダムなコロニーをピックアップし、コロニー の表 2 および 表 3 に従って PCR を実行する pcr にそれらを接種します。PCR のプライマーおよび試薬、増幅サイクルはそれぞれ 表 1 表 2、および 表 3 に要約が
。
2. Spc ^r を確認する 1% の agarose のゲルの PCR 反応混合物をロード-特定の DNA バンド
。
3. 嫌気条件下 37 ° C で 2 日間スープ滅菌つまようじとスペクチノマイシン含む BHI の 10 mL のサブカルチャーのセルを使用して肯定的なコロニーを拾う
。
4. , S. mutans Δ の生成を確認 gtfC。
   1. は、細胞懸濁液を均等に分割します。上記で説明した細胞からゲノム DNA を抽出 (ステップ 2.3。 2.5.5 に。)。表 2 および 表 3 に従って gtfC 中断 (表 1) の検証のためのプライマーを用いて PCR のテンプレートとしてゲノム DNA を PCR を実行します
      。 注: PCR のプライマー、試薬、および増幅サイクルのとおり 表 1 表 2、および 表 3 にそれぞれします
   。
   2. 2% の agarose のゲルの pcr を読み込み、適切な増幅 。 の生成を確認する期待されるバンドのサイズの増幅バンド サイズを比較
   3. 2,000 × g で 15 分の残りの細胞懸濁液を遠心分離機で 4 ° C は、5 mL の PBS で細胞ペレットを再懸濁します
   。
   4. 4 で 2,000 × g で 15 分間遠心する C. セル 25% グリセロールを含んで BHI ブイヨン 1.5 mL にペレットし、-80 ° Cor-20 ° C で保存を再懸濁します °

6。表現型解析

BHI 寒天培地プレート上に

1. 連勝各 変異体米 のひずみ。嫌気条件下 37 ° C で一晩プレートをインキュベートします
。
2. 滅菌つまようじを使用して単一コロニーをピックアップし、BHI ブイヨン適切な抗生物質の有無の 2 mL に接種します。嫌気条件下 37 ° C で一晩インキュベートします
。
3. ガラス試験管に抗生物質がない 1% や 5% のショ糖を含む BHI 培地 2 mL に一晩文化懸濁液 20 μ L を接種する; 試験管、嫌気条件下 37 ° C で一晩傾斜した位置の細胞の培養します
。
4. 渦ガラス試験管 10 s 文化懸濁液をデカントし、。3 回蒸溜水で試験管を洗います。0.25% クマシーブリリアント管壁にバイオ フィルムを染色する (CBB) を青し、し、1 分間インキュベートの 1 mL を追加
5. 染色液をデカント、3 回、蒸留水を試験管を洗うし、試験管をドライします
。
6. 色密度と、CBB 染色-バイオ フィルムの表現型解析におけるバイオ フィルム形成能の決定を視覚的に拡張機能を評価します
。

結果

図 2は 1^st PCR からそれぞれの製品のサイズを示す 1% の agarose のゲルの観察、良いと一致した予測サイズ約 1 kb の。図 3は、2^nd PCR の製品のゲルの電気泳動分析を示しています。図 4は、 , S. mutansコロニー破壊コンストラクトとコロニー PCR の製品のゲルの電気泳動分析変換を示しています。すべてのコロニーから amplicons 予測サイズであった。 PCR の製品のgtfC混乱とゲル電気泳動法の検証のためのプライマー結合部位を図 5に示します。GtfC -特定のプライマー セットを使用して増幅した PCR 産物は、 spc^r

ディスカッション

現在のプロトコルの上流と下流の並ぶゲノムのターゲット領域の領域に約 1 kb を増幅する 1^st PCR のためのプライマーを設計されなければなりません。このような長い並ぶシーケンスは相同組換えの効率を改善する必要があります。

プライマーのシーケンス (逆アップ、ダウン-フォワード、 spc^r-前方、およびspc^r-逆) このプロトコルで中断構築定款のサイトに基づいてが決定された自動的に。各プライマーには 15 拠点 5' 領域で 2^nd PCR テンプレートの終わりに補足が含まれます。長い結合部位破壊コンストラクトのより効率的な生産が可能にします。各プライマーの 5' 領域で少なくとも 10 相補的な塩基を含めることを推奨します⁹。

入り込まれたプライマー (N_up リバース N_up 前後) は、最も外側のプライマー (上下逆アップ前後) よりもむしろ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Streptococus mutans	研究室の株。		野生型(UA159株)
ゲノムDNA抽出キット	ザイモリサーチ	D6005
ビーズ鼓動破壊装置	タイテック	GM-01
合成遺伝子	ユーロフィン ゲノミクス	特注	クチノマイシン・エリスロマイシン耐性遺伝子
サーマルサイクラー	アステック	PC-708
PCRプライマー	ユーロフィン・ゲノミクス	カスタムオーダー	長さ35塩基
DNAポリメラーゼ	タカラ	R045A	ハイフィデリティDNAポリメラーゼ
ゲル抽出キット	日本ジェネティクス	FG-91202	アガロースゲルからのDNA抽出
ゲルバンドカッター	日本ジェネティクス	FG-830
分光光度計	ベックマン・コールター	DU800
エレクトロポレーター	Bio-rad	1652100
エレクトロポレーションキュベット	Bio-rad	1652086	0.2 cm gap
Anaeropack	三菱ガス化学	A-03	嫌気性培養システム
脳 心臓注入ブロス	Becton, Dickinson	237500	細菌培養培地
スペクチノマイシン	和光	195-11531	抗生物質
エリスロマイシン	和光	057-07151	抗生物質
糖	和光	和光 196-00015	バイオフィルム現像用
CBB R-250	和光	031-17922	バイオフィルム染色用